干細(xì)胞成骨、成脂、成軟骨誘導(dǎo)分化及檢測(cè)

1、三個(gè)方向誘導(dǎo)分化誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成軟骨分化一、誘導(dǎo)方法將細(xì)胞懸液置于 50 mL聚苯乙烯培養(yǎng)瓶(Nunclon)中培養(yǎng)。完全培養(yǎng)基中加入能誘導(dǎo)MSCs 向軟骨細(xì)胞轉(zhuǎn)化的誘導(dǎo)因子: (一致統(tǒng)一的誘導(dǎo)物質(zhì))轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子1 10ng/ml,（左旋）維生素 C 50 mg/L(也有0.1mmol/L)地塞米松 0.1nmol/L （也有10 nmol/L）ITS 50mg/ml丙酮酸鈉 1mmol/L亞油酸 5.35ug/mg牛血清白蛋白 1.25ng/ml。倒置顯微鏡逐日（13 weeks）觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況。細(xì)胞長(zhǎng)成單層后進(jìn)行傳代。細(xì)胞培養(yǎng)3周。去除培養(yǎng)液,晾干,細(xì)胞用通用型膠原檢測(cè)試劑盒(晶美

2、生物工程有限公司) 免疫組化，按試劑盒說明書操作；用alcian blue 孵育5 min, 流水沖洗2 min ,麥?zhǔn)咸K木素復(fù)染5 min ,流水沖洗2 min ,晾干，顯微鏡下觀察細(xì)胞的蛋白聚糖沉積。或者用甲苯胺藍(lán)染色，具體我也沒做過，查到一篇文章中是這么說的：MSC成軟骨誘導(dǎo)后的甲苯胺藍(lán)染色檢測(cè)：培養(yǎng)不同時(shí)間的MSC培養(yǎng)皿倒掉誘導(dǎo)培養(yǎng)液，10甲醛固定lh，自來水沖洗15min，雙蒸水沖洗1次，滴加1甲苯胺藍(lán)染液于培養(yǎng)皿內(nèi)，染色3h，加人95乙醇，洗去多余的染液，烘干，中性樹膠封片。誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨方向分化成骨誘導(dǎo)培養(yǎng): 取第 3代細(xì)胞, 接種入含體積分?jǐn)?shù)為 0.1 的新生牛血清

3、、0.1 mol/L 地 塞 米 松 、50 mol/L 抗 壞 血酸 、10 mmol/L - 甘 油 磷 酸 鈉 的 高 糖 DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行成骨誘導(dǎo)培養(yǎng), 進(jìn)行形態(tài)觀察、功能檢測(cè)。間充質(zhì)干細(xì)胞成骨特性檢測(cè): 堿性磷酸酶組織化學(xué)染色: 取成骨誘導(dǎo) 14 d 的細(xì) 胞 , 40 g/L 中 性 甲 醛 固 定 15 min, Gomori改良鈣鈷法染色。取 5 塊玻片, 每片隨機(jī)取 2個(gè)視野, 采用網(wǎng)格計(jì)數(shù)法, 計(jì)算堿性磷酸酶染色 陽性細(xì)胞的百分比。堿性磷酸酶活性檢測(cè): 取第 3 代細(xì)胞, 以 1×105/ 孔的密度接種于6 孔板中, 分別成骨誘導(dǎo) 3, 5, 7, 10, 12

4、, 14 d,按堿性磷酸酶活性檢測(cè)試劑盒要求進(jìn)行檢測(cè)。鈣結(jié)節(jié)染色: Von Kossas礦化結(jié)節(jié)染色法 原理是將礦化基質(zhì)中的磷酸鹽(鈣)、碳酸鹽(鈣)轉(zhuǎn)變?yōu)榱姿徙y、碳酸銀，然后用日光、紫外線或強(qiáng)還原劑使其還原為黑色的金屬銀。本試驗(yàn)染色過程中未作細(xì)胞襯染。Van kossa銀染色法試劑： 12%硝酸銀水溶液：硝酸銀2g蒸餾水加至100 ml。 25%硫代硫酸鈉水溶液：硫代硫酸鈉5g，蒸餾水加至100 ml。培養(yǎng)皿用PBS沖2次，95%乙醇固定10分鐘，蒸餾水沖洗3次2. 2%硝酸銀內(nèi)置暗處1小時(shí)3. 蒸餾水沖洗3次，再流水沖洗10分鐘4. 還原1小時(shí)（硫代硫酸鈉5g，氫氧化鈉0.2ml，蒸餾水1

5、00ml）5. 5%硫代硫酸鈉1小時(shí)1.固定后的細(xì)胞爬片用0.01mol/L PBS(pH7.4)洗滌2遍； 2.浸入5%（也有1）硝酸銀水溶液中10min，日光或紫外光曝曬1045 min，蒸餾水洗滌； 3.浸入5%次亞硫酸鈉（3%硫代硫酸鈉沖洗）溶液中，蒸餾水洗； 4.1%中性紅襯染1 min，水洗，晾干，酒精系列脫水（常規(guī)順序：80909510011002），二甲苯透明，中性樹膠封片。l 1. Sections to water. 切片脫蠟至水  2. Place sections in 1% silver nitrate solution under ultra-

6、violet light for 45 minutes. 置于1硝酸銀溶液在紫外光下45分鐘3. Wash in distilled water. 蒸餾水漂洗4. Treat with 3% sodium thiosulphate for 5 minutes. 3硫代硫酸鈉處理5分鐘5. Wash in water. 用水漂洗6. Counterstain with van Gieson for 5 minutes. Van Gieson復(fù)染5分鐘7. Wash in alcohol. 乙醇漂洗8. Clear . Mount sections in DPX 透明封片 結(jié)果：鈣鹽沉積區(qū)域呈黑色

7、，背景紅色.A 組以現(xiàn)行報(bào)道方法染色:4 %多聚甲醛固定標(biāo)本 ,1 %硝酸銀溶液紫外線下染色 10min ,用 5 %硫代硫酸鈉染色 2min ,1 %中性紅復(fù)染 10min ,酒精沖洗后觀察。B 組以改進(jìn)的方法染色: 4 %多聚甲醛固定標(biāo)本 ,5 %硫代硫酸鈉孵育 30min ,蒸餾水沖洗 ,然后用1 %硝酸銀溶液紫外線下染色 30min ,蒸餾水沖洗掉浮于細(xì)胞表面的黑色物質(zhì) ,繼續(xù)用 5 %硫代硫酸鈉染色 2min ,1 %中性紅復(fù)染 10min ,蒸餾水漂洗后觀察。或取成骨誘導(dǎo) 21 d 的細(xì)胞, 體積分?jǐn)?shù)為 0.95 的乙醇固定 15 min, 10 g/L 茜素紅 S 染液在室溫下浸

8、染 10 min, 去離子水洗滌3次, 倒置顯微鏡下觀察。二、茜素紅染色茜素紅S中文名稱: 茜素紅S英文名稱:alizarin red S; sodium alizarin sulfonateCAS: 130-22-3分子式: C14H7NaO7H2O分子量: 360.28中文別名: 9,10-二氫-3,4-二羥基-9,10-二氧代-2-蒽磺酸單鈉鹽； 茜素紅；（3） 茜素磺酸鈉 ；茜素S ；酸性媒介茜素紅；酸性媒介紅S-80（Acid Mordnat Reds-80）；C. I.媒介紅3（C. I. Mordant Red 3）。性質(zhì)：橙黃色的針狀體。溶于水，微溶于醇，不溶于氯仿和苯。1%水

9、溶液pH2.15。由茜素經(jīng)發(fā)煙硫酸磺化，然后轉(zhuǎn)變?yōu)殁c鹽制得。茜素紅能和許多金屬離子生成穩(wěn)定的紅色絡(luò)色物，在分析中常用作金屬指示劑；光度法測(cè)定金屬離子的顯色劑；在分析中常用作金屬指示劑；光度法測(cè)定金屬離子的顯色劑；酸堿指示劑，第一變色范圍PH值3.7(黃)5.2(紫)，第二變色范圍PH值10.1(紫)12.0(淺黃)；用于極譜法測(cè)定金屬離子。用途: 絡(luò)合滴定指示劑和酸堿指示劑。配制：將托盤天平上稱取0.1g茜素磺酸鈉定溶于100ml蒸餾水中轉(zhuǎn)移入滴瓶中，貼標(biāo)簽備用。 或用茜素紅粉加PBS溶解后，要注意調(diào)節(jié)PH值到7.2！過濾就可以了。0.1%的茜素紅Tris-HCL(PH8.3), Tris的濃

10、度做分子生物學(xué)一樣的，用0.1molL的HCI或0.1的NaOH調(diào)節(jié)。茜素紅染液配方配方一 茜素紅染液（）取冰醋酸5毫升、甘油5毫升、1%水合氯醛60毫升混合。在這種混合液中方入少量茜素紅，制成茜素紅飽和溶液。配方二 茜素紅溶液（）取1克茜素紅，溶于100毫升95%酒精中，攪拌，然后跟900毫升1%氫氧化鉀溶液相混，即成深紫色的茜素紅染液?茜素紅(Fluka)溶于96乙醇中配成0.12的茜素紅液。配方三0.1%的茜素紅配Tris-HCL(PH8.0) 具體配制方法1g Tris（1g左右Tris均可）加入三蒸水100ml中，用滴管往配制液中加HCl（分析醇），一滴滴地加，邊加邊測(cè)試PH，待PH

11、為8.3左右即可（無精密PH測(cè)試儀，用PH試紙也是一樣的，但是要能測(cè)到8點(diǎn)幾的PH試紙），配好后往里面加0.1g的茜素紅，便得到0.1%茜素紅Tris-Hcl(PH 8.3)溶液。茜素紅染色步驟1、棄培養(yǎng)基，培養(yǎng)皿用PBS沖洗2次，2、95% (也有90)乙醇固定1030min，蒸餾水沖洗3次3、 0.2% （or 0.1%）茜素紅茜素紅Tris-Hcl(PH 8.3)染色,37,30min ,用清水沖洗。在低倍鏡視野(4 ×10) 下進(jìn)行礦化結(jié)節(jié)計(jì)數(shù)鈣染色法茜素紅法 染色步驟 1 茜素紅S染液5分鐘 2 用丙酮洗20分鐘 3 丙酮：二甲苯（1：1）溶液20秒 4. 樹膠封固 結(jié)果：

12、鈣累及物呈桔紅色型膠原免疫細(xì)胞化學(xué)染色（成骨特有）取成骨誘導(dǎo) 7 d 的細(xì)胞爬片,磷酸鹽緩沖液漂洗, 4 丙酮固定 10 min, 磷酸 鹽 緩 沖 液 洗 3 次 , 5 min/ 次 ; 體 積 分 數(shù) 為0.03 的過氧化氫孵育 10 min, 磷酸 鹽 緩 沖 液洗 3 次, 5 min/ 次; 血清封閉液封閉 15 min, 傾去封閉液, 磷酸鹽緩沖液稀釋的型膠原抗 4 過夜, 磷酸鹽緩沖液洗 3 次, 5 min/ 次;兔抗羊抗室溫 1 h, 磷酸鹽緩沖液洗 3 次,5 min/ 次; 辣根酶標(biāo)記的鏈霉素卵白素工作液室溫 15 min, 磷酸鹽緩沖液洗 3 次, 5 min/ 次,

13、二氨基聯(lián)苯胺顯色, 自來水沖洗、復(fù)染、脫水、透明、封固。誘導(dǎo)脂肪方向分化誘導(dǎo)分化細(xì)胞以每毫升 5 ×104 ,接種于培養(yǎng)皿中 ,細(xì)胞達(dá)到 80 %匯合后更換成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)液(LDMEM 培養(yǎng)液 ,10 % FBS , 地塞米松 10-6mol/L , 胰島素10 mg/L , 3-異丁基-1-甲基黃嘌呤（3-isobutyl-1-methylxanthine，IBMX 0.5 mmol/L ,吲哚美辛 0.2mmol/L),對(duì)照組繼續(xù)加常規(guī)培養(yǎng)液 ,每 3 天換液一次。在誘導(dǎo) 6 、9 、12 、15 、18 d 時(shí)各取各組細(xì)胞進(jìn)行油紅 O 染色 ,光鏡下觀察并攝影。油紅O配方油紅O1g,異丙醇100ml或70%酒精100