免疫組織化學(xué)技術(shù)

1、免疫組織化學(xué)技術(shù)免疫組織化學(xué)技術(shù)Immunohistochemistry, IHCImmunocytochemistry, ICC利用免疫學(xué)中利用免疫學(xué)中抗原與抗體特異性結(jié)合抗原與抗體特異性結(jié)合的特點的特點以及組織化學(xué)的原理，在組織或細胞標本中加入以及組織化學(xué)的原理，在組織或細胞標本中加入特定的特定的標記抗體標記抗體，然后對標記物進行顯示，從而，然后對標記物進行顯示，從而對組織或細胞內(nèi)的抗原物質(zhì)進行定性、定位或定對組織或細胞內(nèi)的抗原物質(zhì)進行定性、定位或定量研究。量研究。免疫酶技術(shù)顯示顯示Caspase-3免疫熒光技術(shù)顯示顯示MOR抗原：抗原：可被T、B細胞識別，并啟動特異性免疫應(yīng)答的物質(zhì)。即抗

2、原可作用于T、B細胞的抗原識別受體，促使其增殖、分化，產(chǎn)生免疫效應(yīng)物質(zhì)產(chǎn)生免疫效應(yīng)物質(zhì)（抗體或致敏淋巴細胞）并并與之結(jié)合與之結(jié)合，從而發(fā)揮免疫效應(yīng)?？乖膬煞N特性：抗原的兩種特性：免疫原性：免疫原性：即能刺激機體產(chǎn)生免疫應(yīng)答（產(chǎn)生特異性抗體或致敏T 細胞）；抗原性：抗原性：指能與其所誘生的抗體或致敏T細胞特異性結(jié)合。完全抗原完全抗原：同時具備免疫原性和抗原性半抗原半抗原： 只具備抗原性而不具備免疫原性抗原決定簇抗原決定簇或表位：或表位：決定抗原特異性的基本結(jié)構(gòu)或化學(xué)基團，是免疫應(yīng)答特異性的物質(zhì)基礎(chǔ)?？乖肿颖砻婺軌蚺c抗體結(jié)合的表位數(shù)量稱為抗原的價，完全抗原一般均為多價。共同抗原共同抗原：兩種不

3、同的抗原分子所具有的相同或相似的抗原決定簇稱為共同抗原或共同決定簇。親緣關(guān)系很近的生物之間的共同抗原稱為類屬抗原；抗體對具有相同或相似決定簇的不同抗原的反應(yīng)稱為交叉反應(yīng)交叉反應(yīng)。影響免疫原性的因素：影響免疫原性的因素：1.理化特性理化特性（大分子蛋白質(zhì)可含有大量不同的抗原決定簇，是強免疫原；多糖是重要的天然抗原，如細菌內(nèi)毒素脂多糖、血型抗原；核酸多無免疫原性，但與蛋白結(jié)合形成核蛋白則有免疫原性；多肽類激素如胰島素也有免疫原性）、分子量分子量（抗原的分子量一般10kD，且分子量越大，免疫原性越強）、結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性（免疫原性物質(zhì)還須具備復(fù)雜的化學(xué)組成與特殊的化學(xué)基團，如含大量芳香族氨基酸

4、）、分子構(gòu)象和抗原決定簇的易接近性分子構(gòu)象和抗原決定簇的易接近性等。2.宿主方面的因素：異種性異種性（“非已”異種、同種異體、自體抗原抗原來源與宿主關(guān)系越遠，免疫原性越強）、遺傳因素遺傳因素（個體差異）、年齡、性別與健康狀態(tài)。年齡、性別與健康狀態(tài)。3.抗原進入機體的方式：抗原的劑量抗原的劑量（低劑量和高劑量都不易引起免疫應(yīng)答）、進入機體的途徑進入機體的途徑（皮內(nèi)皮下肌肉 腹腔靜脈）、免疫次數(shù)免疫次數(shù)（強的免疫應(yīng)答需要多次注射）、佐劑佐劑（可先于抗原或同時與抗原混合注射動物，以增強抗原的免疫原性，即起輔佐抗原作用的物質(zhì)，如弗氏佐劑）。 抗體（antibody, Ab）機體免疫細胞被抗原激活后，由

5、分化成熟的終末B 細胞漿細胞合成、分泌的一類能與相應(yīng)抗原特異性結(jié)合的具有免疫功能的球蛋白。是介導(dǎo)體液免疫的重要效應(yīng)分子。典型的免疫球蛋白分子呈Y字型，由兩條相同的重鏈（heavy chain, H）和兩條相同的輕鏈（light chain, L）借二硫鍵連接而成。在氨基端，重鏈的1/4和輕鏈的1/2氨基酸序列變化很大，為可變區(qū)（variable region, V）；其他部分氨基酸序列相對恒定，為恒定區(qū)（constant region, C）。Fab即抗原結(jié)合片段抗原結(jié)合片段（fragment antigen binding），由一條完整的輕鏈和部分重鏈（VH和CH1）組成。該片段具有單價抗體

6、活性，能與一個相應(yīng)的抗原決定族特異性結(jié)合。Fc即可結(jié)晶片段可結(jié)晶片段（fragment crystalline），F(xiàn)c段含有兩條重鏈C端的一半，包含CH2和CH3兩個功能區(qū)，它無抗體活性。Ig在異種間免疫所具有的抗原性抗原性主要存在于Fc段，同時Fc段還具有活化補體、親細胞、通過胎盤和介導(dǎo)與細菌蛋白結(jié)合等生物學(xué)活性。用木瓜蛋白酶水解IgG分子，可將其裂解為兩個完全相同的Fab和一個Fc片段。 多克隆抗體多克隆抗體（polyclonal antibody, PcAb） 大多數(shù)天然抗原物質(zhì)(如細菌或其分泌的外毒素以及各種組織成分等)往往具有多種不同的抗原決定簇，而每一決定簇都可刺激機體產(chǎn)生一種特異

7、性抗體。多克隆抗體是多個抗原決定簇刺激機體后，由多個免疫淋巴細胞分泌的多種抗體的混多種抗體的混合物合物。 PcAb 特異性差，易出現(xiàn)交叉反應(yīng)。由單一克隆B細胞雜交骨髓瘤細胞產(chǎn)生的，只識別一種抗原表位的具有高度特異性的抗體。優(yōu)點：結(jié)構(gòu)均一、純度高、特異性強、效價高、易大量制備。制備單一表位特異性抗體的理想方法是獲得針對單一表位的漿細胞克隆，使其在體外擴增并分泌抗體。但漿細胞在體外的壽命較短，也難以培養(yǎng)。于是，將可產(chǎn)生特異性抗體但短壽的漿細胞與無抗原特異性但長壽的惡性漿細胞瘤細胞融合，建立了可產(chǎn)生單克隆抗體的雜交瘤細胞和單克隆抗體技術(shù)。 單克隆抗體單克隆抗體（monoclonal antibody

8、, McAb）免疫組織化學(xué)方法免疫組織化學(xué)方法熒光標記免疫組織化學(xué)熒光標記免疫組織化學(xué)酶聯(lián)免疫組織化學(xué)酶聯(lián)免疫組織化學(xué)直接法直接法：用酶或其他標記物標記的特異性抗體直接與標本中的相應(yīng)抗原結(jié)合，再與酶的底物作用產(chǎn)生有色產(chǎn)物，沉積在抗原抗體反應(yīng)的部位，即可對抗原進行定性、定位以至定量研究。Tissue AntigenLabeled Antibody間接法間接法：第一抗體不標記，使用與第一抗體種屬相同的抗體Fc段（有種屬特異性）作為抗原免疫動物，制備抗抗體，即第二抗體，并標記第二抗體。Tissue AntigenPrimary AntibodySecondary Antibody酶聯(lián)免疫組織化學(xué)酶聯(lián)

9、免疫組織化學(xué) ABC法法 S - P法法 親合素親合素生物素生物素過氧化物酶復(fù)合物法過氧化物酶復(fù)合物法（avidin-biotin-peroxidase complex method, ABC法）1. 生物素與親合素有很高的親和力2. 一個親合素分子上有四個生物素結(jié)合位點3. 將親合素作為“橋”將生物素化的抗體與生物素結(jié)合的酶連接起來，使抗原與抗體反應(yīng)信號放大，以增強敏感性鏈霉親合素鏈霉親合素生物素生物素過氧化物酶復(fù)合物法過氧化物酶復(fù)合物法（streptavidin-biotin-peroxidase complex method, SABC法） 此法為上述此法為上述ABC法的改良，是用法的改

10、良，是用鏈霉鏈霉親合素親合素（streptavidin）代替代替ABC法中法中的的親合素親合素（avidin）Streptavidin鏈霉親合素鏈霉親合素avidin親合素親合素鏈霉親合素為蛋白質(zhì)，非糖蛋白，鏈霉親合素為蛋白質(zhì)，非糖蛋白，不與其它分子結(jié)合，可降低背景。不與其它分子結(jié)合，可降低背景。親合素是糖蛋白，含有約親合素是糖蛋白，含有約7%的糖類，可與組織中含糖基的的糖類，可與組織中含糖基的物質(zhì)起反應(yīng)，造成背景著色。物質(zhì)起反應(yīng)，造成背景著色。鏈霉親合素鏈霉親合素- -過氧化物酶法過氧化物酶法（streptavidin peroxidase，S-P法）Streptavidin鏈霉鏈霉親合素親

11、合素酶標酶標鏈霉鏈霉親合素親合素鏈霉親合素對組織的穿透性強，反應(yīng)速度快；鏈霉親合素對組織的穿透性強，反應(yīng)速度快；鏈霉親合素的等電點接近中性（鏈霉親合素的等電點接近中性（5.56.7, 而親合而親合素為素為10左右），所帶負電荷少，不容易與組織中左右），所帶負電荷少，不容易與組織中的正電荷發(fā)生相互吸引，因此可降低背景著色；的正電荷發(fā)生相互吸引，因此可降低背景著色；S-P法的放大系統(tǒng)不含生物素，可免除內(nèi)源性生法的放大系統(tǒng)不含生物素，可免除內(nèi)源性生物素所造成的背景著色。物素所造成的背景著色。BCIPBCIP被AP水解成一種藍色的中間物，后者然后被NBT氧化形成二聚體（不溶性紫藍色沉淀）。 Doubl

12、e staining using DAB and BCIP/NBT 免疫組織化學(xué)技術(shù)的基本要求免疫組織化學(xué)技術(shù)的基本要求1、有高度特異性；、有高度特異性；2、有高度敏感性；、有高度敏感性；3、不引起受檢物質(zhì)的移位和丟失；、不引起受檢物質(zhì)的移位和丟失；4、不影響抗原和抗體的免疫活性；、不影響抗原和抗體的免疫活性；5、不損傷組織和細胞的本來結(jié)構(gòu)；、不損傷組織和細胞的本來結(jié)構(gòu)；6、免疫結(jié)合物借標記物明顯可見、免疫結(jié)合物借標記物明顯可見免疫組織化學(xué)標本的制備免疫組織化學(xué)標本的制備一、一、組織的固定組織的固定 1 1、目的：、目的： 固定抗原的定位固定抗原的定位 保存組織細胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)保存組織細胞的形態(tài)

13、結(jié)構(gòu) 2 2、常用固定劑和固定液：、常用固定劑和固定液： 甲醛、多聚甲醛、戊二醛等甲醛、多聚甲醛、戊二醛等 3 3、作用和缺點：作用和缺點： 固定組織和保存抗原固定組織和保存抗原 抗原易被掩蓋抗原易被掩蓋二、二、固定的方法固定的方法（一）方法：一）方法：推注推注，滴注滴注（二）（二）滴注滴注步驟：步驟： 1 1、開胸、開胸 2 2、暴露心臟、暴露心臟 3 3、自心尖剪開左心室、自心尖剪開左心室 4 4、插入灌流針至主動脈弓、插入灌流針至主動脈弓 5 5、固定灌流針、固定灌流針 6 6、快速注入沖洗液（有時可免）、快速注入沖洗液（有時可免） 7 7、先快后慢注入固定液、先快后慢注入固定液 8 8

14、、慢注畢，將動物裝入含慢注畢，將動物裝入含 有少量固定液的塑料袋有少量固定液的塑料袋 置置4 4C C冰箱內(nèi)靜置冰箱內(nèi)靜置2 2h h后取材后取材三、組織包埋和切片三、組織包埋和切片（一）（一）石蠟包埋切片石蠟包埋切片（二）恒冷箱切片（二）恒冷箱切片 （一）石蠟包埋切片（一）石蠟包埋切片（二）恒冷箱切片：（二）恒冷箱切片： 防冰晶防冰晶 1 1、驟凍、驟凍 2 2、1030%蔗糖溶液蔗糖溶液異異戊烷戊烷干冰干冰組織塊組織塊冰凍切片包埋模具配冰凍切片包埋模具配套套O.C.TO.C.T包埋劑使用包埋劑使用 免疫組織化學(xué)染色程序免疫組織化學(xué)染色程序以以ABC法法為例為例組織抗原組織抗原生物素生物素化

15、化二抗二抗ABC一抗一抗染色程序染色程序: 組織采用石蠟切組織采用石蠟切片或恒冷箱切片片或恒冷箱切片,片厚片厚510 m或者或者10 15 m 。 若若石蠟切片石蠟切片則脫則脫蠟到水蠟到水 1、 PBS漂洗漂洗, 10 min；染色程序染色程序: 2、 10 % NSS（或者（或者3%BSA）, 30 min； 3、 1%Triton X-100, 3%H2O2處理，處理，30 min; 4、 兔抗血清兔抗血清孵育過夜；孵育過夜； 4、 PBS漂洗漂洗, 3 5 min； 5、生物素化羊抗兔生物素化羊抗兔IgG 孵育孵育, 60 min； 6、PBS漂洗，漂洗，3 5 min；載玻片載玻片標簽

16、標簽組織組織切片切片生物素化生物素化二抗二抗生物素生物素染色程序染色程序: :7、 ABC復(fù)合物復(fù)合物孵育孵育, 60 min；8、 PBS漂洗漂洗, 3 5 min；9、 DABH2O2顯色液顯顯色液顯 色，至深棕色為止，色，至深棕色為止， 約約510 min； （DABH2O2 臨用前配制）臨用前配制）ABC標簽標簽組織組織切片切片ABC染色程序染色程序: :10、先后經(jīng)自來水沖洗、先后經(jīng)自來水沖洗 和雙蒸水浸洗；和雙蒸水浸洗；11、常規(guī)脫水、透明、常規(guī)脫水、透明、 樹膠封片。樹膠封片。 染色結(jié)果：染色結(jié)果：鏡下觀察。鏡下觀察。陰性對照試驗：陰性對照試驗： 1、常用空白試驗：即用稀釋常用空

17、白試驗：即用稀釋一抗一抗的稀釋液，的稀釋液， 如如10% NSS等，或等，或 PBS替代一抗，反應(yīng)應(yīng)呈陰性；替代一抗，反應(yīng)應(yīng)呈陰性；2、替代試驗：正常兔血清或替代試驗：正常兔血清或 正常羊血清代替正常羊血清代替兔抗血清兔抗血清或或羊抗兔羊抗兔IgG，反應(yīng)應(yīng)呈陰性；，反應(yīng)應(yīng)呈陰性；3、吸附試驗：吸附試驗：一抗血清一抗血清經(jīng)相經(jīng)相 應(yīng)抗原預(yù)吸附處理后孵育組織應(yīng)抗原預(yù)吸附處理后孵育組織切片，反應(yīng)應(yīng)呈陰性。切片，反應(yīng)應(yīng)呈陰性。細胞離心涂片機是利用液動與氣動原理,將收集的細胞樣本進行了細胞分散,過濾從其混懸液中分離出來,均勻的噴涂在玻片上。免疫組織化學(xué)方法成功與否關(guān)鍵在于抗原決免疫組織化學(xué)方法成功與否關(guān)

18、鍵在于抗原決定簇的保存和暴露。組織經(jīng)甲醛固定，甲醛定簇的保存和暴露。組織經(jīng)甲醛固定，甲醛的醛基與抗原蛋白的氨基交聯(lián)，使抗原決定的醛基與抗原蛋白的氨基交聯(lián)，使抗原決定簇被掩蓋，從而影響對蛋白表達的檢測。要簇被掩蓋，從而影響對蛋白表達的檢測。要充分暴露抗原決定簇，通常用到抗原修復(fù)。充分暴露抗原決定簇，通常用到抗原修復(fù)。加熱抗原修復(fù)法加熱抗原修復(fù)法 酶消化法酶消化法Steaming temperature between 95 C - 98 C which is optimal for most of antigens. set the Timer for 40 minutes that is su

19、fficient for retrieving most antigens (some antigens need longer steaming time so optimal steaming time should be determined by user). IHC-TekTM Epitope Retrieval Steamer Set Heat-induced Epitope Retrieval (HIER)HIER is believed to reverse some cross-links and allows for restoration of secondary or

20、tertiary structure of the epitope. The protocol must be optimized for each tissue, fixation method, and antigen to be studied. In general, HIER has a much higher success rate than PIER. HIER is performed using microwave ovens, pressure cookers, vegetable steamers, autoclaves, or water baths. Microwa

21、ves are an increasingly popular appliance for HIER. These protocols tend to involve 5 minute periods of heat followed by replacement of the buffer. For all HIER methods, slides must be cooled before commencing IHC/ICC incubations. HIER is especially time-, temperature-, buffer-, and pH-sensitive, an

22、d the best method must be determined empirically.R&D Systems offers reagents to improve tissue antigen detection and enhance immunoreactivity. During initial optimization, investigators can compare samples treated with neutral pH 7.0 Universal Antigen Retrieval Solution (Catalog # CTS015) with a

23、 slide of the same tissue without antigen retrieval. Subsequent tests using acidic or basic antigen retrieval solutions may be necessary depending on the tissue. At R&D Systems, we find that treatment with Basic Antigen Retrieval reagent (pH 9.5, Catalog # CTS013) is frequently successful. We al

24、so offer Acidic (pH 5.0, Catalog # CTS014) and Sampler (Catalog # CTS016) Antigen Retrieval Reagents. Acidic and basic antigen retrieval solutions are more likely to affect tissue morphology than a neutral solution.The time, temperature, and pH must also be optimized for each appliance (i.e. 5-10 mi

25、nutes at 92-95 C in a water bath, versus 1-5 minutes at 120 C in a pressure cooker). Protease-induced Epitope Retrieval (PIER)In the PIER method, enzymes including Proteinase K, Trypsin, and Pepsin have been used successfully to restore the binding of an antibody to its epitope. The mechanism of act

26、ion is thought to be the cleavage of peptides that may be masking the epitope. The disadvantages of PIER are the low success rate for restoring immunoreactivity and the potential for destroying both tissue morphology and the antigen of interest. 二、出現(xiàn)假陽性的原因二、出現(xiàn)假陽性的原因 組織切片質(zhì)量不佳，造成假象，如組織切片質(zhì)量不佳，造成假象，如 刀痕

27、裂縫邊緣的組織著色過深，不能作刀痕裂縫邊緣的組織著色過深，不能作 為判斷陽性的依據(jù)。為判斷陽性的依據(jù)。 出血和壞死：紅細胞的內(nèi)源性過氧出血和壞死：紅細胞的內(nèi)源性過氧 化物酶，壞死細胞釋放的內(nèi)源性過氧化化物酶，壞死細胞釋放的內(nèi)源性過氧化 物酶均可出現(xiàn)假陽性反應(yīng)。物酶均可出現(xiàn)假陽性反應(yīng)。 抗體的交叉反應(yīng)?？贵w的交叉反應(yīng)。pretreatment免疫熒光組織化學(xué)技術(shù)免疫熒光組織化學(xué)技術(shù)將熒光作為標記物的免疫組織化學(xué)技術(shù)將熒光作為標記物的免疫組織化學(xué)技術(shù)熒光（fluorescence） 當某種常溫物質(zhì)經(jīng)某種波長的入射光入射光（通常是紫外線或X射線）照射，吸收光能后進入激發(fā)態(tài)，并且立即退激發(fā)并發(fā)出比入射

28、光的的波長長的出射光出射光（通常波長在可見光波段）；而且一旦停止入射光，發(fā)光現(xiàn)象也隨之立即消失。具有這種性質(zhì)的出射光就被稱之為熒光。 光的吸收具有高度選擇性光的吸收具有高度選擇性，一定能量的光量子輻射，只能被一定結(jié)構(gòu)的物質(zhì)分子或原子所吸收。利用該特性，制作濾光片吸收一定波長范圍的光而允許特定波長的光通過，用來激發(fā)不同的熒光素，產(chǎn)生不同顏色的熒光。激發(fā)光激發(fā)光發(fā)射光發(fā)射光許多物質(zhì)都可產(chǎn)生熒光現(xiàn)象，但并非都可用許多物質(zhì)都可產(chǎn)生熒光現(xiàn)象，但并非都可用作熒光素。只有那些能夠吸收特定波長的光作熒光素。只有那些能夠吸收特定波長的光并能在較短時間內(nèi)產(chǎn)生明顯的熒光，而且能并能在較短時間內(nèi)產(chǎn)生明顯的熒光，而且能作為染料的化合物才能用于免疫熒光技術(shù)。作為染料的化合物才能用于免疫熒光技術(shù)。FITCTRITC一、直接法直接法（一）（一）抗原直接定位法抗原直接定位法熒光標記的抗體熒光標記的抗體組織中的抗原組織中的抗原一、直接法直接法（二）（二）抗體直接定位法抗體直接定位法熒光標記的抗原熒光標記的抗原組織中的抗體組織中的抗體二、間接法間接法（一）（一）抗原間接定位法抗原間接定位法熒光標記的第二抗體熒光標記的第二抗體 （二抗）（二抗）組織中的抗原組織中的抗原第一抗體（一抗）第一抗體（一抗）二、二、間接法間接法（二）（二）抗體間