駱丹電子版PPT課件

1、 空白組1 UVA1 UVA組 8-MOP+UVA8-MOP+UVA組空白組 UVA 8-MOP+UVA UVA 8-MOP+UVA 8-MOP+UVA 第1頁/共25頁8-MOP+UVA組細胞出現(xiàn)了明顯的細胞衰老改變組細胞出現(xiàn)了明顯的細胞衰老改變: :胞漿中可見較多空泡，細胞核中可見較多胞漿中可見較多空泡，細胞核中可見較多絮狀物絮狀物, ,核仁不清晰，局部出現(xiàn)核膜內(nèi)褶核仁不清晰，局部出現(xiàn)核膜內(nèi)褶, ,核內(nèi)染色質(zhì)凝集且分布不均。線粒體腫脹、粗面核內(nèi)染色質(zhì)凝集且分布不均。線粒體腫脹、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴張內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴張, ,脫顆粒，可見較多次級溶酶體脫顆粒，可見較多次級溶酶體。 第2頁/共25頁光老化中紫外

2、線引起的基因的氧化應(yīng)激損傷，大部分情光老化中紫外線引起的基因的氧化應(yīng)激損傷，大部分情況下發(fā)生在鳥嘌呤殘基；端粒的重復(fù)序列況下發(fā)生在鳥嘌呤殘基；端粒的重復(fù)序列TTAGGG二二分之一是鳥嘌呤殘基且分之一是鳥嘌呤殘基且3 3末端也富含鳥嘌呤。末端也富含鳥嘌呤。第3頁/共25頁臨床上光療法（治銀屑病、臨床上光療法（治銀屑病、白癜風）的主要副作用之一是皮膚易出現(xiàn)光老化外觀白癜風）的主要副作用之一是皮膚易出現(xiàn)光老化外觀已聯(lián)合利用已聯(lián)合利用8-MOP+ UVA建立小鼠皮膚建立小鼠皮膚光老化模型，光老化模型， 在此基礎(chǔ)上利用人皮膚成纖維細胞經(jīng)相同處在此基礎(chǔ)上利用人皮膚成纖維細胞經(jīng)相同處理建立體外光老化模型理建

3、立體外光老化模型參與紫外線輻射引起的光老化？參與紫外線輻射引起的光老化？.光老化進程中光損傷是如何加快端?？s短的？光老化進程中光損傷是如何加快端?？s短的？第4頁/共25頁MTT法檢測法檢測細胞活性繪制細胞活性繪制細胞生長抑制細胞生長抑制曲線曲線流式細胞術(shù)流式細胞術(shù)檢測檢測細胞細胞周期分布周期分布透射電鏡透射電鏡觀察細胞觀察細胞超微結(jié)構(gòu)超微結(jié)構(gòu)細胞化學酶細胞化學酶法檢測法檢測-半半乳糖苷酶乳糖苷酶 處理后24h，48h, 72h, 7d分光光度法分光光度法檢測細胞內(nèi)檢測細胞內(nèi)氧化應(yīng)激損傷氧化應(yīng)激損傷水平水平 ：MDA,SOD及T-AOC免疫熒光檢測免疫熒光檢測細胞內(nèi)氧化細胞內(nèi)氧化光產(chǎn)物光產(chǎn)物8-

4、oxo-dGReal-Time PCR檢測端檢測端粒的相對長粒的相對長度：度：T/SWestern Blot檢測細胞老化檢測細胞老化相關(guān)蛋白相關(guān)蛋白P53, P21WAF-1及及 P16INK-4a 第5頁/共25頁 對照組對照組 8-MOP組組 UVA組組 8-MOP+UVA組組照光后照光后24h24h、48h48h、72h72h及及7d7d后后8-MOP+UVA聯(lián)合處理組聯(lián)合處理組SA-Gal陽性細胞比例較對照組均明顯增高（陽性細胞比例較對照組均明顯增高（* *P0.01P0.01），），且隨時間積累而逐漸增高（且隨時間積累而逐漸增高（r r=0.988)=0.988)。結(jié)論： 8-MOP

5、+UVA聯(lián)合作用可使皮膚FB出現(xiàn)光老化生物學特性改變SA-Gal第6頁/共25頁 *8-MOP+UVA組組8-oxo-dG陽性陽性細胞核比例明顯高于對照組細胞核比例明顯高于對照組（*P0.01 ）；UVA組組8-oxo-dG陽性細胞核比例也明顯陽性細胞核比例也明顯高于對照組高于對照組（*P0.05 ） 第7頁/共25頁8-MOP+UVA聯(lián)合處理組端粒相對長度明顯短于對照組聯(lián)合處理組端粒相對長度明顯短于對照組（2.570.05 vs 6.630.12，P0.01）UVA照射組照射組（4.590.07 vs 6.630.12, ）8-MOP+UVA聯(lián)合聯(lián)合處理組處理組（2.570.05 vs 4.

6、590.07）端粒相對長度端粒相對長度經(jīng)經(jīng)t t檢驗比較檢驗比較均均短于對照組（短于對照組（P0.05） *第8頁/共25頁各組老化相關(guān)蛋白表達水平比較 8-MOP+UVA聯(lián)合處理組聯(lián)合處理組P53, P21WAF-1 及及 P16INK-4a蛋白蛋白表達水平明顯高于對照組（表達水平明顯高于對照組（P P值均值均0.010.01），而），而UVAUVA輻射組相關(guān)輻射組相關(guān)蛋白水平也有明顯增高（蛋白水平也有明顯增高（P P值均值均0.050.05），），8-MOP+UVA聯(lián)合處聯(lián)合處理組及理組及UVA照射組兩組間經(jīng)照射組兩組間經(jīng)t t檢驗比較，前者相應(yīng)蛋白表達水檢驗比較，前者相應(yīng)蛋白表達水平均高

7、于后者（平均高于后者（P P值均值均0.050.05）。）。第9頁/共25頁在在UVA照射下，外源性光敏劑照射下，外源性光敏劑8-MOP使細胞的基因氧化應(yīng)激損使細胞的基因氧化應(yīng)激損傷顯著加重，產(chǎn)生大量氧化光產(chǎn)物傷顯著加重，產(chǎn)生大量氧化光產(chǎn)物8-oxo-dG ；oxodeoxyguanosine 8-MOP+UVA聯(lián)合作用后，細胞端粒結(jié)構(gòu)上由于較多氧化光產(chǎn)聯(lián)合作用后，細胞端粒結(jié)構(gòu)上由于較多氧化光產(chǎn)物的產(chǎn)生，使其端?？s加速，提前到達臨界長度；物的產(chǎn)生，使其端?？s加速，提前到達臨界長度； 8-MOP+UVA聯(lián)合作用后由于端粒縮短加速，提前激活聯(lián)合作用后由于端粒縮短加速，提前激活P53P53老老化檢查

8、點，并依次激活下游信號蛋白化檢查點，并依次激活下游信號蛋白- -細胞周期激酶抑制劑細胞周期激酶抑制劑P21WAF-1 及 P16INK-4a蛋白，相應(yīng)蛋白表達水平明顯增高；蛋白，相應(yīng)蛋白表達水平明顯增高； 綜上所述：綜上所述： 8-MOP+UVA聯(lián)合作用可導(dǎo)致基因的氧化應(yīng)激損聯(lián)合作用可導(dǎo)致基因的氧化應(yīng)激損傷，端粒受損嚴重，縮短加速，并激活老化相關(guān)蛋白表達。傷，端粒受損嚴重，縮短加速，并激活老化相關(guān)蛋白表達。第10頁/共25頁第11頁/共25頁 GS-Rg1各濃度干預(yù)組基因氧各濃度干預(yù)組基因氧化產(chǎn)物化產(chǎn)物8-oxo-dG及及SA-Gal陽陽性率均明顯低于光老化模型組性率均明顯低于光老化模型組（P

9、0.05）且與藥物劑量負相且與藥物劑量負相關(guān)關(guān)（r值依次為0.968, 0.943）。 *第12頁/共25頁各組細胞于照光后第各組細胞于照光后第7 7日端粒長度比較日端粒長度比較 GS-Rg1各濃度干預(yù)組端粒相對長度各濃度干預(yù)組端粒相對長度（2.570.05）明顯長于明顯長于8-MOP+UVA聯(lián)合處理組聯(lián)合處理組（6.630.12，P0.01），且各濃度組之間端粒相對長度與且各濃度組之間端粒相對長度與GS-Rg1GS-Rg1濃度有明顯的正相關(guān)，濃度有明顯的正相關(guān)，表現(xiàn)出一定的劑量依賴性表現(xiàn)出一定的劑量依賴性（P0.05） *第13頁/共25頁 照光后第7日老化相關(guān)蛋白表達水平 GS-Rg1各濃

10、度干預(yù)組老化相關(guān)蛋白各濃度干預(yù)組老化相關(guān)蛋白P53, P21WAF-1 及 P16INK-4a的表達的表達水平明顯低于水平明顯低于8-MOP+UVA組組（P P值均值均0.010.01），且各濃度組之間），且各濃度組之間蛋白表達水平與蛋白表達水平與GS-Rg1GS-Rg1藥物濃度有藥物濃度有明顯的負相關(guān)明顯的負相關(guān)(r1=0.981，r2=0.916，r3=0.914)。 第14頁/共25頁GS-Rg1預(yù)處理的人真皮成纖維細胞顯示出較強的氧化應(yīng)激耐預(yù)處理的人真皮成纖維細胞顯示出較強的氧化應(yīng)激耐受性，細胞內(nèi)基因氧化產(chǎn)物受性，細胞內(nèi)基因氧化產(chǎn)物8-oxo-dG產(chǎn)生明顯減少； GS-Rg1預(yù)處理的細

11、胞預(yù)處理的細胞端粒結(jié)構(gòu)中相應(yīng)堿基損傷較光老化模型端粒結(jié)構(gòu)中相應(yīng)堿基損傷較光老化模型組明顯減弱，端粒結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性加強，端?？s短減緩；組明顯減弱，端粒結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性加強，端?？s短減緩； GS-Rg1預(yù)處理的細胞預(yù)處理的細胞由于端粒縮短減緩，其對老化檢查點的由于端?？s短減緩，其對老化檢查點的激活受抑制，老化相關(guān)蛋白表達水平明顯降低；激活受抑制，老化相關(guān)蛋白表達水平明顯降低； 綜上所述：綜上所述：GS-Rg1預(yù)處理可阻止基因損傷后對細胞老化預(yù)處理可阻止基因損傷后對細胞老化P53檢查點的激活，抑制其后細胞周期激酶抑制劑檢查點的激活，抑制其后細胞周期激酶抑制劑P21WAF-1 及及 P16INK-4a的表達，減

12、弱兩者對細胞周期激酶的表達，減弱兩者對細胞周期激酶CDK的抑制作用，的抑制作用，使得使得CDK得以和核因子得以和核因子Rb蛋白結(jié)合，蛋白結(jié)合，Rb蛋白磷酸后促進細胞蛋白磷酸后促進細胞生長周期相關(guān)基因進行轉(zhuǎn)錄，使得細胞恢復(fù)分裂活性。生長周期相關(guān)基因進行轉(zhuǎn)錄，使得細胞恢復(fù)分裂活性。 第15頁/共25頁 第16頁/共25頁對照黃芩苷UVAUVA+黃芩苷01234#端粒長 度端粒長 度第17頁/共25頁對照黃芩苷UVAUVA+黃芩苷01234#p53對照黃芩苷UVAUVA+黃芩苷0.00.51.01.52.02.5#p16對照黃芩苷UVAUVA+黃芩苷0.00.51.01.5#c-mycp53p16c-myc第18頁/共25頁對照黃芩苷UVAUVA+黃芩苷02468#p16蛋白表達 水 平對照黃芩苷UVAUVA+黃芩苷0.00.51.01.5#c-myc蛋白表達 水 平第19頁/共25頁第20頁/共25頁“Tra