《陳新-生理科學(xué)實驗教學(xué)資料》2a班-陳新-實驗21

1、專業(yè)：臨床醫(yī)學(xué)(七年制) 姓名： 陳新學(xué)號： 3090103916實驗報告日期：2012年月日地點：醫(yī)學(xué)院教學(xué)樓課程名稱：生理科學(xué)實驗實驗類型： 動物實驗 實驗名稱：肝腎功能對藥物作用的影響 同組學(xué)生姓名： 黃婷沈童指導(dǎo)老師： 工夢令肝腎功能對藥物作用的影響陳新 沈童黃婷(浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院生理科學(xué)實驗2a笫8組，浙江 杭州310058)摘要目的：了解藥動學(xué)研究的方法學(xué)及肝臟、腎臟在藥物代謝中重要性。觀察小白鼠肝 功能損傷對硫噴妥鈉(sodium thiopental)的作用的影響。觀察家兔腎功能損失對靜脈注 射苯酚磺釀(phenolsulfonphthalein, psp)在體內(nèi)代謝規(guī)律的影響。

2、學(xué)習(xí)藥動學(xué)參數(shù)的計 算方法。方法：制造肝損傷小鼠模型，腹腔注射硫噴妥鈉麻醉，與正常小鼠對比觀察肝功能 損傷對其作用效果的影響。制作腎損傷家兔模型，靜脈注射psp,與正常家兔對比觀察腎功 能損失對英體內(nèi)代謝規(guī)律的影響，并計算相關(guān)藥動學(xué)參數(shù)。結(jié)果：注射等量硫噴妥鈉后，正 常小鼠的翻正反射消失時間為1.67±0. 82分鐘，恢復(fù)時間為10. 15±4. 45分鐘；肝功能損 傷小鼠的翻正反射消失時間為2. 32±0. 75分鐘，恢復(fù)時間為41.37±24. 59分鐘。肝功能正 常小鼠翻正反射恢復(fù)時間明顯短于肝功能損傷小鼠(p0.05)。正常家兔的消除速率常數(shù)k

3、為0. 066±0. 034min_,腎損傷家兔為0. 022±0. 004min_,o正常家兔的消除速率常數(shù)顯著大 于腎損傷家兔(p<0.05)。正常家兔的消除半衰期t“2為12. 339±4. 862min，腎損傷家兔為 31.932±6. 752mino正常家兔的消除半衰期顯著小于腎損傷家兔(p0.05)。正常家兔的清 除率 cl 為 0. 004±0. 001 ml/(kg min),腎損傷家兔為 0. 002±0. 000ml/(kg min) o 正常 家兔的清除率顯著大于腎損傷家兔(p0.05)。結(jié)論：肝臟、腎臟損

4、傷對以相應(yīng)代謝途徑代 謝的藥物有藥代動力學(xué)抑制作用0關(guān)鍵詞藥物動力學(xué)；肝損傷；硫噴妥鈉；腎損傷；苯酚磺瞅；肝臟的生物轉(zhuǎn)化是巴比妥類藥物消除的主要方式之一。硫噴妥鈉是脂溶性極高的巴比妥 類藥物，血漿蛋白結(jié)合率高，由腎小球濾過較少，也易被腎小管再吸收，其主要消除方式由 肝藥酶代謝。因此，肝臟損傷極易使硫噴妥鈉的生物轉(zhuǎn)化受阻，影響藥物代謝過程。psp靜 脈注射后迅速分布全身，其血漿濃度與各組織器官的濃度z間保持動態(tài)平衡，此時整個機(jī)體可視 作單一房式，即一室模型。在對腎功能損傷的動物模型給藥后不同時間取血測定血藥濃度，依血 藥濃度與時間關(guān)系可以計算出相關(guān)的藥動學(xué)參數(shù)，從而觀察腎臟損傷對藥物代謝的影響&

5、#176;。1材料和方法1. 1實驗動物小白鼠20只，家兔10只1.2試劑4g/l硫噴妥鈉溶液，10%四氯化碳，6g/l psp溶液，60g/l升汞溶液，200g/l氨 基甲酸乙酯，ttc稀釋液，10g/l肝素鈉1.3器材7200數(shù)字型分光光度計，高速離心機(jī)1.4損傷模型的制備1.4.1肝臟損傷模型 試驗前24小時用10%四氯化碳0.加l/10g皮下注射，損傷小鼠肝功能。1. 4. 2腎臟損傷模型實驗前48小時給家兔皮下注射60g/l升汞溶液0. 2ml/kg,至實驗開始 吋該兔的腎功能已受相當(dāng)損害，此即腎功能受損兔。1.5小鼠給藥及觀察取體重相近的正常及肝功能已損傷小鼠各一只，稱體重，以苦味

6、酸溶 液作好標(biāo)記。試其翻正反射是否存在。確認(rèn)存在后，按0. lml/10g（40mg/kg）劑量腹腔注射 4g/l硫噴妥鈉溶液。觀察并記錄小鼠翻正反射消失時間及恢復(fù)時間。頸椎脫臼法處死小鼠 后，檢查其肝臟的形態(tài)改變。1.6家兔頸總動脈插管取腎功能正常及腎功能受損的家兔各1只，稱重后用200g/l氨基甲 酸乙酯依照lg/kg體重劑量進(jìn)行靜脈麻醉，腎功能受損家兔麻藥劑量減至2/3。兔麻醉后用 背位固定于兔板，切開頸部皮膚，分離肌層，暴露頸動脈，并游離約3-4cm長，結(jié)扎遠(yuǎn)心端, 用動脈夾夾閉近心端，在靠近結(jié)扎的部位用眼科手術(shù)剪在動脈壁上剪一 “v”形小切口，插 入動脈插管，結(jié)扎固定。取血時松開動脈

7、夾即可。1. 7取血從耳緣靜脈注射10g/l肝素鈉lml/kg,在另一側(cè)耳緣靜脈按照0. 5ml/kg體重注 射6g/l psp溶液。注射后第2、5、10、15、20、25分鐘分別從頸動脈取血2ml,每次取血 前將導(dǎo)管內(nèi)的殘血排凈，置于刻度試管內(nèi)，離心10分鐘（2000轉(zhuǎn)/分）后取血漿0. 2ml,置于 另一試管，加稀釋液3ml搖勻待測定。1.8 psp血漿濃度計算以7200分光光度計在波長520nm處測定psp含量。先用稀釋液調(diào) 零，然后測定稀釋血漿的吸光度。將測到的吸光度乘以8.13（實驗室已利用不同濃度的psp 標(biāo)準(zhǔn)液計算吸光度與psp濃度的線性關(guān)系，得到吸光系數(shù)d二& 13）,

8、再乘稀釋倍數(shù)16,即為 psp的血漿濃度。1.9藥動學(xué)參數(shù)計算將不同時間點的psp血漿濃度換算成ing o將時間t作為x, ing作 為y,進(jìn)行直線回歸分析法，求得截距(a二ing)及斜率(b二-k),再根據(jù)公式計算初始血藥 濃度c。、消除速率常數(shù)k、消除半衰期“2、表觀分布容積£和清除率cl。相關(guān)公式：inct =kxt + incoco(mg/ml) =ln lak(min ') =-bti/2 (min) =0. 693/kv(1 (ml/kg) =a(mg/kg) /co (ml/l)cl (ml/kg/min) =kx vd1. 10參數(shù)設(shè)置 離心機(jī)轉(zhuǎn)速2000r/

9、min,離心時間lomin。1. 11數(shù)據(jù)處理 數(shù)據(jù)用excel統(tǒng)計，結(jié)果用x±s表示，并用t-test進(jìn)行顯著性檢驗， p<0. 05表示差異顯著，圖用graphpad prism 5處理。2結(jié)果2. 1肝功能對藥物作用的影響對正常小鼠和肝損傷小鼠注射等量硫噴妥鈉后，正常小鼠的翻正反射消失時間為1.67 ±0. 82分鐘，翻正反射恢復(fù)吋間為10. 15±4.45分鐘；肝功能損傷小鼠的翻正反射消失時 間為2. 32±0. 75分鐘,翻正反射恢復(fù)時間為41. 37±24. 59分鐘。肝功能正常小鼠翻正反射 恢復(fù)時間明顯短于肝功能損傷小鼠的翻

10、正反射恢復(fù)時間(p<0. 05)。表1硫噴妥鈉誘導(dǎo)正常小鼠與肝功能受損小鼠麻醉維持時間的比較組別劑量(mg/kg)動物只數(shù)(只)翻正反射消失時間翻正反射恢復(fù)時間正常小鼠40101.67±0. 8210. 15±4. 45肝損小鼠40102. 32 ±0. 7541.37±24. 59*： p<0. 05 vs.正常小鼠翻正反射恢復(fù)時間2. 2 psp血漿濃度及相關(guān)參數(shù)家兔靜脈注射psp后不同時間的血漿濃度、吸光度、psp對數(shù)血漿濃度見表2, psp對數(shù)血漿濃度與時間的關(guān)系曲線見圖1.正常家兔*腎損家兔051015202530qmfti）圖1

11、psp對數(shù)血漿濃度一吋問曲線表2家兔靜脈注射psp后不同時間的血漿濃度取血時間（min）參數(shù)正常家兔腎損傷家兔251015202525101520250. 3500. 2990. 1550. 1150. 0920. 0790. 2430.2180. 2000. 1860. 1640. 140吸光度（a）+0.2120. 2230. 0500.0160.0180. 0200. 0210. 0250. 0250. 0280.0100. 006血漿psp45. 553& 8720. 1614. 9611.9710.2131. 5428. 3625. 9524. 2321. 331&2

12、5濃度+(nig/m 1 )27. 5829. 046. 562. 212.352.612. 793. 273. 303. 581.250. 723. 713. 502.972.702.472.303.453. 343.253. 183. 062. 90lnc(y)+0. 480. 560. 290. 140.210. 250. 090. 110. 120. 140. 060. 042. 3藥動學(xué)參數(shù)通過藥動學(xué)公式計算，正常家兔的消除速率常數(shù)k為0. 066±0. 034min=腎損傷家兔的消除速率常數(shù)k為0.022±0.004niir?。正常家兔的消除速率常數(shù)顯著大于腎損

13、傷家兔（p<0. 05）。正常家兔的消除半衰期t“2為12. 339±4. 86加in,腎損傷家兔的消除半衰期tl/2為31.932±6. 752min0正常家兔的消除半衰期顯著小于腎損傷家兔（p<0.05）。正常家兔的表觀分布容積£為0. 076 ± 0. 030ml/kg，腎損傷家兔的表觀分布容積x為0. 093 土0.012ml/kgo正常家兔的表觀分布容積與腎損傷家兔無顯著性差異(p>0.05)。正常家兔的清除率cl為0.004 ±0.001 ml/(kgmin),腎損傷家兔的清除率cl為0. 002 土0. 000m

14、l/(kg - min) o正常家兔的清除率顯著大于腎損傷家兔(p<0. 05)o表3 正常家兔與腎功能受損家兔的藥動學(xué)參數(shù)比較正常家兔腎損傷家兔k (min ')0. 066±0. 0340. 022 ±0. 004*ti/2 (min)12. 339±4. 86231.932±6. 752*vd(ml/kg)0. 076±0. 0300. 093±0. 012cl ml/(kg min)0. 004 ±0. 0010. 002 ±0. 000*： p<0. 05 vs.正常家兔3討論3. 1

15、肝損傷對藥物作用的影響本實驗中使用的藥物硫噴妥鈉是巴比妥類鎮(zhèn)靜催眠藥物的一種，作用維持時效為超短 效，其脂溶性極高，可迅速分布于全身組織、體液，可通過胎盤和血腦屏障。該藥物進(jìn)入腦 組織后激活gaba受體，以達(dá)到中樞鎮(zhèn)靜催眠作用。此后迅速自腦組織再分布至外周脂肪組 織，中樞作用解除。因其血漿蛋白結(jié)合率高，腎小球濾過較少，又易被腎小管重吸收，主要 在肝臟屮以肝藥酶代謝消除。翻正反射是常用的檢驗實驗動物麻醉程度或疲勞程度的方法。本實驗中小鼠的翻正反射 消失吋間代表的是藥物分布至腦組織，產(chǎn)生中樞催眠作用的吋間。正常小鼠與肝損傷小鼠的 翻正反射消失時間并不具有顯著性(p0.05),表明肝臟損傷對于藥物擴(kuò)

16、散至腦組織的過程 沒有影響。實驗屮記錄的小鼠翻正反射恢復(fù)時間表示藥物作用的持續(xù)時間，肝功能正常小鼠 翻正反射恢復(fù)時間明顯短于肝功能損傷小鼠的翻正反射恢復(fù)時間(p0.05)。表明肝臟損傷 嚴(yán)重影響了肝臟對硫噴妥鈉的生物代謝過程，使藥物的作用時間增長。以注射cch方法損傷小鼠肝臟，受損肝臟在形態(tài)學(xué)上表現(xiàn)為肝細(xì)胞腫脹，小葉內(nèi)出現(xiàn)大量壞死等，炎細(xì)胞浸潤嚴(yán)重，有廣泛的肝細(xì)胞壞死。實驗后解剖兩小鼠肝臟對比觀察可見, 正常小鼠肝臟呈暗紅色，表面光滑；肝損小鼠肝臟呈灰褐色，表面有較強(qiáng)的顆粒感。3.2腎損傷對藥物作用的影響本實驗中制作腎損傷模型時使用了升汞溶液，即氯化汞。注射氯化汞后，腎組織小過氧 化酯（lpo

17、）升高，并具有劑量-效應(yīng)關(guān)系。脂質(zhì)過氧化對缺血、缺氧、屮毒、炎癥以及衰老、 吞噬殺菌等生理過程都起著重耍作用。氯化汞引起腎臟內(nèi)鈣濃度顯著升高，可達(dá)正常值的 3-4倍，與血清3和bun及腎臟lpo值升高呈正相關(guān)，同時引起了小鼠腎臟中鐵、鋅、銅 含量的明顯升高，具有一定腎臟毒性。在藥物代謝動力學(xué)中，消除速率常數(shù)指單位時間內(nèi)消除藥物的分?jǐn)?shù)，其數(shù)值反映了藥物 在體內(nèi)的消除速率；消除半衰期指血漿中藥物濃度下降一半所需的時間，反映藥物消除快慢 的程度及轉(zhuǎn)運轉(zhuǎn)化的關(guān)系；表觀分布容積指理論上藥物均勻分布應(yīng)占有的體液容積，反映藥 物在血漿及組織器官中的分布狀況；清除率指單位時間內(nèi)多少毫升血漿中的藥物被消除，是 各種消除途徑的總和。本實驗中psp靜脈注射后迅速分布全身，其血藥濃度與各組織器官的濃度之間保持動態(tài) 平衡，此時整個機(jī)體可視作一室模型。根據(jù)實驗數(shù)據(jù)繪制圖1,觀察可知psp的對數(shù)血漿濃 度一時間曲線為線性關(guān)系，符合一級動力學(xué)規(guī)律。通過藥動學(xué)公式計算可知，正常家兔的消 除速率常數(shù)顯著大于腎損傷家兔（p0.05）。從圖1可觀察到腎損傷家兔對數(shù)血漿濃度一時 間曲線斜率小于正常家兔。正常家兔的消除半衰期顯著小于腎損傷家兔（p0.