試劑條假陽和假陰現(xiàn)象出現(xiàn)的原因以及處理方法.

1、技術(shù)發(fā)展基于膠體金技術(shù)快速檢測(cè)試紙條的錯(cuò)誤信號(hào)的處理John Chandler,Nicola Robinson and Karen Whiting文liu_wei 戰(zhàn)友譯(聲明 :本文僅供丁香園戰(zhàn)友內(nèi)部交流使用 ,著作權(quán)屬原文作者。在近些年來 ,體外診斷產(chǎn)業(yè) (IVD 增加了巨大的投入來開發(fā)基于膜技術(shù)的快速檢 測(cè)試紙條。類似的的檢測(cè)已經(jīng)應(yīng)用在臨床和非臨床領(lǐng)域。在早期的論文中已有一篇 是關(guān)于這些方法得到廣泛應(yīng)用的綜述。雖然基于膜技術(shù)的快速檢測(cè)試紙條是相當(dāng)簡(jiǎn)單的 ,但是此方法的實(shí)行的效果依 賴于大量的關(guān)鍵參數(shù) ,在體外診斷技術(shù)的早期論文中已經(jīng)探討了金標(biāo)液 (gold conjugate的質(zhì)量和與膜

2、結(jié)合的蛋白捕捉的方式的重要性。此篇論文探討了導(dǎo)致產(chǎn)生假陽性和假陰性信號(hào)的錯(cuò)誤的檢測(cè)操作的可能原因 并且提供了一套解決此類問題和優(yōu)化檢測(cè)效能的系統(tǒng)方法。雖然此文章是有針對(duì)性 地說明了膠體金檢測(cè)技術(shù)中的相關(guān)問題 ,但是在膠乳檢測(cè)技術(shù)中也能發(fā)現(xiàn)類似的問 題。為了避免重復(fù) ,我們假定讀者熟悉快速檢測(cè)技術(shù)的機(jī)理和快速檢測(cè)試劑的基本 特性 尤其是抗體、金標(biāo)粒子、硝酸纖維素膜、結(jié)合墊、樣品墊和吸收墊并且熟悉檢測(cè)中用于處理不同試紙條和硝酸纖維素膜的各種化學(xué)試劑。對(duì)于不熟悉這 些概念的讀者 ,在其他文章里已經(jīng)對(duì)此進(jìn)行了詳細(xì)的解釋。假陽性結(jié)果和假陰性結(jié)果的特征假陽性結(jié)果是樣品中沒有待檢測(cè)物時(shí)在檢測(cè)帶上出現(xiàn)了一條彩

3、線 （對(duì)于金標(biāo)而 言是紅線。這條線可能在檢測(cè)的初期或在一段明顯的時(shí)間延遲之后出現(xiàn)。假陰性結(jié) 果是有可檢的陽性樣品時(shí)在抗體捕捉點(diǎn)上沒有出現(xiàn)一條可見的線。假信號(hào)可能在許多種樣品中發(fā)生 ,也可能僅僅發(fā)生在一種特定類型或來源的樣 品中。這個(gè)問題可能出現(xiàn)于一個(gè)單獨(dú)檢測(cè)批次的每個(gè)樣品 ,也可能僅僅發(fā)生于 一個(gè)樣品檢測(cè)中隨機(jī)數(shù)量的檢測(cè)帶。后一種情況說明了對(duì)于整個(gè)操作而言在進(jìn) 行下一步前進(jìn)行每個(gè)步驟時(shí)對(duì)大量檢測(cè)帶的處理的重要性。甚至在整個(gè)操作水平時(shí)從標(biāo)準(zhǔn)陰性樣品中也可能發(fā)現(xiàn)假陽性結(jié)果 ,同樣對(duì)于標(biāo) 準(zhǔn)陽性樣品亦是如此。由于批次檢測(cè)失敗后的巨大的成本損失 ,因此在進(jìn)行達(dá)到大 量產(chǎn)生前對(duì)假陽性和假陰性結(jié)果準(zhǔn)確判斷

4、和產(chǎn)生原因的了解是必要的。假陽性和假陰性信號(hào)的產(chǎn)生有許多不同的原因。這些信號(hào)可能由樣品或由檢測(cè) 技術(shù)本身的設(shè)計(jì)缺陷和操作不當(dāng)引起。我們可以通過在研制時(shí)的每個(gè)步驟進(jìn)行徹底 的、反復(fù)的大量的檢測(cè)裝置的試驗(yàn)可以消除產(chǎn)生假信號(hào)的潛在因素。當(dāng)進(jìn)行檢測(cè)時(shí) ,假陽性或假陰性結(jié)果產(chǎn)生的原因有時(shí)是由信號(hào)的觀測(cè)產(chǎn)生 ,也可 能由于流動(dòng)相的特征導(dǎo)致假信號(hào)的產(chǎn)生。然而 ,假信號(hào)出現(xiàn)的理由一般并不經(jīng)常是 顯而易見的。我們一般依賴于經(jīng)驗(yàn)、系統(tǒng)和科學(xué)的方法、詳細(xì)的故障排除預(yù)案可以 消除假信號(hào)的產(chǎn)生并且組織它們發(fā)生。在調(diào)整任何特異性參數(shù)之前 ,檢測(cè)技術(shù)的開 發(fā)者應(yīng)當(dāng)十分熟悉使檢測(cè)技術(shù)更為可靠的因素和可能引起錯(cuò)誤的因素。如果對(duì)

5、快速 檢測(cè)技術(shù)有了充分的理解 ,那么沒有必要采用經(jīng)驗(yàn)的方法。對(duì)于基于膜技術(shù)的快速檢測(cè)技術(shù)工作機(jī)理的詳細(xì)的描述和對(duì)于假陽性和假陰性 結(jié)果的詳細(xì)的故障排除操作手冊(cè)不在這個(gè)篇幅短小的論文討論范圍之內(nèi)。相反,此篇論文扼要講述了對(duì)引起這些問題的原因的典型特征并且主要說明了處理此類問題 的方法。假陽性產(chǎn)生的基本原因大多數(shù)假陽性信號(hào)出現(xiàn)的原因都是由于相似的問題 ,即在常規(guī)的結(jié)合步驟進(jìn)行時(shí)蛋白與膠體金顆粒特異性結(jié)合。在此過程進(jìn)行期間 ,蛋白質(zhì)被三種主要的力吸收在膠體金的表面上。 （見圖 1電荷引力 :膠體金顆粒帶有負(fù)電荷 ,這是由于在將氯金化鈉轉(zhuǎn)化為膠體金時(shí) ,使用 的還原劑 （經(jīng)常是檸檬酸鹽帶有的一層負(fù)電荷

6、被吸附在膠體金顆粒的表面。負(fù)電荷 將吸引帶有正電荷的蛋白圖 1 在抗體和一個(gè)膠體金顆粒之間的結(jié)合力并且足以使其靠近結(jié)合區(qū)的表面 ,這樣就有可能發(fā)生假陽性。低于等電點(diǎn)的蛋 白帶有正電荷 ,因此可能會(huì)與膠體金顆粒表面發(fā)生強(qiáng)烈的吸引作用。尤其是帶有富 含賴氨酸和精氨酸的蛋白區(qū)域在低于賴氨酸的等電點(diǎn) （pH10.4 和精氨酸的等電點(diǎn) （pH12.5 時(shí)會(huì)帶有大量的正電荷。疏水作用力 :一旦蛋白質(zhì)彼此十分接近 （之間的距離大約小于 1nm,蛋白質(zhì)的任何 疏水區(qū)很有可能與膠體金表面的疏水區(qū)接觸并且與之結(jié)合。因此富含非極性氨基酸（例如色氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸或苯丙氨酸的蛋白質(zhì)會(huì)與膠體金表面發(fā) 生強(qiáng)結(jié)

7、合作用。配位鍵結(jié)合力配位鍵結(jié)合力是所有吸引力中最強(qiáng)的結(jié)合力。含有大量富含硫的 氨基酸 （由于存在半胱氨酸和甲硫氨酸的蛋白質(zhì)強(qiáng)結(jié)合膠體金顆粒表面。這是由于 在金原子 （具有傳導(dǎo)帶電子的能力和硫原子 （帶有價(jià)電子之間的吸引力造成的。當(dāng)這三種結(jié)合力作用于金標(biāo)顆粒上 ,它們會(huì)產(chǎn)生如下所述的假陽性信號(hào)并且由 此而對(duì)檢測(cè)技術(shù)的效能產(chǎn)生不良的影響。在采用系統(tǒng)的方法來診斷和消除假陽性信號(hào)之前 ,了解大多數(shù) （并不是所有（圖 2 概要的描述了需要關(guān)注的主要 區(qū)域,而下面所描述的概括了大多數(shù)普通的 原因。然而 ,這些描述并不是一點(diǎn)也沒有遺 漏?？傮w上來說 ,所有可能產(chǎn)生假信號(hào)的原 因與金標(biāo)粒子、捕捉抗體、硝酸纖維

8、素膜 所加的化學(xué)試劑和樣品聯(lián)系在一起。通過對(duì)這些潛在緣此的充分理解 ,在檢測(cè)的操作過圖 2, 假陽性結(jié)果的主要來源程中可以根據(jù)這些特征而做出迅速的判斷。由于金標(biāo)粒子而產(chǎn)生的問題 :由于某種原因金標(biāo)粒子的表面由于沒有被蛋 白質(zhì)覆蓋而會(huì)部分裸露。在干燥金標(biāo)液或者在檢測(cè)過程中 ,或者在第一步中金 標(biāo)被涂得很少 ,這些都有可能導(dǎo)致抗體被去除。無論哪種原因 ,裸露的膠體金顆粒 將會(huì)被任何帶有正電荷的蛋白質(zhì)或硝化纖維素或尼龍膜所吸引。當(dāng)膠體金顆粒 通過捕捉線 ,由于距離非常小而物理接觸的可能性的非常大 ,這特別明顯。因此有 效地包被膠體金顆粒并且蛋白質(zhì)在儲(chǔ)存、處理或操作的過程中沒有脫落,這兩點(diǎn)是非常重要的

9、。除了膠體金顆粒對(duì)捕捉線的吸附外 ,標(biāo)記抗體本身可能在特定的操作條件下被 捕捉線吸附。這可能歸結(jié)于電荷或疏水作用力 ,也可能是由于在此過程中的酸性或 離子環(huán)境。過量的金標(biāo)粒子會(huì)產(chǎn)生幾個(gè)問題。首先 ,它能夠提高在捕捉線上假陽性信號(hào)的 可能性,或則是由于大量的金標(biāo)液通過這條線。其次 ,在檢測(cè)期后 ,它也會(huì)提高膠體金 標(biāo)粒子回流的可能性。一個(gè)好的品質(zhì)的金標(biāo)液不需要使用過量。膠體金顆粒也可能聚集成簇 ,一般來說有很多原因 ,通常是由于操作失誤所致。 膠體金簇如果多的話可能會(huì)堵塞膜孔。如果成簇的原因是由于膠體金的疏水作用力 形成的 ,那么在金標(biāo)液流動(dòng)的過程中膠體金顆粒也會(huì)粘附在捕捉抗體上。無論待測(cè)物是否

10、存在 ,金標(biāo)的抗體都可能會(huì)與捕捉抗體發(fā)生非特異性免疫反 應(yīng)。雖然在 ELISA 技術(shù)中在一對(duì)抗體之間發(fā)生類似的反應(yīng)可能不是經(jīng)常發(fā)生的 ,但 是這種方法會(huì)使硝酸纖維素膜上的標(biāo)記抗體與捕捉抗體非常接近 ,從而提高了發(fā)生 非特異性免疫反應(yīng)的可能性。另外 ,特別是在使用多克隆抗體時(shí) ,有可能會(huì)發(fā)生與樣 品中其它待測(cè)物的非特異性的反應(yīng) ,這種非特異性反應(yīng)的發(fā)生與否主要取決于使用 的抗體的純度。伴隨捕捉抗體而產(chǎn)生的假陽性信號(hào) :有許多因素可能會(huì)影響捕捉抗體發(fā)生非特 異性結(jié)合反應(yīng)。產(chǎn)生假陽性信號(hào)可以歸結(jié)于疏水作用力、非特異性免疫反應(yīng)、抗體 中的添加物、帶有大量的正電荷、在與膠體金顆粒吸附的捕捉抗體中富有高濃

11、度的 含硫氨基酸。在標(biāo)記過程中這些因素都會(huì)引起抗體與膠體金顆粒表面吸附并與其結(jié) 合。在實(shí)際的工作中 ,作用于捕捉抗體的這些因素會(huì)危及到快速檢測(cè)技術(shù)的效能。與固相支持物相關(guān)的問題硝酸纖維素膜非常脆并且在接觸時(shí)很容易受到破壞。 因此在撕開膜的過程中避免與膜發(fā)生任何可能的機(jī)械接觸是非常重要的。如果應(yīng)用 捕捉抗體時(shí)膜被壓制在捕捉抗體帶上 ,那么在樣品流動(dòng)過程中 ,會(huì)提高金標(biāo)粒子發(fā)生 非特異性反應(yīng)的可能性。兩個(gè)方面能夠使殘余的金顆粒附著在捕捉抗體帶上 金標(biāo)粒子在膜中的流速 太慢或者是膠體金墊釋放的速度富太慢。如果膜的孔徑太小或者在檢測(cè)帶上沒有足夠的活性物質(zhì) ,再就是硝酸纖維素膜與金標(biāo)液或與吸收墊的接觸不

12、良 ,那 么這些情況就會(huì)發(fā)生。此外 ,由于硝酸纖維素膜是疏水的 ,因此會(huì)阻礙金標(biāo)液順暢的 流動(dòng)。再加一句 ,有些樣品可能非常具有粘性的 （例如血清 ,這種因素也會(huì)使流速減 慢。當(dāng)檢測(cè)體系中沒有足夠的樣品或活性物質(zhì)來使金標(biāo)沿著檢測(cè)帶移動(dòng)時(shí),膠體金顆粒也會(huì)粘附在捕捉抗體帶上。如果花費(fèi)很多時(shí)間來觀測(cè)檢測(cè)結(jié)果 （通常是超過 15分鐘時(shí),膜就會(huì)變干 ,多余的 金標(biāo)粒子很有可能開始從吸收墊向干燥后膜回流。由于干燥后的捕捉抗體非常疏水 膠體金顆粒從吸收墊流向干燥后的捕捉抗體帶的可能性非常高?；瘜W(xué)試劑問題 :一些快速試紙條的廠家在有一個(gè)對(duì)硝酸纖維素膜進(jìn)行封閉的生 產(chǎn)環(huán)節(jié)。當(dāng)對(duì)特定的樣品進(jìn)行檢測(cè)時(shí) ,對(duì)硝酸纖維

13、素膜的封閉將膜從層析分離器 （吸 水的物質(zhì)轉(zhuǎn)變成非層析分離帶 （非吸水的物質(zhì)。這種設(shè)計(jì)是為了提高樣品和金標(biāo)粒 子在膜帶上的流速。然而,采用在蛋白液或表面活性劑溶液中浸泡后對(duì)膜的封閉也有可能洗掉任何 化學(xué)試劑 ,這些摻入進(jìn)去的化學(xué)試劑是廠家讓膜不至于變得完全干燥和疏水性。因 此 ,在干燥的狀態(tài)下這種封閉作用可能會(huì)讓膜具有更強(qiáng)的疏水性 ,因此甚至能在捕捉 抗體帶引起更為普遍的背景染色或假陽性信號(hào)。采用過量的蛋白或活性劑進(jìn)行封閉的方式都能夠在樣品流動(dòng)過程中產(chǎn)生高粘性 , 因此可能降低樣品清除率。用不恰當(dāng)?shù)姆磻?yīng)液進(jìn)行封閉也會(huì)改變捕捉抗體的特性 , 通過電荷作用力、疏水作用力或氫 硫作用力的提高會(huì)使其更

14、具有粘附性。封閉膜 應(yīng)當(dāng)進(jìn)京用于下面所述的理由 ,例如當(dāng)需要提高樣品或膠體金顆粒的流動(dòng)性 ,和僅僅 需要最低的反應(yīng)物濃度。一些保護(hù)劑 ,不論在捕捉抗體中的、標(biāo)記抗體中的或者是樣品中的都能產(chǎn)生假 陽性結(jié)果。硫柳汞 （含硫和汞的化合物和賴氨酸 （一般在 pH<10.4 下帶有大量的正電 荷在檢測(cè)中是特別要注意的問題。樣品的問題 :許多樣品中含有可能與金標(biāo)粒子或捕捉抗體發(fā)生非特異性結(jié)合的 物質(zhì) ,并且產(chǎn)生非特異性結(jié)果。舉例來說 ,一些含有細(xì)菌的樣品 ,而樣品中的細(xì)菌可能 被部分破壞成細(xì)胞碎片 ,并且這些細(xì)菌是非常疏水的。這些疏水的細(xì)菌碎片也可能 與捕捉抗體和金標(biāo)粒子發(fā)生交叉反應(yīng)。其它的一些樣品

15、可能含有高水平的硫或 SH 基團(tuán),或者具有高正電荷。此外 ,一 些樣品可能含有大量的分子或細(xì)胞分子 ,這有可能阻塞膜并且對(duì)檢測(cè)帶上的金標(biāo)液 的流動(dòng)產(chǎn)生干擾。樣品可能在酸性條件下變化非常大。例如 ,尿液樣品最初的 pH 值是在 47之間, 然而隨著細(xì)菌含量的增加 ,樣品的 pH 值也隨之降低。酸性樣品在流動(dòng)過程中在捕捉抗體表面產(chǎn)生正電荷 ,反過來這將引起與帶有負(fù)電荷的金標(biāo)粒子發(fā)生非特異性反 應(yīng)。如果樣品含有大量的酸性物質(zhì)或者帶有大量的正電荷蛋白質(zhì) ,它們?cè)诘竭_(dá)捕捉 抗體區(qū)之前可能與金標(biāo)粒子非特異性結(jié)合。這不僅能掩蓋待測(cè)物與金標(biāo)的結(jié)合信號(hào) （因此產(chǎn)生降低特異性信號(hào)效果 ,也能增加與在膜上和捕捉抗體

16、帶上成簇物質(zhì)的結(jié)合 物。對(duì)假陽性結(jié)果診斷的補(bǔ)救措施無論偶而還是重復(fù)出現(xiàn)假陽性結(jié)果 ,采用對(duì)于此類問題的診斷的一套系統(tǒng)的方 法也是為了實(shí)施最恰當(dāng)?shù)难a(bǔ)救措施 （見圖 3。最明顯的原因首先是被注意到的 ,主要 有金標(biāo)與捕捉抗體的反應(yīng) ;特異性電荷吸引力、疏水作用力和金 -硫結(jié)合力。然后應(yīng)當(dāng)注意在抗體、特殊樣品特性和跨膜流動(dòng)特性的非特異性交叉反應(yīng)。使 用對(duì)照能夠迅速地找到問題的根源。下面是系統(tǒng)的診斷方法的說明和前面所列的可能原因的參考。當(dāng)采用任何系統(tǒng) 的診斷方法時(shí) ,采用對(duì)照時(shí) ,只能改變一個(gè)參數(shù)。采取這種方式 ,可以采取排除法。下 面的問題可能會(huì)有些幫助 :1. 是電荷的原因嗎 ?檢測(cè)體系 pH 值

17、的變化 （pH511表明了正電荷是否存在和膠 體金顆粒與捕捉抗體是否結(jié)合。2. 是疏水作用力的原因嗎 ?這可能發(fā)生在固相中 ,捕捉抗體區(qū)或金標(biāo)區(qū)。改變體 系中活性劑濃度對(duì)于疏水作用是否是主要因素可以提供頭緒。3. 是金-SH吸引的原因嗎 ?最有可能發(fā)生在捕捉抗體帶和樣品浸入帶中的半胱 氨酸和精氨酸的基團(tuán)中。如下面部分的描述對(duì)這兩個(gè)區(qū)域的仔細(xì)檢查可以揭示出問 題的所在。圖 3 系統(tǒng)診斷假陽性信號(hào)的流程圖對(duì)于假陽性問題解決的系統(tǒng)方法對(duì)于快速檢測(cè)試紙條應(yīng)用的大多數(shù)檢測(cè)手段來說 ,一般只是采用一個(gè)測(cè)驗(yàn)條 （或 者是 “半條”。沒有必要選擇完全干燥的檢測(cè)條。在檢測(cè)的過程中 ,硝酸纖維素膜直 接被放置于含

18、有金標(biāo)液、樣品和化學(xué)藥品的微孔中 ,化學(xué)藥品正常被放在干燥箱里。以這種方式 ,可以迅速簡(jiǎn)便地進(jìn)行幾種檢測(cè) ,并且不需要全裝配 裝置和干燥箱。然而 ,如果由于干燥步驟而引起許多問題 ,那么在檢測(cè)之前必須進(jìn)行 完全裝配。這些關(guān)于系統(tǒng)方法的問題可以被劃為下面與檢測(cè)裝置和元件相關(guān)的五個(gè)目錄中。產(chǎn)生的問題是與金標(biāo)液相關(guān)嗎 ?這個(gè)問題很好解決 ,換一種金標(biāo)液就可以了 舉例來說 ,在相同濃度和相同的 pH值下用 BSA-gold 替換最初的金標(biāo)液。如果問題 還是沒有消除 ,那么最為可能的原因是所帶的電荷效應(yīng)。如果換了金標(biāo)液后不再產(chǎn) 生假信號(hào) ,那么問題產(chǎn)生的原因最可能是最初的金標(biāo)液的問題或者是標(biāo)記抗體的問

19、題。在這里其他的對(duì)照是相似的金標(biāo)液和含有單克隆抗體和多克隆抗體的金標(biāo)液。 在市場(chǎng)上也有可用于此類檢測(cè)的許多金標(biāo)液。下面是一個(gè)由于金標(biāo)液而產(chǎn)生的假陽性信號(hào)的例子。應(yīng)用的是針對(duì)于臨床樣品 （血清檢測(cè)傳染性疾病的檢測(cè)條。在所有的非陽性樣品中都看到了假陽性結(jié)果。當(dāng) 使用 BSA-gold 金標(biāo)液后 ,假陽性信號(hào)消失了。而使用了另一種非特異性金標(biāo)液后 , 假陽性信號(hào)也消失了。然而 ,當(dāng)更換了非臨床對(duì)照樣品 ,PBS在 pH7.2 下,使用特異性 金標(biāo)液假陽性信號(hào)仍然存在 ,在使用其它的金標(biāo)液則沒有假陽性信號(hào)。改變緩沖液 的 pH 值為 10 后,減少了假陽性信號(hào)的發(fā)生 ,但是并沒有消除假陽性信號(hào)。因此我

20、們 可以得出結(jié)論 ,問題的產(chǎn)生與樣品或捕捉抗體無關(guān) ,而是與對(duì)捕捉抗體席一行的高靈 敏度的金標(biāo)液。這些金標(biāo)很可能含有裸金顆粒 ,這可能與捕捉抗體發(fā)生結(jié)合。使用 新的金標(biāo)液并且小心制備金標(biāo)可以消除假陽性信號(hào)。是捕捉抗體的原因嗎 ?在這種情況下使用的對(duì)照是相似的捕捉抗體或其它種類 的抗體。然而在使用這些對(duì)照前 ,剝?nèi)?BSA 捕捉蛋白可以說明是不是其它地方產(chǎn)生 的問題。也有可能不是由于抗體本身而產(chǎn)生假陽性信號(hào) ,而是由于在抗體中的一些 保護(hù)劑的原因。在這種情況下 ,在適宜的緩沖液 （例如 10mmol PO4 中進(jìn)行透析可以 改善情況。如果用了其它的抗體假陽性信號(hào)消失了 ,那么顯而易見是特異性捕捉

21、抗 體引起了假陽性信號(hào) ,采取的措施是更換抗體或者清除它。舉個(gè)例子 ,在實(shí)際操作中 , 兔的單克隆抗體有時(shí)會(huì)產(chǎn)生這種情況 ,這主要是由于疏水力的作用 ,需要采用特別的 方法來處理。檢測(cè)尿中的 ?hCG 的妊娠試驗(yàn)中對(duì)于所有樣品都發(fā)現(xiàn)假陽性信號(hào) ,無論這些樣 品本身是陽性還是非陽性。改變 pH 值沒有消弱信號(hào) ,更換金標(biāo)液也沒有作用。甚至 在使用 PBS 緩沖液對(duì)照樣品也沒有消除信號(hào)。問題很可能是由于捕捉抗體引起的。剝?nèi)ゲ蹲娇贵w帶用 BSA 代替后所有的信 號(hào)都消除了。在 10mmol的 PO4中透析最初的捕捉抗體后 ,最終的結(jié)果符合樣品的 實(shí)際情況。綜合以上情況 ,我們可以得出結(jié)論 :這些抗體

22、曾經(jīng)懸浮于含有 SH 成分的 緩沖液 （譬如硫柳汞中 ,我們要消除或者避免這些因素。是膜的問題嗎 ?任何檢測(cè)帶的開發(fā)中最重要的過程是選擇合適的膜。有些膜與 其它的膜相比而言可能只適于特定類型的檢測(cè)或者只適合于特定的樣品。開發(fā)商應(yīng) 當(dāng)有所有廠家的各種膜并且有各種孔徑的膜 ,這樣才能做出迅速的比較。舉例來說 , 在干燥的過程中膜的疏水性是顯而易見的 ,因此我們可以清楚的知道這批次的膜會(huì) 產(chǎn)生隨機(jī)的假陽性信號(hào)。在選擇快速檢測(cè)技術(shù)所用的膜時(shí)不僅應(yīng)當(dāng)考慮到所要求的流速和蛋白結(jié)合特性 而且要考慮到在制備過程中膜的均質(zhì)性。在這里需要用的對(duì)照是不同孔徑和不同來 源的膜 ,還有就是同一批次的膜的不同區(qū)域。對(duì)于設(shè)

23、計(jì) H.pylori 的檢測(cè)抗體的血清學(xué)試驗(yàn) ,最初的試驗(yàn)的開發(fā)的目的是在實(shí) 驗(yàn)室設(shè)計(jì)階段時(shí)不會(huì)產(chǎn)生假陽性或假陰性結(jié)果。只有進(jìn)行全部測(cè)試合格后決定檢測(cè) 技術(shù)可以轉(zhuǎn)移到生產(chǎn)設(shè)計(jì)階段。當(dāng)成比例擴(kuò)大至幾千個(gè)裝置來進(jìn)行檢測(cè)條的組裝過程時(shí) ,無論如何 ,我們都應(yīng)當(dāng) 在每一批次的生產(chǎn)過程都要記錄很多隨機(jī)產(chǎn)生的假陽性結(jié)果。調(diào)整 pH 值、使用另 一種金標(biāo)液和對(duì)捕捉抗體進(jìn)行兩次檢查都不能立即揭示假陽性產(chǎn)生的原因。重新在 小規(guī)模的實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)階段進(jìn)行測(cè)試 ,由于假陽性結(jié)果的產(chǎn)生是在無 c 帶時(shí)發(fā)生的 ,因 此可以說明假陽性結(jié)果產(chǎn)生的原因是由于硝酸纖維素膜。對(duì)于實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)研究 ,只是用了小批次的膜。這么小的量的結(jié)果

24、并不能說明是 否符合大規(guī)模的生產(chǎn)。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了大批次的膜有明顯的疏水區(qū)（例如 ,沒有正常濕潤的區(qū)域 ,這些疏水區(qū)會(huì)引起膠體金顆粒與捕捉抗體發(fā)生非特異性結(jié)合。是化學(xué)藥品的原因嗎 ?在快速檢測(cè)帶的組裝過程中 ,金標(biāo)液和固相支持物 （膜、 結(jié)合墊或樣品墊可能用化學(xué)試劑預(yù)先處理過。所加的化學(xué)試劑可以包括鹽、活性 劑、蛋白質(zhì)、糖和聚合物。一些化學(xué)物質(zhì)能夠提高假陽性的幾率。在針對(duì)血清中動(dòng)物蛋白的研究用的檢測(cè)帶的開發(fā)中 ,會(huì)發(fā)生一些假陽性結(jié)果。 在實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)階段 ,在應(yīng)用檢測(cè)帶之前 ,通過向血清樣品和金標(biāo)液中加入制備緩沖液 后,然后再將檢測(cè)帶浸漬在微孔里來開始進(jìn)行檢測(cè)。更換金標(biāo)液沒有效果。改變緩 沖液的酸度并

25、沒有影響到結(jié)果。再換捕捉抗體也沒有消除隨機(jī)發(fā)生假陽性結(jié)果。此時(shí)用非陽性血清樣品 ,在浸漬與血清樣品之前 ,只有當(dāng)緩沖液已經(jīng)加入到血清 樣品幾分鐘后 ,才會(huì)觀察到假陽性結(jié)果的出現(xiàn)。緩沖液中含有 5%的強(qiáng)活性劑。降低 活性劑的濃度至 1%后,然后讓血清和膠體金顆粒與緩沖液混合幾個(gè)小時(shí) ,此時(shí)沒有 觀察到任何假陽性結(jié)果。這說明了過量的活性劑會(huì)強(qiáng)作用膠體金顆粒,會(huì)去除顆粒表面的抗體并且產(chǎn)生裸金顆粒 ,從而使其與捕捉抗體互相作用。是樣品的原因嗎 ?由于酸度、樣品污染、或孕尿翳含量等諸如此類的因素的變 化 ,正如前所述 ,樣品能夠引起不可預(yù)知的假陽性信號(hào)。為了確定是否是樣品的原因 需要檢測(cè)很多不同的樣品

26、,其中包括類似的樣品 ,也包括不同來源的樣品。除了樣品 的生物物質(zhì)量或有機(jī)物量外 ,問題也可能存在于所使用的緩沖液。如果是這個(gè)原因 , 需要用另一種緩沖液作對(duì)照。最簡(jiǎn)單調(diào)整的方式是改變樣品的酸度,這種方法可以很快確定是否是樣品中電荷吸引力的作用而產(chǎn)生的問題。也可能需要對(duì)樣品進(jìn)行過 濾 ,過濾得步驟可以獨(dú)立于檢測(cè)程序 ,也可以作為檢測(cè)步驟的一部分而使用。在生產(chǎn)開發(fā)中采用針對(duì)于尿液中激素的快速檢測(cè)技術(shù)對(duì)大量不同的尿液樣品進(jìn) 行檢測(cè),其特異性可以達(dá)到 97%,而其靈敏度可以達(dá)到 98%。然而 ,在以后的測(cè)試階段 發(fā)現(xiàn)從儲(chǔ)藏的樣品中發(fā)現(xiàn)幾例假陽性結(jié)果。在對(duì)這些樣品的酸度的測(cè)量后發(fā)現(xiàn)酸度有所提高 ,但是

27、經(jīng)過等酸度水平的對(duì)照緩沖液樣品檢測(cè)后可以排除酸度的影響。當(dāng)對(duì)尿液樣品進(jìn)行過濾后沒有產(chǎn)生假陽性 結(jié)果。然后進(jìn)行顯微鏡觀察后發(fā)現(xiàn)樣品的細(xì)菌污染是產(chǎn)生假陽性的主要原因。這樣 ,我們可以得出結(jié)論細(xì)菌含量的增加會(huì)提高樣品的疏水性 ,這會(huì)引起膠體金 顆粒和捕捉抗體的非特異性作用。新鮮的樣品不會(huì)產(chǎn)生類似的問題。假陰性產(chǎn)生的原因丁香園免疫學(xué)技術(shù)討論版 IVDT 文獻(xiàn)翻譯活動(dòng)文獻(xiàn)集錦之十 與假陽性信號(hào)診 斷流程圖的制作相比， 制作引起假陰性信號(hào)的診斷流程圖需 要考慮更多的因素， 這超出了本文的范圍。這主要是因?yàn)檠芯空叱３Ｔ谄鹗紩r(shí)沒 有可見的信號(hào)的一無 所知的情況下工作的。 解決此類問題的方法也依賴于對(duì)照線 的出

28、現(xiàn)或不出現(xiàn)，然 后樣品和金標(biāo)液沿著膜帶流動(dòng)。表 I 概括了假陰性信號(hào)產(chǎn)生 的大多數(shù)可能的原 因。 表 1 一些產(chǎn)生假陰性的典型原因 檢測(cè)區(qū) 原因 抗體丟失和抗體競(jìng)爭(zhēng) 金顆粒表 面抗體的疏水 作用力的破壞 抗體的水解 沒有結(jié)合捕捉抗體 抗體的疏水作用的破壞 抗體中過量的鹽對(duì)膠體 捕捉抗體無效 金顆粒的抗性 對(duì)抗體的疏水性 抗體不純 夠 標(biāo)記的破壞 標(biāo)記不充分；標(biāo)記時(shí)糖的量不 夠 干燥不充分；不是在干燥條件 下儲(chǔ)存 膜過高；抗體中活性劑作用 抗體疏水性高；膜沒有封閉 鹽的疏水作用 儲(chǔ)存條件不 好（潮濕） 過量的非特異性蛋白掩蓋了特 異性抗體 標(biāo)記墊的疏水性 膜的疏水性 標(biāo)記物的釋放不好 糖的結(jié)晶作

29、用 標(biāo)記墊于膜接觸不好 樣品太粘 膜的效能不好 流 速太快 金顆粒阻塞膜 標(biāo)記墊中物質(zhì)的原因；在標(biāo)記 物中糖量不夠 活性劑不夠；膜 的原因或者膜 過于干燥 儲(chǔ)存中過于潮濕 壓得不夠；活性劑不夠；樣品 量不夠 膜 孔徑太?。粯悠沸枰^濾 膜孔徑太大 膜的疏水性；活性劑不夠 說明 標(biāo)記不充分； 標(biāo)記時(shí)糖的量不 如同假陽性的診斷過程，也有特定的癥狀幫助我們?cè)\斷假陰性結(jié) 果。逐步找 出最可能的原因能夠?qū)栴}進(jìn)行分析并且作出改善。 有人已經(jīng)對(duì)類似 的系統(tǒng)診斷 方法進(jìn)行的整理。 本篇文章主要是對(duì)絕大多數(shù)陽性樣品中偶然產(chǎn)生的 假陰性結(jié)果 進(jìn)行詳細(xì)的分析。如果在陽性臨床樣品中所有的檢測(cè)帶都產(chǎn)生假陰性 結(jié)果，那

30、么 可能是檢測(cè)帶的設(shè)計(jì)的問題。 11丁香園免疫學(xué)技術(shù)討論版 IVDT 文獻(xiàn)翻譯活動(dòng)文獻(xiàn)集錦之十 圖 4 中概要地說 明了假陰性結(jié)果產(chǎn)生的最 為常見的原因。 假陰性產(chǎn)生的原因大多是捕 捉抗體和金 標(biāo)液， 但是也可能是由于檢測(cè)體 系中膜的流動(dòng)性不好（流速太快或太慢）、 金顆 粒的釋放不充分、 鹽量不足引起的， 或 者是由于體系中酸度不適宜造成的。另 外， 需要對(duì)樣品進(jìn)行處理才能讓抗體與抗原結(jié) 合，或者需要對(duì)樣品進(jìn)行稀釋以避 免 hook 效應(yīng)， 或者通過改變樣品成分掩蓋一些特殊 的抗原。 捕捉抗體在儲(chǔ)存的 過程中時(shí)常變得不 穩(wěn)定并且會(huì)失去特異性活性， 可能是由于水 解作用（潮濕環(huán)境 和干燥不充分），也可能 是由于的疏水作用力的破壞（見圖 5）。后 者可能是抗 體自身的特性， 通過更換抗體或 撕掉捕捉抗體層后用活性劑處理膜可以解 決這個(gè) 問題。 抗體或金標(biāo)液潛在的不穩(wěn)定性 要說明了檢測(cè)應(yīng)當(dāng)在可控的干燥環(huán)境的條 件 下進(jìn)行。 假陰性結(jié)果的產(chǎn)生常常是由樣品與金 標(biāo)的原因，或者是膜帶的流動(dòng)性的 原因。很多的因素能夠?qū)е骂愃频默F(xiàn)象。這其 中包括樣品的量不足、金標(biāo)液或樣 品墊上糖量不足、標(biāo)記墊和膜的結(jié)合不緊密或 者是標(biāo)記墊的材料不適合。這些樣 品可以通過用沒有 C 帶（總是陽性）的檢測(cè)條