厭氧菌MIC測(cè)定方法

1、厭氧菌的抗微生物藥敏感試驗(yàn)方法Methods for Antimicrobial Susceptibility Testing of Anaerobic Bacteria目次前言1. 范圍2. 引用標(biāo)準(zhǔn)3. 定義4. 進(jìn)行厭氧菌敏感試驗(yàn)的指征5. 厭氧菌敏感試驗(yàn)的局限性6. 抗微生物藥7. 常規(guī)試驗(yàn)和報(bào)告中抗微生物藥的選擇8. 稀釋試驗(yàn)接種物制備9. 參考瓊脂稀釋法（Wadsworth法）10. 微量肉湯稀釋法 11.-內(nèi)酰胺酶試驗(yàn)1. 質(zhì)量控制的方法附錄：培養(yǎng)基和補(bǔ)充劑的制備表1：厭氧菌試驗(yàn)應(yīng)考慮的抗微生物藥推薦分組表2：解釋標(biāo)準(zhǔn)和相對(duì)應(yīng)最低抑菌濃度（MIC）值表3：制備抗微生物藥

2、貯存液需要的溶劑和稀釋液表4：瓊脂稀釋法或微量肉湯稀釋法敏感試驗(yàn)中抗微生物藥稀釋液的制備方案表5：參比瓊脂稀釋試驗(yàn)標(biāo)質(zhì)控菌株的最低抑菌濃度（MIC）的質(zhì)控允許范圍表6：微量肉湯稀釋試驗(yàn)質(zhì)控菌株的最低抑菌濃度（MIC）的質(zhì)控允許范圍前言臨床細(xì)菌分離中由于厭氧菌感染日漸增多，厭氧菌的藥敏試驗(yàn)和耐藥監(jiān)測(cè)已提到日程上。本標(biāo) 準(zhǔn)是在衛(wèi)生部頒發(fā)的全國(guó)臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程（第三版）的基礎(chǔ)上，依據(jù)美國(guó)國(guó)家臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)（National Committee for Clinical Laboratory Standards,NCCLS）M11-A5文件厭氧菌的抗微生物藥敏感試驗(yàn)方法（已批準(zhǔn)的標(biāo)準(zhǔn)第五版）I

3、SBN 1-56238-429-5，結(jié)合中國(guó)國(guó)情及衛(wèi)生系統(tǒng)的實(shí)際情況和要求制定。本標(biāo)準(zhǔn)從2004年 月 日起實(shí)施。本標(biāo)準(zhǔn)由衛(wèi)生部提出。本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：北京大學(xué)人民醫(yī)院檢驗(yàn)科。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：張正 岳志紅。本標(biāo)準(zhǔn)由衛(wèi)生部委托衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心負(fù)責(zé)解釋。中華人民共和國(guó)衛(wèi)生行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)WS/T×××-200× 厭氧菌的抗微生物藥敏感試驗(yàn)方法Methods for Antimicrobial Susceptibility Testing of Anaerobic Bacteria1. 范圍本文件所述方法主要用于測(cè)試普通分離到的厭氧菌。瓊脂稀釋法

4、可用于測(cè)試大多數(shù)厭氧病原菌。目前微量肉湯稀釋法僅用于測(cè)試脆弱擬桿菌菌群的病原菌。本標(biāo)準(zhǔn)適用于從事厭氧菌抗微生物藥敏感試驗(yàn)的臨床實(shí)驗(yàn)室使用。1. 引用標(biāo)準(zhǔn)下列標(biāo)準(zhǔn)條文主要根據(jù)美國(guó)NCCLS的M11-A5文件和中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部醫(yī)政司編制的全國(guó)臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程（第三版）而制定。1. 定義3.1瓊脂稀釋敏感試驗(yàn)將某一種抗微生物藥的系列濃度混入用于敏感試驗(yàn)的瓊脂生長(zhǎng)培養(yǎng)基進(jìn)行的抗微生物藥敏感試驗(yàn)。 3.2敏感指該菌株所致感染可以用推薦用于此型感染及病原菌的抗微生物藥劑量進(jìn)行恰當(dāng)?shù)刂委煛?.3中介藥物在生理濃集的部位具有臨床效力或者可用高于正常劑量的藥物進(jìn)行治療；此還包括一個(gè)“緩沖區(qū)”可以防

5、止微小的，未能控制的技術(shù)因素造成重大的結(jié)果解釋錯(cuò)誤。3.4 耐藥指常規(guī)劑量抗微生物藥通常達(dá)到的濃度不能抑制該菌株的生長(zhǎng)和/或該菌株的MIC落于某范圍內(nèi)。在此范圍內(nèi)，可存在某些特定的耐藥機(jī)制（如-內(nèi)酰胺酶類(lèi)），并且治療研究顯示其臨床療效并不可靠。3.5最小抑菌濃度瓊脂或肉湯稀釋敏感試驗(yàn)中抗微生物藥抑制某一種微生物可見(jiàn)生長(zhǎng)的最低濃度。1. 進(jìn)行厭氧菌敏感試驗(yàn)的指征臨床上有厭氧菌感染存在，并在實(shí)驗(yàn)室分離出厭氧菌，原則上均應(yīng)進(jìn)行抗微生物藥敏感試驗(yàn)。4.1 常規(guī)試驗(yàn)從腦膿腫、心內(nèi)膜炎、骨髓炎、關(guān)節(jié)感染、人工裝置或人工血管感染和菌血癥分離到的特殊感染的標(biāo)本應(yīng)該測(cè)試，并應(yīng)參考臨床醫(yī)生的合理建議。當(dāng) 感染的性

6、質(zhì)不清楚，標(biāo)本含有內(nèi)源性厭氧菌菌群，而且病原菌與正在治療的感染關(guān)系很少時(shí)，通常不必做敏感試驗(yàn)。當(dāng)存在多種厭氧菌時(shí)，參考臨床情況選擇可能引 起厭氧菌感染的最重要菌種進(jìn)行敏感試驗(yàn)。一般分離到擬桿菌屬、普雷沃氏菌屬、梭桿菌屬。梭菌屬、嗜膽菌屬和薩頓氏菌屬的一些菌種應(yīng)做敏感試驗(yàn)。敏 感試驗(yàn)應(yīng)使用分純后菌懸液。不能直接用臨床標(biāo)本進(jìn)行敏感試驗(yàn)。MIC試驗(yàn)一般采用倍比稀釋，采用本標(biāo)準(zhǔn)推薦方法，做好質(zhì)控，結(jié)果報(bào)告采用在實(shí)際終點(diǎn)時(shí)的一 個(gè)倍比稀釋范圍內(nèi)較為科學(xué)。例如：終點(diǎn)為16g/mL，真正報(bào)告應(yīng)8g/ml-32g/ml范圍更好。并做出敏感、中介或耐藥判斷，以供臨床參考。4.2 監(jiān)測(cè)試驗(yàn)當(dāng)技術(shù)條件不允許每個(gè)實(shí)驗(yàn)

7、室都進(jìn)行厭氧菌敏感試驗(yàn)時(shí)，建議當(dāng)?shù)亟⒖紝?shí)驗(yàn)室，收集一定量臨床菌株（不少于50-100株），集中測(cè)試后公布結(jié)果供大家參考。1. 厭氧菌敏感試驗(yàn)的局限性體外結(jié)果不足以預(yù)測(cè)某個(gè)病人對(duì)厭氧菌感染治療的反應(yīng)，僅供臨床選藥參考。此標(biāo)準(zhǔn)的試驗(yàn)方法也并不一定適用于所有的厭氧菌，以下2點(diǎn)需考慮。 5.1 折點(diǎn)和臨床相關(guān)關(guān)于確定厭氧菌對(duì)大多數(shù)抗微生物藥的敏感性的折點(diǎn)，現(xiàn)在并無(wú)一致意見(jiàn)。目前折點(diǎn)的確定是基于動(dòng)物模型或需氧和厭氧菌多重感染的病人的臨床試驗(yàn)結(jié)果。因?yàn)榇蠖鄶?shù)厭氧菌感染發(fā)生于密閉空間，涉及多種微生物，單一抗微生物藥抗單一微生物的體外活性并不直接與其體內(nèi)效力相關(guān)。 除數(shù)目分布和臨床效力

8、之外，MIC結(jié)果的敏感和中介折點(diǎn)解釋是基于最大的推薦劑量獲得的血清水平，因?yàn)閰捬蹙腥就ǔＭ扑]最大劑量用藥。建立中介范圍是因?yàn)橛行┧幬镫y于判讀終點(diǎn)和MIC在折點(diǎn)附近聚集。 5.2 病原菌瓊脂稀釋法適用于測(cè)試多種不同的厭氧菌。至今為止，微量肉湯稀釋法僅限于測(cè)試脆弱擬桿菌菌群。當(dāng)測(cè)試菌呈蔓延生長(zhǎng)時(shí)（例如艱難梭菌或破傷風(fēng)梭菌），則需要盡量在瓊脂平板上劃開(kāi)接種物。而對(duì)于敗毒梭菌，每個(gè)平板只能測(cè)試一個(gè)分離株。1. 抗微生物藥6.1 來(lái)源抗微生物藥標(biāo)準(zhǔn)品或參考藥品可直接來(lái)自廠商，或來(lái)自中國(guó)藥品及食品監(jiān)督管理局檢定所，或其他商業(yè)途徑。不應(yīng)把非腸道的制品用于 敏感試驗(yàn)?？山邮艿乃幤窇?yīng)貼有標(biāo)簽，標(biāo)明藥

9、品的通用名，批號(hào)，分析活力（常用每mg藥品中含g或國(guó)際單位（IU）表示）和有效期。貯存于規(guī)定的溫度和濕 度中。用時(shí)防止冷凝水進(jìn)入。6.2 抗微生物藥的稱量實(shí)驗(yàn)室必須根據(jù)該批待用藥品的分析結(jié)果來(lái)標(biāo)化其抗微生物藥溶液?？刮⑸锼幤窇?yīng)使用經(jīng)計(jì)量認(rèn)證的分析天平稱量。公式如下：重量(mg)=體積（mL）×所需濃度（g/mL）分析活力（g/mg）或體積（mL）=重量(mg) ×分析活力（g/mg）所需濃度（g/mL）6.3 制備貯存液抗 微生物藥貯存液制備的濃度一般應(yīng)該至少為1,000g/mL(如1,280g/mL)或者是最高測(cè)試濃度的10倍。某些藥物必須溶解于非水溶劑中。此

10、 時(shí)，應(yīng)使用盡量少的溶劑來(lái)溶解抗微生物藥。最終的貯存液可用水或表3所述的合適的稀釋劑進(jìn)行稀釋。貯存液分裝后貯存于規(guī)定溫度下，一般-60可保存半 年。6.4 測(cè)試濃度的數(shù)目一種特定抗微生物藥的測(cè)試濃度應(yīng)包含表2所示的解釋性折點(diǎn)，但實(shí)測(cè)的濃度數(shù)目是由實(shí)驗(yàn)室決定的。MIC結(jié)果報(bào)告推薦選用五個(gè)或更多濃度。建議選用的范圍應(yīng)包涵質(zhì)控菌株的在控?cái)?shù)值。1. 常規(guī)試驗(yàn)和報(bào)告中抗微生物藥的選擇敏感試驗(yàn)抗微生物藥品種類(lèi)選擇可參考表1。在實(shí)際應(yīng)用中，應(yīng)結(jié)合我國(guó)實(shí)情，參考實(shí)驗(yàn)室所在的臨床單位醫(yī)生及控感科意見(jiàn)做出合適選擇，不斷積累經(jīng)驗(yàn)。完整的報(bào)告單應(yīng)包括患者一般資料（姓名、性別、年齡和病理號(hào)等）。藥品名稱應(yīng)按照我國(guó)藥典頒

11、布名稱。菌種名稱按照衛(wèi)生部已公布名詞標(biāo)準(zhǔn)。應(yīng)報(bào)告敏感、中介和耐藥。1. 稀釋試驗(yàn)接種物制備受試菌應(yīng)是從強(qiáng)化布氏血瓊脂選擇經(jīng)充足時(shí)間孵育（24-48小時(shí)）產(chǎn)生的合適大小的菌落。菌落直徑通常至少1毫米?？焖偕L(zhǎng)菌如脆弱擬桿菌菌群和產(chǎn) 氣莢膜梭菌可經(jīng)24小時(shí)孵育后測(cè)試，而其它大多數(shù)厭氧菌需要48小時(shí)孵育。對(duì)于緩慢生長(zhǎng)的厭氧菌，如嗜膽菌屬和纖細(xì)彎曲桿菌，可以從多個(gè)瓊脂平板制備接種 物以保證標(biāo)準(zhǔn)化的準(zhǔn)確?？赏ㄟ^(guò)生長(zhǎng)法或直接菌落懸液法制備接種物。8.1 制備接種物時(shí)的濁度標(biāo)準(zhǔn)為使敏感試驗(yàn)的接種濃度標(biāo)準(zhǔn)化，應(yīng)使用一個(gè)等同于0.5號(hào)麥?zhǔn)希∕cFarland）標(biāo)準(zhǔn)管的BaSO4濁度標(biāo)準(zhǔn)管或其光學(xué)等同物（如乳膠顆

12、粒懸液）。BaSO4的0.5號(hào)麥?zhǔn)蠘?biāo)準(zhǔn)管制備見(jiàn)附錄。8.2分離株的貯存和復(fù)蘇8.2.1 冷凍大多數(shù)厭氧菌可在20甘油中在-60或更低溫度保存數(shù)年。將四份48小時(shí)肉湯培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到含有一份無(wú)菌甘油的無(wú)菌玻璃瓶中。充分混勻成均一懸液后冷凍。預(yù)還原時(shí)使用不加糖的皰肉培養(yǎng)基。另外，也可將48小時(shí)平板培養(yǎng)的若干菌落直接懸浮于20滅菌脫脂牛奶中，-60冷凍。8.2.2 復(fù)蘇凍存的分離株必須在強(qiáng)化布氏血瓊脂上至少傳代兩次，用于敏感試驗(yàn)前必須證明其純度。1. 生長(zhǎng)法2. 從強(qiáng)化布氏血瓊脂選擇經(jīng)24小時(shí)或充足時(shí)間孵育產(chǎn)生的合適大小的菌落（直徑至少1毫米）。挑取形態(tài)特征完全一致的至少5個(gè)菌落，或用3mm直徑的 接種

13、環(huán)取滿一環(huán)，接種于無(wú)指示劑的硫代硫酸鹽培養(yǎng)基。如果此步驟使用厭氧箱，可使用強(qiáng)化布氏肉湯，強(qiáng)化腦心浸液或Schaedler氏肉湯替代硫代硫酸鹽 肉湯。3. 孵育肉湯6-24小時(shí)或直至獲得足夠濁度。4. 加入布氏肉湯或其它使用前預(yù)還原或煮沸后冷卻的肉湯，調(diào)整濁度等于0.5號(hào)麥?zhǔn)蠘?biāo)準(zhǔn)。對(duì)于大腸桿菌ATCC25922或脆弱擬桿菌ATCC25285，此時(shí)懸液中細(xì)菌數(shù)約為1-2×108CFU/mL。但應(yīng)注意到不同厭氧菌分離株接種大小的變化。1. 直接菌落懸液法5. 此法是從孵育了24-48小時(shí)強(qiáng)化布氏血瓊脂平板挑取菌落。制備懸液時(shí)平板在有氧環(huán)境中不應(yīng)超過(guò)30分鐘。6. 輕輕挑取形態(tài)特征完全一致的

14、至少5個(gè)菌落，直接轉(zhuǎn)移到布氏肉湯或其它使用前預(yù)還原或煮沸后冷卻的肉湯，獲得相當(dāng)于0.5麥?zhǔn)蠘?biāo)準(zhǔn)的濁度。7. 此法制備厭氧菌的一些菌種菌懸液計(jì)數(shù)會(huì)輕度升高。8. 參考瓊脂稀釋法（Wadsworth法）9.1 試劑和材料9.1.1 厭氧罐（箱）采用環(huán)境含4-7CO2厭氧罐（箱），并應(yīng)有無(wú)氧狀態(tài)指示劑。9.1.2 強(qiáng)化布氏瓊脂使用的培養(yǎng)基是每mL布氏瓊脂中添加5g氯化血紅素、1g維生素K1和5脫纖維羊血(v/v)。布氏瓊脂的組成和制備，補(bǔ)充劑的制備和添加詳見(jiàn)附錄。也可提前配制瓊脂，使用當(dāng)天融化。制備抗微生物藥稀釋液后，抗微生物藥和脫纖維羊血一起加入到融化瓊脂中。9.2 瓊脂稀釋平板的制備步驟開(kāi)始前，

15、確定抗微生物藥及其所用濃度。制備瓊脂稀釋平板時(shí)，15×100圓形平板需要20mL瓊脂，方形平板需要30mL。平板的制備是將一份 10×抗微生物藥溶液加入到九份瓊脂中。例如：制備20mL瓊脂的圓形平板，需要在17mL已添加氯化血紅素和維生素K1的融化的布氏瓊脂（保持在 45-50）中加入1mL脫纖維羊血和2mL10×抗微生物藥溶液。方形平板則是25.5mL布氏瓊脂、1.5mL脫纖維羊血和3mL10×抗微生物 藥溶液。9.2.1 制備瓊脂空白1. 試驗(yàn)前或試驗(yàn)中，準(zhǔn)備足夠已添加維生素K1和氯化血紅素的布氏瓊脂，分配合適的量到試管中。每種抗微生物藥的每個(gè)濃度準(zhǔn)

16、備一管。2. 如果試驗(yàn)當(dāng)天使用，分配后置于48-50水浴。如果提前制備，融化培養(yǎng)基（沸騰水浴，微波爐或高壓鍋），置于水?。?8-50）中冷卻。9.2.2 制備抗微生物藥稀釋液1. 融化以前制備的抗微生物藥貯存液，或試驗(yàn)當(dāng)天制備。2. 將設(shè)計(jì)好數(shù)量（見(jiàn)表4）的滅菌蒸餾水加入相應(yīng)管中，制備稀釋液空白。3. 使用表4所述稀釋規(guī)則， 1:2，1:4，和1:8連續(xù)稀釋制備中間濃度（10×）抗微生物藥溶液，而不是直接倍比稀釋。此方法制備稀釋液可使稀釋錯(cuò)誤最小化。9.2.3 制備瓊脂稀釋平板1. 標(biāo)記制備的每一種抗微生物藥的每一種濃度的平板，將平板置于水平臺(tái)面上。2. 對(duì)于制備的每一種抗微生物藥濃

17、度，將1mL脫纖維羊血（對(duì)于方形平板1.5mL）和2mL10×抗微生物藥溶液（對(duì)于方形平板3mL）加入到 17mL融化并冷卻的強(qiáng)化布氏瓊脂（對(duì)于方形平板25.5mL）試管中。蓋緊試管蓋子，輕輕翻轉(zhuǎn)數(shù)次混勻，小心不要產(chǎn)生氣泡。倒入平板，固化。3. 如果測(cè)試一種抗微生物藥，應(yīng)準(zhǔn)備另外四個(gè)不加抗微生物藥的平板，和以上（2）相同的步驟，但用滅菌蒸餾水替代抗微生物藥溶液。對(duì)于另外測(cè)試的每一種抗微生物藥，準(zhǔn)備另外一個(gè)不加抗微生物藥的平板。4. 瓊脂固化后，可將平板蓋子半開(kāi)置于層流罩或溫箱約30分鐘使其干燥?；蛘呤欠D(zhuǎn)平板將瓊脂底蓋支在蓋子上。9.2.4 瓊脂稀釋平板的貯存1. 用于常規(guī)試驗(yàn)，試驗(yàn)

18、前密封于塑料袋中于2-8貯存，不超過(guò)7天。2. 用于研究和評(píng)估目的，推薦貯存期不超過(guò)72小時(shí)。3. 含亞胺培南，克拉維酸或其它已知不穩(wěn)定的-內(nèi)酰胺/-內(nèi)酰胺酶抑制劑組合的抗微生物藥的平板必須在試驗(yàn)當(dāng)天配制。9.3 接種瓊脂稀釋平板接種物接種到瓊脂表面的最簡(jiǎn)便的方法是使用多點(diǎn)接種器取1-2L接種到瓊脂表面。那么最終瓊脂上接種物每點(diǎn)接近105CFU。由于大多數(shù)厭氧菌能暫時(shí)容忍暴露于氧氣，所有操作可在外界環(huán)境中進(jìn)行。一些苛養(yǎng)菌分離株則必需使用預(yù)還原平板和在厭氧環(huán)境中進(jìn)行所有操作。1. 使微生物生長(zhǎng)到濁度等于0.5號(hào)麥?zhǔn)蠘?biāo)準(zhǔn)或?qū)⒕渲苯又瞥蓱乙旱较嗤瑵岫?，制備?biāo)準(zhǔn)化的接種物。2. 試管按順序排列在架子

19、上，將少量體積（約0.5mL）移至多點(diǎn)接種器的相應(yīng)孔中。在瓊脂平板上做標(biāo)記，以標(biāo)明接種點(diǎn)的方位。3. 小心避免飛濺。4. 順序：從最低到最高的藥物濃度依次接種。5. 質(zhì)控：試驗(yàn)開(kāi)始時(shí)首先接種兩個(gè)無(wú)抗微生物藥的對(duì)照平板。其中一個(gè)平板標(biāo)記“pre-O2”（檢查需氧菌污染），另外一個(gè)平板標(biāo)記“pre- Ana”（厭氧菌最初生長(zhǎng)對(duì)照）。每一系列平板之間，接種一個(gè)無(wú)抗微生物藥的對(duì)照平板做生長(zhǎng)對(duì)照。最后，再次接種兩個(gè)平板，標(biāo)記為“post-O2”和 “post-Ana”，來(lái)證實(shí)最終病原菌生長(zhǎng)力和純度。9.4 孵育瓊脂稀釋平板1. 平板一旦變干，翻轉(zhuǎn)后置于厭氧罐或替代厭氧環(huán)境中35孵育42-48小時(shí)。2.

20、有氧孵育平板（證實(shí)有氧環(huán)境中未能生長(zhǎng)）應(yīng)置于含有5CO2環(huán)境中35孵育42-48小時(shí)。9.5 判讀瓊脂稀釋終點(diǎn)1. 在黑色不反光的背景下觀察每一平板。首先判讀對(duì)照平板，尋找需氧菌可能污染或孔間交叉污染。如果檢測(cè)到污染，則必需重新測(cè)試。2. 判讀MIC終點(diǎn)是和厭氧菌對(duì)照平板相比生長(zhǎng)特征發(fā)生顯著抑制的測(cè)試平板的濃度。樣本的一個(gè)顯著生長(zhǎng)變化包括薄霧狀、多個(gè)細(xì)小菌落，或一個(gè)到數(shù)個(gè)正常大小菌落。3. 微量肉湯稀釋法此法僅適用于測(cè)試脆弱擬桿菌菌群。10.1 試劑和材料10.1.1 厭氧罐（箱）附錄所述瓊脂稀釋法條件同樣也適用于微量肉湯稀釋法。10.1.2 強(qiáng)化布氏肉湯布氏肉湯的組成和制備，補(bǔ)充劑的制備和添

21、加詳見(jiàn)附錄。10.2 微量肉湯稀釋板準(zhǔn)備1. 本法被稱為“微量稀釋”是因?yàn)槭褂昧诵◇w積的肉湯。這些小體積肉湯被分配到無(wú)菌塑料微量稀釋板。每個(gè)小孔至少應(yīng)裝0.1mL肉湯。2. 為制備（10×）抗微生物藥溶液，應(yīng)將濃縮的抗微生物藥貯存液按表4所述內(nèi)容進(jìn)行稀釋或進(jìn)行倍比稀釋。將一份10×抗微生物藥溶液加入到九份肉湯中，得到所需最終濃度。3. 制備微量稀釋板的最簡(jiǎn)便方法是使用分配裝置。它可以用至少10mL肉湯制成的抗微生物藥稀釋液按照每孔0.1（±0.02）mL的量分配到標(biāo)準(zhǔn)的96孔中。4. 加完各種抗微生物藥稀釋液的微量稀釋板應(yīng)使用塑料袋密封并立即置于冰箱<-20

22、（最好<-60）貯存。某些藥物如克拉維酸和亞胺培南，必須貯存在-60以下。應(yīng)防止反復(fù)凍融。10.3 微量肉湯稀釋板的接種使微生物生長(zhǎng)到濁度等于0.5號(hào)麥?zhǔn)蠘?biāo)準(zhǔn)或?qū)⒕渲苯又瞥蓱乙旱玫较嗤瑵岫?，制備?biāo)準(zhǔn)化的接種物。1. 調(diào)整好的接種菌懸液最好在15分鐘內(nèi)用水或鹽水稀釋，接種后每管或每孔大約含1×106CFU/mL。為獲得此最終接種物而采取的稀釋步驟，可因 接種物加到單個(gè)孔的加樣方法不同而不同，因此對(duì)于每一種情況都必須進(jìn)行計(jì)算。計(jì)算時(shí)必須知道微量稀釋試驗(yàn)要加到孔內(nèi)的接種物的確切體積。例如，如果孔內(nèi)培 養(yǎng)基體積是0.1mL，接種物體積為0.01mL,那么應(yīng)將0.5號(hào)麥?zhǔn)蠎乙海s1.5

23、×108CFU/mL）按1:15稀釋以獲得1×107CFU /mL的菌液。當(dāng)取0.01mL此菌液接種肉湯時(shí)，細(xì)菌的最終測(cè)試濃度為1×106CFU/mL(或1×105CFU/孔)。2. 按上述方法對(duì)接種物進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化后15分鐘內(nèi)，可以用接種裝置取體積不超過(guò)小孔體積10的接種物（如在0.1mL抗微生物藥液中接種物應(yīng)10µL）接種微量稀釋板的每個(gè)孔。相反，如果用0.05mL的吸管，每孔的內(nèi)容物將被1:2稀釋。3. 為菌落計(jì)數(shù)，實(shí)驗(yàn)室應(yīng)經(jīng)常用脆弱擬桿菌ATCC25285練習(xí)，以保證技術(shù)熟練。10.4 微量肉湯稀釋板孵育1. 為保證孵育溫度，微量稀釋板的疊

24、放不應(yīng)超過(guò)四層。2. 接種好的微量稀釋板應(yīng)放在厭氧環(huán)境中35孵育46-48小時(shí)。3. 應(yīng)采取措施防止微量稀釋板的蒸發(fā)。10.5 判讀微量肉湯稀釋終點(diǎn)1. 在黑色，使用間接光無(wú)反射光的背景下觀察，放大鏡可使用。2. 如果生長(zhǎng)對(duì)照孔的生長(zhǎng)微弱或不生長(zhǎng)，則不應(yīng)判讀。3. MIC終點(diǎn)應(yīng)是觀察到的無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)或最顯著抑制細(xì)菌生長(zhǎng)的抗微生物藥濃度。一些藥物/病原菌組合可觀察到拖尾效應(yīng)。4. -內(nèi)酰胺酶試驗(yàn)在敏感試驗(yàn)之前，可使用產(chǎn)色頭孢菌素為基礎(chǔ)的方法進(jìn)行除脆弱擬桿菌菌群外厭氧菌-內(nèi)酰胺酶活性檢測(cè)。大多數(shù)脆弱擬桿菌菌群分離株產(chǎn)生-內(nèi)酰胺酶，認(rèn)為對(duì)青霉素耐藥，因此不需要常規(guī)-內(nèi)酰胺酶檢測(cè)。1. 質(zhì)量控制的方法1

25、2.1目的質(zhì)控工作的目的是監(jiān)測(cè)敏感試驗(yàn)步驟的精密度和準(zhǔn)確度，試劑和設(shè)備的質(zhì)量，和進(jìn)行試驗(yàn)的工作人員的操作。為達(dá)到上述目的，最好選用遺傳性穩(wěn)定和在特定方法中有用的標(biāo)準(zhǔn)參考菌株?？上驀?guó)家藥品及食品監(jiān)督管理局檢定所菌種庫(kù)購(gòu)買(mǎi)。12.2 批次的質(zhì)控對(duì) 于瓊脂稀釋，每一批新的培養(yǎng)基、試劑、補(bǔ)充劑或抗微生物藥首次使用時(shí)應(yīng)進(jìn)行所有三種質(zhì)控菌株的質(zhì)控試驗(yàn)。對(duì)于自制的微量肉湯稀釋板，每一批至少取一個(gè)微量 稀釋板孵育過(guò)夜以保證培養(yǎng)基的無(wú)菌性（剩余稀釋板可冷凍貯存于-20，最好是-60）。對(duì)于商業(yè)制備的平板，應(yīng)依據(jù)廠商說(shuō)明進(jìn)行質(zhì)控。12.3質(zhì)控菌株和質(zhì)控頻率有三種質(zhì)控菌株常用于質(zhì)控。厭氧菌敏感試驗(yàn)時(shí)，瓊脂稀釋推薦使

26、用以下至少兩種質(zhì)控菌株來(lái)監(jiān)測(cè)試驗(yàn)步驟。微量肉湯稀釋和臨床分離株的常規(guī)試驗(yàn)則推薦使用一種或一種以上質(zhì)控菌株。應(yīng)使用列于表5和表6中的限制對(duì)試驗(yàn)系統(tǒng)的整體表現(xiàn)進(jìn)行監(jiān)控。脆弱擬桿菌 ATCC 25285多型擬桿菌 ATCC 29741遲緩優(yōu)桿菌 ATCC 4305512.4 糾正措施當(dāng)質(zhì)控超過(guò)特定范圍而且結(jié)果失控，應(yīng)尋找原因（如使用了錯(cuò)誤的質(zhì)控菌株，菌株明顯的污染，或使用了錯(cuò)誤的孵育條件或溫度等），并做出失控報(bào)告，重新操作直至在控，經(jīng)科負(fù)責(zé)人批準(zhǔn)再實(shí)施臨床檢測(cè)。12.5 其他對(duì)照步驟12.5.1 生長(zhǎng)對(duì)照每一種瓊脂稀釋平板和微量肉湯稀釋板都應(yīng)包含一個(gè)不含抗微生物藥的基礎(chǔ)培養(yǎng)基做生長(zhǎng)對(duì)照，以評(píng)價(jià)受試菌

27、的活力。對(duì)于肉湯試驗(yàn)，生長(zhǎng)對(duì)照亦可作為判讀終點(diǎn)時(shí)的濁度對(duì)照。12.5.2 純度對(duì)照瓊脂或肉湯稀釋試驗(yàn)接種時(shí)，從每一種接種物中取樣在強(qiáng)化布氏瓊脂平板上劃線，厭氧和需氧孵育過(guò)夜以檢測(cè)混合培養(yǎng)物，同時(shí)如果需要重復(fù)試驗(yàn)，它可以提供新鮮的單個(gè)菌落。這一步驟對(duì)于肉湯稀釋法特別重要，因?yàn)樵谌鉁♂尫ㄖ?，混合培養(yǎng)物有可能未被察覺(jué)。12.5.3 接種物對(duì)照定期抽取代表性接種物進(jìn)行平板計(jì)數(shù)以保證0.5號(hào)麥?zhǔn)蠘?biāo)準(zhǔn)、標(biāo)準(zhǔn)化的接種步驟和接種物的稀釋在允許范圍內(nèi)。用于平板計(jì)數(shù)的樣品應(yīng)在接種后立即取自微量稀釋板的生長(zhǎng)對(duì)照孔或者是多點(diǎn)接種器的一個(gè)隨機(jī)保存孔。12.5.4 終點(diǎn)稀釋對(duì)照定期對(duì)終點(diǎn)解釋進(jìn)行監(jiān)測(cè)可以減少不同觀察者之

28、間對(duì)終點(diǎn)解釋的差異。所有進(jìn)行本試驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)室人員都應(yīng)獨(dú)立判讀一套選定的稀釋試驗(yàn)。將記錄的結(jié)果同某個(gè)有經(jīng)驗(yàn)判讀者的結(jié)果進(jìn)行比較。所有判讀者相互之間的差異不能超過(guò)±1倍比濃度變化。附錄:培養(yǎng)基和補(bǔ)充劑的制備 1 補(bǔ)充劑1.1氯化血紅素貯存液（5mg/mL）1. 將0.1g氯化血紅素溶解于2mL1.0N的NaOH中。2. 加入蒸餾水至20mL,121滅菌15分鐘。3. 避光貯存于4-8不超過(guò)一個(gè)月。1.2氫氧化鈉（1.0N）1. 將40g氫氧化鈉于溶解于1L的蒸餾水中。2. 室溫貯存于密封容器不超過(guò)六個(gè)月。1.3 維生素K1溶液 1.3.1貯存液（10mg/mL）1. 將

29、0.2mL維生素K1加到20mL 95%乙醇中。2. 4-8貯存于黑色瓶中不超過(guò)一年。1.3.2 工作液（1mg/mL）1. 將1mL貯存液加到9mL的滅菌蒸餾水中。2. 4-8貯存于黑色瓶中不超過(guò)一個(gè)月。1.4 碳酸氫鈉貯存液（20mg/mL）1. 將2g NaHCO3溶解于100mL的蒸餾水中。2. 濾過(guò)滅菌（孔徑0.2m）。3. 使用當(dāng)天制備。1.5 脫纖維羊血1. -20或更低溫度冷凍脫纖維羊血。2. 融化羊血?？稍试S方法包括35-37水浴中快速融化或2-8緩慢融化過(guò)夜。3. 使用前翻轉(zhuǎn)容器數(shù)次充分混勻。4. 加入到融化布氏瓊脂前48-50水浴加熱。1.6馬凍融血（LHB，50）1.

30、無(wú)菌混勻等量脫纖維馬血和滅菌蒸餾水（50）。2. 將50馬血冷凍（-20）和融化五5-7次，直到細(xì)胞完全溶解。3. 12，000×g離心20分鐘4. 棄去表層物，檢查清晰度（不含影響判讀MIC終點(diǎn)的沉淀物）。用于微量肉湯稀釋試驗(yàn)，肉湯和LHB必須清晰。必要時(shí)離心。注意：用于微量肉湯稀釋法的馬凍融血有商業(yè)來(lái)源。2 培養(yǎng)基2.1強(qiáng)化布氏瓊脂1. 按下列配方配制布氏瓊脂粉末胰消化酪蛋白 10g動(dòng)物組織多肽消化物10g右旋糖1g酵母提取物2g氯化鈉5g亞硫酸鈉0.1g瓊脂15g1. 1,000mL蒸餾水中加入:布氏瓊脂粉末43g氯化血紅素貯存液1mL維生素K1工作液1mL1. 煮沸溶解瓊脂。

31、121高壓滅菌15分鐘。2. 培養(yǎng)基冷卻至48-50。3. 加入50mL滅菌脫纖維羊血。注意：不加入脫纖維羊血的培養(yǎng)基可以在試管或瓶子小體積分裝冷凍。試驗(yàn)時(shí)溶解培養(yǎng)基，冷卻至48-50。每100mL培養(yǎng)基加入5mL滅菌脫纖維羊血。2.2強(qiáng)化布氏肉湯1. 按下列配方配制布氏肉湯粉末胰消化酪蛋白 10g動(dòng)物組織多肽消化物10g右旋糖1g酵母提取物2g氯化鈉5g亞硫酸鈉0.1g1. 1,000mL蒸餾水中加入:布氏肉湯粉末28g氯化血紅素貯存液1mL維生素K1工作液1mL（3）煮沸溶解。121高壓滅菌15分鐘。（4）肉湯冷卻至4，加入100mL滅菌馬凍融血（50）。（5）4-8貯存。2.3 硫代硫酸

32、鹽營(yíng)養(yǎng)肉湯1. 1,000mL蒸餾水中加入不含指示劑的硫代硫酸鹽培養(yǎng)基 30g氯化血紅素貯存液1mL維生素K1工作液1mL1. 煮沸溶解瓊脂（硫代硫酸鹽肉湯含有少量瓊脂）。每管5mL分裝至試管中。2. 121高壓滅菌15分鐘。3. 避光貯存于常溫不超過(guò)六個(gè)月。4. 使用時(shí)煮沸五分鐘；冷卻。每管加入0.25mL濾過(guò)滅菌的碳酸氫鈉貯存液。5. 做為加入碳酸氫鈉替代品，高壓滅菌前每管可加入大理石碎片。2.4麥?zhǔn)蠞岫葮?biāo)準(zhǔn)（0.5號(hào)）1. 將0.5mL 0.048mol/L的BaCL2 (1.175%w/v BaCL2·2H2O)加到99.5mL 0.18mol/L（0.36N）的H2SO4(

33、1%v/v)中并不斷攪動(dòng)以維持混懸狀態(tài)。2. 按每管4-6mL將硫酸鋇懸液分裝于帶懸蓋的管子中，管子尺寸應(yīng)與培養(yǎng)或稀釋接種菌所用的管子一致。3. 這些管子應(yīng)密封并貯存于室溫避光處。4. 每次使用前，應(yīng)將濁度標(biāo)準(zhǔn)管置于旋轉(zhuǎn)混勻器上劇烈振動(dòng)，目測(cè)其外觀濁度應(yīng)均勻一致。若有大顆粒出現(xiàn)，此標(biāo)準(zhǔn)管應(yīng)更換。5. 使用前核實(shí)其正確濃度，每個(gè)月都應(yīng)證實(shí)或更換。濁度標(biāo)準(zhǔn)的正確濃度應(yīng)使用分光光度計(jì)測(cè)定吸光度核實(shí)。該分光光度計(jì)光徑為1cm，并配有合適的比色杯。0.5號(hào)麥?zhǔn)蠘?biāo)準(zhǔn)管在625nm處的吸光度值應(yīng)為0.08-0.10。注意：商業(yè)上可得到乳膠顆粒懸液制成的麥?zhǔn)戏止夤舛扔?jì)標(biāo)準(zhǔn)。使用時(shí)輕輕反轉(zhuǎn)混勻（而不是在旋轉(zhuǎn)混勻

34、器上）。表1:厭氧菌試驗(yàn)應(yīng)考慮的抗微生物藥推薦分組  脆弱擬桿菌菌群除脆弱擬桿菌菌群外革蘭氏陰性厭氧菌a除產(chǎn)氣莢膜梭菌外梭菌屬菌種產(chǎn)氣莢膜梭菌消化球菌屬無(wú)芽孢革蘭氏陽(yáng)性菌-內(nèi)酰胺酶b,c陽(yáng)性菌株-內(nèi)酰胺酶b陰性菌株首選氨芐西林/舒巴坦或阿莫西林/克拉維酸哌拉西林/三唑巴坦或替卡西林/克拉維酸（分離株對(duì)氨芐西林/舒巴坦和/或阿莫西林/克拉維酸耐藥時(shí)）氨芐西林/舒巴坦或阿莫西林/克拉維酸哌拉西林/三唑巴坦或替卡西林/克拉維酸（對(duì)氨芐西林/舒巴坦或阿莫西林/克拉維酸耐藥時(shí)）氨芐西林或青霉素c青霉素或氨芐西林c氨芐西林或青霉素c阿莫西林/克拉維酸或氨芐西林/舒巴坦哌拉西林/三唑巴坦

35、或替卡西林/克拉維酸克林霉素克林霉素頭孢西丁頭孢替坦頭孢西丁或頭孢替坦甲硝唑甲硝唑克林霉素克林霉素頭孢西丁或頭孢替坦亞胺培南或美羅培南亞胺培南或美羅培南克林霉素亞胺培南或美羅培南甲硝唑甲硝唑甲硝唑次選頭孢唑肟頭孢曲松頭孢唑肟頭孢曲松頭孢替坦或頭孢西丁或頭孢唑肟頭孢曲松頭孢唑肟頭孢曲松頭孢替坦或頭孢唑肟或頭孢西丁頭孢曲松氯霉素氯霉素哌拉西林或替卡西林或美洛西林哌拉西林四環(huán)素哌拉西林或替卡西林或美洛西林哌拉西林或替卡西林或美洛西林曲發(fā)沙星曲發(fā)沙星曲發(fā)沙星1. 包括擬桿菌屬其它菌種，普雷沃氏菌屬，卟啉單胞菌屬，梭桿菌屬，韋榮氏球菌屬，薩頓氏菌屬，嗜膽菌屬。2. -內(nèi)酰胺酶（發(fā)色頭孢菌素）3. 如果-

36、內(nèi)酰胺酶陽(yáng)性，報(bào)告青霉素和氨芐西林耐藥。表2:解釋標(biāo)準(zhǔn)和相對(duì)應(yīng)最低抑菌濃度（MIC）值（g/mL）抗微生物藥敏感中介耐藥阿莫西林/克拉維酸4/28/416/8氨芐西林0.512氨芐西林/舒巴坦8/416/832/16頭孢美唑163264頭孢哌酮163264頭孢噻肟163264頭孢替坦163264頭孢西丁163264頭孢唑肟3264128頭孢曲松163264氯霉素81632克林霉素248亞胺培南4816甲硝唑81632美羅培南4816美洛西林3264128青霉素0.512哌拉西林3264128哌拉西林/三唑巴坦32/464/4128/4四環(huán)素4816替卡西林3264128替卡西林/克拉維酸32/

37、264/2128/2曲發(fā)沙星248表3:制備抗微生物藥貯存液需要的溶劑和稀釋液b抗微生物藥溶劑稀釋液阿莫西林和替卡西林; 克拉維酸磷酸緩沖液，pH6.0，0.1mol/L磷酸緩沖液，pH6.0，0.1mol/L氨芐西林磷酸緩沖液，pH8.0，0.1mol/L磷酸緩沖液，pH6.0，0.1mol/L頭孢替坦二甲基亞砜水氯霉素95乙醇水甲硝唑二甲基亞砜水亞胺培南磷酸緩沖液，pH7.2，0.01mol/L磷酸緩沖液，pH7.2，0.01mol/L注意：所有貯存液應(yīng)置于-70或更低。融化后不應(yīng)重新冷凍。通常不適于貯存在無(wú)霜冷凍柜中。1. 這些溶劑和稀釋液用于制備抗微生物藥貯存液，這些藥物需要水以外的溶

38、劑。它們可以用水或肉湯進(jìn)一步稀釋。除腳注“b”外，可用水作溶劑或稀釋液的 藥物包括：羧芐西林，頭孢孟多，頭孢美唑，頭孢哌酮，頭孢噻肟，頭孢西丁，頭孢唑肟，頭孢曲松，克林霉素，美洛西林，青霉素，哌拉西林，哌拉西林/三唑巴 坦，四環(huán)素類(lèi)，曲發(fā)沙星和萬(wàn)古霉素。2. 以上未列出的所有其它頭孢霉素類(lèi)和頭霉素類(lèi)用pH6.0，0.1mol/L磷酸緩沖液（除非廠商有其它說(shuō)明），用滅菌蒸餾水進(jìn)一步稀釋。表4:瓊脂稀釋法或微量肉湯稀釋法敏感試驗(yàn)中抗微生物藥稀釋液的制備方案抗微生物藥稀釋液瓊脂或肉湯中1:10稀釋的最終濃度（g/mL）Log2步驟濃度(g/mL)來(lái)源體積（mL）蒸餾水(mL)中間濃度(g/mL)15120貯存液222560256825120貯存液131280128735120貯存液176406464640步驟3223203255640步驟3131601646640步驟3178083780步驟6224042880步驟6132021980步驟61710101010步驟92250.5-11110步驟9132.50.2