TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒顯色法-碧云天

1、TUNEL 細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒( (顯色法) )產(chǎn)品編號(hào)產(chǎn)品名稱(chēng)包裝C1098TUNEL 細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(顯色法)50 次產(chǎn)品簡(jiǎn)介：碧云天生產(chǎn)的顯色法 TUNEL 細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(Colorimetric TUNEL Apoptosis Assay Kit)為您提供了一種高靈敏度又快速 簡(jiǎn)便的細(xì)胞凋亡檢測(cè)方法。對(duì)于待檢測(cè)的細(xì)胞或組織樣品，經(jīng)過(guò)生物素標(biāo)記和后續(xù)的DAB 顯色等步驟，即可在普通光學(xué)顯微鏡下觀察到凋亡細(xì)胞。細(xì)胞在發(fā)生凋亡時(shí)，會(huì)激活一些 DNA 內(nèi)切酶，這些內(nèi)切酶會(huì)切斷核小體間的基因組 DNA。細(xì)胞凋亡時(shí)抽提 DNA 進(jìn)行電泳 檢測(cè)，可以發(fā)現(xiàn) 180-200bp 的 DNA l

2、adder?；蚪M DNA 斷裂時(shí)，暴露的 3-0H 可以在末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶(TerminalDeoxynucleotidyl Transferase, TdT)的催化下加上生物素(Biotin)標(biāo)記的 dUTP(Biotin-dUTP)，隨后和辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo) 記的Streptavidin (Streptavidin-HRP)結(jié)合，最后在 HRP 的催化下通過(guò) DAB 顯色來(lái)顯示凋亡細(xì)胞，從而可以通過(guò)普通光學(xué)顯 微鏡檢測(cè)到凋亡的細(xì)胞，這就是本試劑盒通過(guò)TUNEL( TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling)法檢測(cè)細(xì)胞凋亡的原理。本試劑盒有如下優(yōu)點(diǎn)。

3、(1)高靈敏度：可以在單細(xì)胞水平檢測(cè)到細(xì)胞凋亡，同時(shí)由于凋亡早期就有DNA 斷裂，可以檢測(cè)到早期的細(xì)胞凋亡。(2)特異性好：TUNEL 檢測(cè)時(shí)通常更容易標(biāo)記凋亡細(xì)胞，而不容易標(biāo)記壞死細(xì)胞。(3)快速：僅需約 2-3個(gè)小時(shí)即可完成。(4)應(yīng)用范圍廣：可以用于檢測(cè)冷凍或石蠟切片中的細(xì)胞凋亡情況，也可以檢測(cè)培養(yǎng)的貼壁細(xì)胞或懸浮 細(xì)胞的凋亡情況。TUNEL 法特異性檢測(cè)細(xì)胞凋亡時(shí)產(chǎn)生的DNA 斷裂，但不會(huì)檢測(cè)岀射線(xiàn)等誘導(dǎo)的DNA 斷裂(和細(xì)胞凋亡時(shí)的斷裂方式不同)。這樣一方面可以把凋亡和壞死區(qū)分開(kāi)，另一方面也不會(huì)把射線(xiàn)等誘導(dǎo)發(fā)生DNA 斷裂的非凋亡細(xì)胞判斷為凋亡細(xì)胞。極少數(shù)細(xì)胞凋亡時(shí)沒(méi)有 DNA 斷裂

4、，此時(shí)不適用 TUNEL 法檢測(cè)。在個(gè)別類(lèi)型的壞死細(xì)胞中也發(fā)現(xiàn)TUNEL 檢測(cè)呈陽(yáng)性。在需要嚴(yán)格判斷細(xì)胞凋亡的情況下，最好同時(shí)檢測(cè)多個(gè)凋亡指標(biāo)。本試劑盒足夠檢測(cè) 50 個(gè)樣品。包裝清單：產(chǎn)品編號(hào)產(chǎn)品名稱(chēng)包裝C1098-1TdT 酶100 卩1C1098-2Biot in-dUTP1.2ml/管，共 2 管C1098-3TdT 酶稀釋液(選用)1mlC1098-4Streptavidi n-HRP55dC1098-5Streptavidi n-HRP 稀釋液1.25ml/管，共 2 管C1098-6DAB 顯色液 A15mlC1098-7DAB 顯色液 B15mlC1098-8標(biāo)記反應(yīng)終止液15

5、ml說(shuō)明書(shū)1 份保存條件：-20C保存。DAB 顯色液 A 和 DAB 顯色液 B 需避光保存。注意事項(xiàng)：需自備用于洗滌細(xì)胞的 PBS 或 HBSS，用于封片的抗熒光淬滅封片液 (P0126)等適當(dāng)?shù)姆馄?，用于固定?4%多聚甲醛或 向碧云天訂購(gòu)免疫染色固定液 (P0098)，同時(shí)需自備含 0.1% Trit on X-100 的 PBS 或向碧云天訂購(gòu)免疫染色洗滌液(P0106)。 需自備過(guò)氧化氫，除石蠟切片外需自備甲醇。如果用于石蠟切片的檢測(cè)，需自備蛋白酶 K 和二甲苯。蛋白酶 K(ST533)可以向碧云天訂購(gòu)。為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。使用說(shuō)明：1.對(duì)于貼壁細(xì)胞

6、或細(xì)胞涂片：a.用 PBS 或 HBSS 洗滌 1 次。b.如果細(xì)胞貼得不牢，可以干燥樣品使細(xì)胞貼得更牢。C.用 4%多聚甲醛或碧云天生產(chǎn)的免疫染色固定液 (P0098)固定細(xì)胞 30-60 分鐘。d.用 PBS 或 HBSS 洗滌 1 次。e.加入含 0.1% Triton X-100 的 PBS 或碧云天生產(chǎn)的免疫染色洗滌液(P0106),冰浴孵育 2 分鐘。f.用 PBS 或 HBSS 洗滌 1 次。g.在用甲醇配制的 0.3%過(guò)氧化氫溶液(0.3% H2O2in Methanol)中室溫孵育 20 分鐘，以滅活切片內(nèi)源的過(guò)氧化物酶。隨后 用 PBS或 HBSS 洗滌 3 次。h.轉(zhuǎn)步驟

7、 5。2.對(duì)于懸浮細(xì)胞或細(xì)胞懸液：a.收集細(xì)胞(不超過(guò) 200 萬(wàn)細(xì)胞)，用 PBS 或 HBSS 洗滌 1 次。b.涂片，使細(xì)胞粘附在載玻片上?？梢愿稍飿悠肥辜?xì)胞貼得更牢，或使用適當(dāng)?shù)恼掣皆噭?。C.用 4%多聚甲醛或碧云天生產(chǎn)的免疫染色固定液 (P0098)固定細(xì)胞 30-60 分鐘。d.用 PBS 或 HBSS 洗滌 1 次。e.用含 0.1% Triton X-100 的 PBS 或碧云天生產(chǎn)的免疫染色洗滌液(P0106)，冰浴孵育 2 分鐘。f.用 PBS 或 HBSS 洗滌 1 次。g.在用甲醇配制的 0.3%過(guò)氧化氫溶液(0.3% H2O2in Methanol)中室溫孵育 20

8、分鐘，以滅活切片內(nèi)源的過(guò)氧化物酶。隨后 用 PBS或 HBSS 洗滌 3 次。h.轉(zhuǎn)步驟 5。3.對(duì)于石蠟切片：a.二甲苯中脫蠟 5-10 分鐘。換用新鮮的二甲苯，再脫蠟 5-10 分鐘。無(wú)水乙醇 5 分鐘。90%乙醇 2 分鐘。70%乙醇 2 分鐘，蒸 餾水 2 分鐘。b.滴加 20g/ml 不含 DNase 的蛋白酶 K，20-37C作用 15-30 分鐘(不同組織的最佳作用溫度和時(shí)間需自行摸索)。C.用 PBS 或 HBSS 洗滌 3 次。注意：這一步必須把蛋白酶 K 洗滌干凈，否則會(huì)嚴(yán)重干擾后續(xù)的標(biāo)記反應(yīng)。d.在用 PBS 配制的 3%過(guò)氧化氫溶液(3% H2O2in PBS)中室溫孵

9、育 10 分鐘，以滅活切片內(nèi)源的過(guò)氧化物酶。隨后用PBS 或HBSS 洗滌 3 次。注：請(qǐng)勿在用 PBS 配制的 3%過(guò)氧化氫溶液中孵育過(guò)長(zhǎng)時(shí)間，否則會(huì)岀現(xiàn)過(guò)氧化氫導(dǎo)致的DNA 斷裂，從而產(chǎn)生假陽(yáng)性。e.轉(zhuǎn)步驟 5。4.對(duì)于冷凍切片：a.用 4%多聚甲醛或碧云天生產(chǎn)的免疫染色固定液 (P0098)固定細(xì)胞 30-60 分鐘。b.用 PBS 或 HBSS 洗滌 2 次，每次 10 分鐘。c.加入含 0.1% Triton X-100 的 PBS 或碧云天生產(chǎn)的免疫染色洗滌液(P0106)，冰浴孵育 2 分鐘。d.在用甲醇配制的 0.3%過(guò)氧化氫溶液(0.3% H2O2in Methanol)中室

10、溫孵育 20 分鐘，以滅活切片內(nèi)源的過(guò)氧化物酶。隨后 用 PBS或 HBSS 洗滌 3 次。e.轉(zhuǎn)步驟 5。5.配制生物素標(biāo)記液：參考下表配制適量的生物素標(biāo)記液，需充分混勻。注意：配制好的生物素標(biāo)記液必須一次使用完畢，不宜凍存。1 個(gè)樣品5 個(gè)樣品10 個(gè)樣品TdT 酶2 口110 卩120 卩1Biot in-dUTP48 卩12401480 卩1生物素標(biāo)記液50 卩12501500 卩16.樣品的生物素標(biāo)記：a.在樣品上加 50 卩1生物素標(biāo)記液，37C孵育 60 分鐘。注意：孵育時(shí)需注意在周?chē)媒闼募埢蛩幟薜缺３譂駶?rùn)，以 盡量減少生物素標(biāo)記液的蒸發(fā)。b.用 PBS 或 HBSS 洗滌

11、 1 次，滴加 0.1-0.3ml 標(biāo)記反應(yīng)終止液，室溫孵育 10 分鐘。c.用 PBS 或 HBSS 洗滌 3 次。7.Streptavidin-HRP 工作液和 DAB 顯色液的配制：a.Streptavidi n-HRP 工作液的配制：參考下表配制適量的 Streptavidin-HRP 工作液，需充分混勻。注意：配制好的Streptavidin-HRP 工作液必須一次使用完畢，不宜凍存。1 個(gè)樣品5 個(gè)樣品10 個(gè)樣品Streptavidi n-HRP1 口15 卩110 卩1Streptavidi n-HRP 稀釋液49 卩12451490 卩1Streptavidi n-HRP 工

12、作液50 仏12501500 仏1b.DAB 顯色液的配制：按照每個(gè)樣品使用 0.2-0.5ml 顯色液的比例配制適量 DAB 顯色液。等體積混合適量 DAB 顯色液 A 和 DAB 顯色液 B，充 分混勻后即為 DAB 顯色液。注意：配制好的 DAB 顯色液必須一次使用完畢，不宜凍存。8.樣品的 DAB 顯色：a.在樣品上加 50 卩 IStreptavidin-HRP 工作液，室溫孵育 30 分鐘。注意：孵育時(shí)需注意在周?chē)媒闼募埢蛩幟薜缺３譂駶?rùn)，以盡量減少 Streptavidin-HRP 工作液的蒸發(fā)。b. 用 PBS 或 HBSS 洗滌 3 次。C.滴加 0.2-0.5mlDAB

13、 顯色液，室溫孵育 5-30 分鐘或根據(jù)顯色情況孵育適當(dāng)時(shí)間。注：如果顯色很強(qiáng)可以短于5 分鐘即停止顯色，如果顯色很弱，可以適當(dāng)延長(zhǎng)顯色時(shí)間，甚至顯色過(guò)夜。d.用 PBS 或 HBSS 洗滌 3 次。e.選做(本步驟可不做)：用蘇木素染色液(C0107)或甲基綠染色液(C0115)進(jìn)行細(xì)胞核染色。隨后用 PBS 或 HBSS 洗滌 3 次。f.直接進(jìn)行觀察，或用 95%乙醇脫水 5 分鐘，再用 100%乙醇脫水 2 次，每次約 3 分鐘，再用二甲苯透明 2 次，每次 5 分鐘, 隨后封片觀察。染色結(jié)果可參考下圖：小鼠卵巢切片 TUNEL 檢測(cè) DAB 顯色結(jié)果棕色為 TUNEL 染色陽(yáng)性的凋亡

14、細(xì)胞，藍(lán)色為被蘇木素染色的細(xì)胞核常見(jiàn)問(wèn)題:1.出現(xiàn)非特異性顯色。a.有些細(xì)胞或組織，例如平滑肌細(xì)胞或組織，n uclease 或 polymerase 的酶活性水平較高，易導(dǎo)致岀現(xiàn)非特異性的顯色。解決方法是，取細(xì)胞或組織后立即固定并且要充分固定，以阻止這些酶導(dǎo)致假陽(yáng)性。b.使用了不適當(dāng)?shù)墓潭ㄒ海缫恍┧嵝怨潭ㄒ?，?dǎo)致岀現(xiàn)假陽(yáng)性。建議采用推薦的固定液。c.TUNEL 檢測(cè)反應(yīng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，或 TUNEL 檢測(cè)反應(yīng)過(guò)程中反應(yīng)液滲漏，細(xì)胞或組織表面不能保持濕潤(rùn)，也可能岀現(xiàn)非特異性染色。注意控制反應(yīng)時(shí)間，并確保TUNEL 檢測(cè)反應(yīng)液能很好地覆蓋樣品。2.染色背景很高。a.支原體污染。請(qǐng)使用支原體染色檢測(cè)

15、試劑盒檢測(cè)是否為支原體污染。支原體染色檢測(cè)試劑盒(C0296)可以向碧云天訂購(gòu)。b.高速分裂和增殖的細(xì)胞，有時(shí)也會(huì)岀現(xiàn)細(xì)胞核中的DNA 斷裂。c.TUNEL 反應(yīng)過(guò)強(qiáng)?？梢杂迷噭┖刑峁┑腡dT 酶稀釋液稀釋 TdT 酶 2-5 倍后再按照說(shuō)明書(shū)操作。稀釋后的TdT 酶需當(dāng)日使用。d.細(xì)胞內(nèi)的過(guò)氧化物酶滅活不充分會(huì)導(dǎo)致很多細(xì)胞呈現(xiàn)陽(yáng)性染色，改進(jìn)過(guò)氧化物酶的滅活方法，例如延長(zhǎng)滅活時(shí)間等 會(huì)有所幫助。e.所使用的溶液有 DNA 酶污染。DNA 酶污染導(dǎo)致的隨即切割會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)生一定的背景并干擾檢測(cè)。把溶液高壓滅菌可以 有效滅活各種常見(jiàn) DNA 酶。3.標(biāo)記效率低。a.使用乙醇或甲醇固定會(huì)導(dǎo)致標(biāo)記的效率較

16、低。b.固定時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，導(dǎo)致交聯(lián)程度過(guò)高。此時(shí)宜減少固定時(shí)間。使用本產(chǎn)品的文獻(xiàn)：1. Zhang C, Wu R, Zhu H, Hu YZ, Jiang H, Lin NM, He QJ, Yang B.Enhanced anti-tumor activity by the combination of TRAIL/Apo-2L and combretastatin A-4 againsthuman colon cancer cells via induction of apoptosis in vitroand in vivo.Cancer Lett. 2011 Mar 1;302(1):1

17、1-9.2. Xu X, Gao X, Jin L, Bhadury PS, Yuan K, Hu D, Song B, Yang S.Antiproliferation and cell apoptosis inducing bioactivities of constituents from Dysosma versipellisin PC3 and Bcap-37 cell lines.Cell Div. 2011 Jun 15;6(1):14.3. Liu M, Yang S, Jin L, Hu D, Wu乙Yang S.Chemical Constituents of the Et

18、hyl Acetate Extract of Belamcanda chinensis (L.) DCRoots and Their Antitumor Activities.Molecules. 2012 May 24;17(5):6156-69.4. Peng YR, Ding YF, Wei YJ, Shu B, Li YB, Liu XD.Caudatin-2,6-dideoxy-3-O-methy-爐D-cymaropyranoside 1 induced apoptosis through caspase 3-dependent pathway in human hepatoma cell line SMMC7721.Phytother Res. 2011 May;25(5):631-7.5. Liu MC, Yang SJ, Jin LH, Hu DY , Xue W, Song BA, Yang S.Synthesis and cytotoxicity of novel ursolic acid derivatives containing an acyl