2019年蛋白質(zhì)工程論文

1、蛋白質(zhì)工程學(xué)末論文學(xué)院：班級(jí)姓名學(xué)號(hào)生命與地理科學(xué)學(xué)院： 10 級(jí)生物工程 ：吉毛措： 20101911242目錄摘要、關(guān)鍵詞 3英文翻譯 41. 蛋白質(zhì)工程 51.1 蛋白質(zhì)工程的誕生 51.2 蛋白質(zhì)工程的概述 52. 蛋白質(zhì)工程的應(yīng)用抗體工程 62.1 抗體工程的研究現(xiàn)狀和發(fā)展前景 7（1）多克隆抗體 7（ 2）單克隆抗體（雜交瘤技術(shù)） 10（3）基因工程抗體 （人源化抗體 ）173. 抗體融合蛋白 213.1 免疫毒素 183.2 基因工程抗體酶融合蛋白 213.3 基因工程抗體細(xì)胞因子融合蛋白 224. 注釋235. 參考文獻(xiàn) 23蛋白質(zhì)工程在抗體工程方面的應(yīng)用與發(fā)展摘要：蛋白質(zhì)工程

2、是在基因重組技術(shù)、 生物化學(xué)、 分子生物學(xué)、 分子遺傳學(xué)等學(xué)科的基礎(chǔ)之 上，融合了蛋白質(zhì)晶體學(xué)、 蛋白質(zhì)動(dòng)力學(xué)、 蛋白質(zhì)化學(xué)和計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)等學(xué)科而發(fā)展起來(lái) 的綜合性研究鄰域。 蛋白質(zhì)工程的出現(xiàn)， 為認(rèn)識(shí)和改造蛋白質(zhì)分子提供了強(qiáng)有力的手段， 在 揭示蛋白質(zhì)形成和功能表達(dá)的關(guān)系研究中發(fā)揮了重要作用。 它不僅可以帶動(dòng)生物技術(shù)進(jìn)一步 發(fā)展， 還可以推動(dòng)與人類生產(chǎn)、 生活關(guān)系密切的相關(guān)科學(xué)的發(fā)展。 已有研究表明， 蛋白質(zhì)工 程在醫(yī)藥、 工業(yè)、 農(nóng)業(yè)等各行各業(yè)中均具有廣闊的應(yīng)用前景。 隨著蛋白質(zhì)工程研究對(duì)象的擴(kuò) 大和技術(shù)的成熟， 其應(yīng)用領(lǐng)域也將不斷拓寬。 本論文就以抗體工程中單克隆抗體、 多克隆抗 體、

3、基因工程抗體等的研究現(xiàn)狀和抗體融合蛋白、 雜交瘤技術(shù)、 人源化抗體等為例介紹蛋白 質(zhì)工程的應(yīng)用情況和發(fā)展概況。關(guān)鍵詞：?jiǎn)慰寺】贵w 多克隆抗體 基因工程抗體 抗體融合蛋白 雜交瘤技術(shù) 人源化抗體Application and development of protein engineering in antibody engineeringAbstract:Protein engineering is the basis of recombinant DNA technolog y, biochemistry,molecular biology,molecular genetics and ot

4、her disciplines,the fusion protein crystallography, protein dynamics, protein chemistry and other disciplines as computer-ai ded design and develop a comprehensive research neighborhood.The emergence of protein engineering, in order to understan d and transform the protein molecules provides a power

5、ful in strument, played an important role in the study of the rela tionship between to reveal protein formation and functional e xpression. It can not only drive the further development of biotechnology, can also promote the development of science and human production and life are closely related. S

6、tudies h ave shown that protein engineering has broad prospects for a pplication in medicine, industry, agriculture and other indust ries. With the expansion of the object of protein engineerin g and technology mature, will also continue to broaden its applications. The papers on antibody engineerin

7、g monoclonal an tibodies, polyclonal antibodies, genetically engineered antibodyResearch and antibody fusion protein, hybridoma technology, humanized antibodies, for example to introduce the applicationof protein engineering and development overview.Keywords:Monoclonal antibodies polyclonal antibodi

8、es genetically engineer ed antibody antibody fusion protein hybridoma technique humani zed antibody.1.蛋白質(zhì)工程定義：是研究蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)規(guī)律與生物學(xué)功能的關(guān)系， 對(duì)現(xiàn)有蛋白質(zhì)加以定 向修飾改造、設(shè)計(jì)和剪切，構(gòu)建生物學(xué)功能比天然蛋白質(zhì)更加優(yōu)良的新型蛋白。 從預(yù)期功能出發(fā)， 設(shè)計(jì)期望結(jié)構(gòu)、 合成目的基因并有效表達(dá)或通過(guò)定向誘變、 定 向修飾和改造等一系列工序，合成優(yōu)良蛋白。1.1 蛋白質(zhì)工程的誕生我們知道生物產(chǎn)生的天然蛋白質(zhì)是在長(zhǎng)期進(jìn)化過(guò)程中產(chǎn)生的， 它的結(jié)構(gòu)性 能已經(jīng)不能完全滿足人類生產(chǎn)生活的

9、需要。例如：干擾素是一種動(dòng)物體內(nèi)的 抗病毒、抗腫瘤的藥物蛋白，但在體外保存相當(dāng)困難，以及其需求量日益增 加。于是我們要對(duì)現(xiàn)有的蛋白質(zhì)進(jìn)行改造， 制造出目前從天然蛋白質(zhì)中找不到 的蛋白質(zhì)來(lái)滿足人類生產(chǎn)和生活的需要。這樣人們就開(kāi)始了新一輪的探索， 蛋白質(zhì)工程應(yīng)運(yùn)而生了。早在 80 年代初美國(guó) Genex 公司 K. U lm er 第一次提出蛋白質(zhì)工程概念 并建立了專門(mén)研究實(shí)體 , 制定了相應(yīng)研究開(kāi)發(fā)計(jì)劃。其后 ,以美國(guó)為首的幾家 生物技術(shù)公司同時(shí)應(yīng)用蛋白質(zhì)工程技術(shù)得到幾種蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu) , 標(biāo)志著蛋白質(zhì) 工程正式誕生。1.2 蛋白質(zhì)工程的概述目標(biāo)：根據(jù)人們對(duì)蛋白質(zhì)功能的特定需求， 對(duì)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)進(jìn)行

10、分子設(shè)計(jì) 蛋白質(zhì)工程的原理：基因改造 基本途徑：從預(yù)期的蛋白質(zhì)功能出發(fā)設(shè)計(jì)預(yù)期的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)推測(cè)應(yīng)有的氨基酸序列找到相對(duì)應(yīng)的脫氧核苷酸序列（基因） 蛋白質(zhì)工程的流程：（如下圖）SB lti-1 愛(ài)自質(zhì)工程的遵程3. 蛋白質(zhì)工程的應(yīng)用一一抗體工程抗體不僅在哺乳動(dòng)物機(jī)體中擔(dān)負(fù)著重要的體液免疫功能 ，還在醫(yī)學(xué)、生物學(xué) 免疫診斷中被廣泛地應(yīng)用。本世紀(jì)證明了抗體是一類免疫球蛋白，并相繼闡明了 抗體產(chǎn)生及其多樣性的細(xì)胞和分子機(jī)制，使免疫學(xué)研究成為生命科學(xué)前沿領(lǐng)域。CHO木呱蛋白的fnt【社Porter等對(duì)血清IgG抗體的研究證明，lg分子的基本結(jié)構(gòu)是由四肽鏈組。即由二條相同的分子量較小的肽鏈稱為輕鏈和二條相

11、同的分子量較大的肽鏈稱 為重鏈組成的。輕鏈與重鏈?zhǔn)怯啥蜴I連接形成一個(gè)四肽鏈分子稱為Ig分子的單體，是構(gòu)成免疫球蛋白分子的基本結(jié)構(gòu)。Ig單體中四條肽鏈兩端游離的 氨基或羧基的方向是一致的，分別命名為氨基端（N端）和羧基端（C端）。Ig分子 酶水解片段示意圖 隨著生命科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，抗體的制備技術(shù)也經(jīng)歷著一次又一次革命，由血清抗 體到雜交瘤單克隆抗體，再到基因工程抗體庫(kù)技術(shù)，可謂日新月異。下面主要是 介紹雜交瘤單抗克隆技術(shù)，以及其遇到的問(wèn)題是如何通過(guò)蛋白質(zhì)工程加以解決 的。2.1抗體工程的研究現(xiàn)狀和發(fā)展前景（1）多克隆抗體（polyclonal antibody）:抗原刺激機(jī)體，產(chǎn)生免疫學(xué)反應(yīng)，

12、由機(jī)體的漿 細(xì)胞合成并分泌的與抗原有特異性結(jié)合能力的一組球蛋白，這就是免疫球蛋白，這種與抗原有特異性結(jié)合能力的免疫球蛋白就是抗體?？乖ǔＪ怯啥鄠€(gè)抗原決定簇組成的，由一種抗原決定簇刺激機(jī)體，由一 個(gè)B淋巴細(xì)胞接受該抗原所產(chǎn)生的抗體稱之為單克隆抗體（Moncloneantibody ）。由多種抗原決定簇刺激機(jī)體，相應(yīng)地就產(chǎn)生各種各樣的單克 隆抗體，這些單克隆抗體混雜在一起就是多克隆抗體，機(jī)體內(nèi)所產(chǎn)生的抗 體就是多克隆抗體；除了抗原決定簇的多樣性以外，同樣一類抗原決定簇， 也可刺激機(jī)體產(chǎn)生 IgG、IgM、IgA、IgE和IgD等五類抗體。抗原上那部分可以引起機(jī)體產(chǎn)生抗體的分子結(jié)構(gòu)，叫做抗原決定簇

13、。一個(gè)抗原上可以有好幾個(gè)不同的抗原決定簇，因而使機(jī)體產(chǎn)生好幾種不同 的抗體，最終產(chǎn)生出抗體是漿細(xì)胞。只針對(duì)一個(gè)抗原決定簇起作用的漿細(xì) 胞群就是一個(gè)純系，純系的英文為Clone，音譯就是克隆。由一種克隆產(chǎn)生的特異性抗體叫做單克隆抗體。單克隆抗體能目標(biāo)明確地與單一的特異抗 原決定簇結(jié)合，就象導(dǎo)彈精確地命中目標(biāo)一樣。另一方面，即使是同一個(gè) 抗原決定簇，在機(jī)體內(nèi)也可以由好幾種克隆來(lái)產(chǎn)生抗體，形成好幾種單克 隆抗體混雜物，稱為多克隆抗體。多克隆抗體又簡(jiǎn)稱多抗。與之相對(duì)應(yīng)的叫單克隆抗體，簡(jiǎn)稱單抗?？乖瓬?zhǔn)備 概述可以作為抗原的物質(zhì)有很多種，一般的科研實(shí)驗(yàn)中，經(jīng)常使用的抗原 有：偶聯(lián)多肽、偶聯(lián)的小分子或化合物

14、、天然或重組蛋白等等。對(duì)可溶性抗原而言，為了增強(qiáng)其免疫原性或改變免疫反應(yīng)的類型、節(jié) 約抗原等目的，常采用加佐劑的方法以刺激機(jī)體產(chǎn)生較強(qiáng)的免疫應(yīng)答。佐劑應(yīng)用1 佐劑的類型目前實(shí)踐中常應(yīng)用的佐劑有氫氧化鋁膠、明磯、弗氏佐劑、脂質(zhì)體和石蠟油等。也有米用結(jié)合桿菌等分枝桿菌、白喉?xiàng)U菌以及細(xì)小棒狀桿菌等。弗氏不完全佐劑(in complete Freun d's adjuva nt,IFA)羊毛脂1份石蠟油5份混合，高壓滅菌后保存。用時(shí)加熱融化，冷卻至50C左右，加抗原進(jìn)行乳化處理。(2) 弗氏完全佐劑(complete Freu nd's adjuva nt,CFA)弗氏不完全佐劑 10

15、ml卡介苗10mg200mg卡介苗可 100°C 10min滅活處理。初次免疫時(shí)，最好用弗氏完全佐劑，以刺激機(jī)體產(chǎn)生較強(qiáng)的免疫反應(yīng)。 再次免疫時(shí)，一般不用完全佐劑，而采用弗氏不完全佐劑。但在研究分枝 桿菌及相關(guān)抗原時(shí)，一般不用弗氏完全佐劑，以免卡介苗的干擾。脂質(zhì)體：是人工制備的類脂質(zhì)的小球體，由一個(gè)或多個(gè)酷似細(xì)胞膜 的類脂雙分子層組成，這種結(jié)構(gòu)使其能夠攜帶各種親水的、疏水的和兩性 物質(zhì)，他們被包裹在脂質(zhì)體內(nèi)部的水相中，或插入類脂雙分子層或吸附、 聯(lián)接在脂質(zhì)體的表面，起到明顯的免疫增強(qiáng)作用。油佐劑：采用植物油和礦物油均可，包括豆油、花生油、油菜油 等。目前應(yīng)用最廣的礦物油。10號(hào) 白油

16、(石蠟油)100ml硬脂酸鋁2g司本80 6ml混合加熱融化，分裝。用時(shí)按下列配方進(jìn)行乳化。油相3份水相（加 4%吐溫80）1 份先把油相攪拌起來(lái)，然后緩慢加入水相乳化。司本是油分散劑，吐溫 是水分散劑，均有利于乳化。乳化作用將抗原與佐劑混合的過(guò)程稱為乳化。乳化的方法很多，可采用研缽乳 化；可直接在旋渦振蕩器上乳化；可用組織搗碎器乳化。少量時(shí)，特別是 弗氏佐劑與抗原乳化時(shí)，常采用注射器乳化，用兩個(gè)注射器，一個(gè)吸入抗 原液，一個(gè)吸入佐劑，兩注射器頭以膠管連接，注意一定扎緊，然后來(lái)回 抽吸。當(dāng)大量乳化時(shí)，可采用膠體磨進(jìn)行。乳化好的標(biāo)志是取一滴乳化劑滴入水中呈現(xiàn)球形而不分散。如出現(xiàn)平 展擴(kuò)散即為未乳

17、化好。乳化過(guò)的物質(zhì)放置一段時(shí)間（在保存期內(nèi)）出現(xiàn)油 水分層也是未乳化好的表現(xiàn)。根據(jù)抗原的性質(zhì)、免疫原性和動(dòng)物的免疫反應(yīng)性來(lái)決定免疫途徑、免疫次數(shù)和間隔時(shí)間等。免疫途徑包括皮下注射、皮內(nèi)注射、肌肉注射、靜脈注射、腹腔注射以及淋巴結(jié)內(nèi)注射等。抗原量 少，貝般多采用加佐劑，淋巴結(jié)內(nèi)或淋巴結(jié)周圍、或足掌、或皮內(nèi)、皮 下多點(diǎn)注射，如抗原量多，則可采用皮下、肌肉、以至靜脈注射。注射間隔時(shí)間 帶佐劑的皮內(nèi)、皮下注射，一般為間隔24周免疫一次。不帶佐劑的皮下或肌肉注射， 一般為12周間隔時(shí)間；肌肉或靜脈免疫的， 可5 天左右的間隔時(shí)間?？梢园迅鞣N注射途徑聯(lián)合起來(lái)應(yīng)用，最終以達(dá)到效價(jià)要求為目的。免疫動(dòng)物供免疫用

18、的動(dòng)物主要是哺乳動(dòng)物和禽類，常選擇家兔、綿羊、山羊、 馬、騾和豚鼠及小鼠等。動(dòng)物的選擇常根據(jù)抗體的用途和量來(lái)決定，也與 抗原的性質(zhì)有關(guān)。如要獲得大量的抗體，多采用大動(dòng)物；如要是獲得直接 標(biāo)記診斷的抗體，則直接采用本動(dòng)物；如要獲得間接的標(biāo)記診斷用抗體， 則必須用異源動(dòng)物制備抗體；如果難以獲得的抗原，且抗體的需要量少， 則可以采用純系小鼠制備；一般實(shí)驗(yàn)室采用的抗體，多用兔和羊制備。免疫用的動(dòng)物最好選擇適齡的健康雄性動(dòng)物，雌性動(dòng)物特別是妊娠動(dòng) 物用于制備免疫抗體則非常不合適，有時(shí)甚至不產(chǎn)生抗體。由于對(duì)免疫應(yīng) 答的個(gè)別差異，免疫時(shí)應(yīng)同時(shí)選用數(shù)只動(dòng)物進(jìn)行免疫?？乖嵌喾N多樣的，而且千差萬(wàn)別。就其化學(xué)成分

19、而言，有蛋白質(zhì)抗原、類脂抗原、多糖類抗 原和核酸抗原等。就抗原性而言，有完全抗原和不完全抗原。為了獲得較 好的抗血清，最好是選用蛋白質(zhì)抗原，如要制備用于篩選細(xì)菌表達(dá)的cDNA文庫(kù)或免疫印跡的抗血清，最好選用可降解的蛋白質(zhì)抗原。不同的抗原， 其免疫原性的強(qiáng)弱均不相同，這種免疫原性的強(qiáng)弱取決于抗原的分子量、 化學(xué)活性基團(tuán)、立體結(jié)構(gòu)、物理形狀和彌散速度等?？乖拿庖邉┝渴且勒战o予動(dòng)物的種類、免疫周期以及所要求的抗體 特性等不同而不同。劑量過(guò)低，不能引起足夠強(qiáng)的免疫刺激，免疫劑量過(guò) 多，有可能引起免疫耐受。在一定的范圍內(nèi)，抗體的效價(jià)是隨注射劑量的 增加而增高。蛋白質(zhì)抗原的免疫劑量比多糖類抗原寬。一般而

20、言，小鼠的 首次免疫劑量為 50卩g400卩g/次， 大鼠為100卩g1 000卩g/次， 兔 為200卩g1 000卩g/2次。加強(qiáng)劑量為首次劑量的1/52/5。免疫劑量與注射途徑有關(guān)，一般而言，靜脈注射劑量大于皮下注射， 而皮下注射又比掌內(nèi)和跖內(nèi)皮下注射劑量大，也可采用淋巴結(jié)內(nèi)注射法。 加佐劑比不加佐劑的注射劑量要小，對(duì)家兔而言，采用弗氏完全佐劑，則 需注射0.5mg1mg/kg./次，如采用弗氏不完全佐劑則注射劑量應(yīng)大10倍以上。如要制備高度特異性的抗血清，可選用低劑量抗原短程免疫法。如需要獲得高效價(jià)的抗血清，宜采用大劑量長(zhǎng)程免疫法。免疫周期長(zhǎng)者，可少 量多次。免疫周期短者，應(yīng)大量少次。

21、兩次注射的間隔時(shí)間應(yīng)長(zhǎng)短適宜，太短起不到再次反應(yīng)的效果太長(zhǎng)則失去了前一次激發(fā)的敏感作用。一般間 隔時(shí)間應(yīng)為57天，加佐劑者應(yīng)為 2周左右。 注射的Ig 純度高，則一 般不易引起過(guò)敏反應(yīng)，如注射血清，即使是少量，在再次免疫時(shí)，極易引 起過(guò)敏反應(yīng)，所以一定要采取措施。除此之外，多克隆抗體也可研究并開(kāi)發(fā)成抗體藥物。例thymoglobulin（兔抗胸腺細(xì)胞球蛋白）是美國(guó)Sangstat公司的新產(chǎn)品，是用人胸腺細(xì)胞免疫家兔后純化其中的免疫球蛋白得到多抗藥物。美國(guó)FDA先后批準(zhǔn)了thymoglobulin 用于治療腎移植手術(shù)的急性排異反應(yīng)，和作為脊髓發(fā)育不良綜合癥（MDS的指定用藥。2002年，該藥在加

22、拿大也獲準(zhǔn)使用。（2）單克隆抗體（monoclonal AB， MCAB ）:動(dòng)物脾臟有上百萬(wàn)種不同的 B淋巴細(xì) 胞系，具有不同基因不同的B淋巴細(xì)胞合成不同的抗體。當(dāng)機(jī)體受抗原刺激時(shí)， 抗原分子上的許多決定簇分別激活各個(gè)具有不同基因的B細(xì)胞。被激活的B細(xì)胞分裂增殖形成效應(yīng)B細(xì)胞（漿細(xì)胞）和記憶B細(xì)胞，大量的漿細(xì)胞克隆合成 和分泌大量的抗體分子分布到血液、體液中。如果能選出一個(gè)制造一種專一抗體 的漿細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，就可得到由單細(xì)胞經(jīng)分裂增殖而形成細(xì)胞群，即單克隆。單克隆細(xì)胞將合成針對(duì)一種抗原決定簇的抗體，稱為單克隆抗體。單克隆抗體的制備過(guò)程1、免疫動(dòng)物 免疫動(dòng)物是用目的抗原免疫小鼠，使小鼠產(chǎn)生致敏

23、B淋巴細(xì)胞的過(guò)程。一般選用6-8周齡雌性Balb/c小鼠，按照預(yù)先制定的免 疫方案進(jìn)行免疫注射?？乖ㄟ^(guò)血液循環(huán)或淋巴循環(huán)進(jìn)入外周免疫器官，刺激相應(yīng)B淋巴細(xì)胞克隆，使其活化、增殖，并分化成為致敏 B淋巴細(xì)胞。2、細(xì)胞融合 采用眼球摘除放血法處死小鼠，無(wú)菌操作取出脾臟，在平皿內(nèi)擠壓研磨，制備脾細(xì)胞懸液。將準(zhǔn)備好的同系骨髓瘤細(xì)胞與小鼠脾細(xì)胞按一定比例混合，并加入促融合劑聚乙二醇。在聚乙二醇作用下，各 種淋巴細(xì)胞可與骨髓瘤細(xì)胞發(fā)生融合，形成雜交瘤細(xì)胞。3、選擇性培養(yǎng) 選擇性培養(yǎng)的目的是篩選融合的雜交瘤細(xì)胞，一般采 用HAT選擇性培養(yǎng)基。在 HAT培養(yǎng)基中，未融合的骨髓瘤細(xì)胞因缺乏次黃嘌呤-鳥(niǎo)嘌呤-磷

24、酸核糖轉(zhuǎn)移酶，不能利用補(bǔ)救途徑合成DNA而死亡。未融合的淋巴細(xì)胞雖具有次黃嘌呤-鳥(niǎo)嘌呤-磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶，但其本身不能在體外長(zhǎng)期存活也逐漸死亡。只有融合的雜交瘤細(xì)胞由于從脾細(xì)胞獲得了次黃嘌呤鳥(niǎo)嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶，并具有骨髓瘤細(xì)胞能無(wú)限增殖的特性，因 此能在HAT培養(yǎng)基中存活和增殖。4、 雜交瘤陽(yáng)性克隆的篩選與克隆化在HAT培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的雜交瘤細(xì) 胞，只有少數(shù)是分泌預(yù)定特異性單克隆抗體的細(xì)胞，因此，必須進(jìn)行篩選和克隆化。通常采用有限稀釋法進(jìn)行雜交瘤細(xì)胞的克隆化培養(yǎng)。采用靈敏、 快速、特異的免疫學(xué)方法，篩選出能產(chǎn)生所需單克隆抗體的陽(yáng)性雜交瘤細(xì) 胞，并進(jìn)行克隆擴(kuò)增。經(jīng)過(guò)全面鑒定其所分泌單克隆抗體的免疫

25、球蛋白類 型、亞類、特異性、親和力、識(shí)別抗原的表位及其分子量后，及時(shí)進(jìn)行凍 存。5、 單克隆抗體的大量制備單克隆抗體的大量制備重要采用動(dòng)物體內(nèi) 誘生法和體外培養(yǎng)法。(1) 體內(nèi)誘生法 取Balb/c小鼠，首先腹腔注射 0.5ml液體石臘或降植烷進(jìn)行預(yù)處理。1-2周后，腹腔內(nèi)接種雜交瘤細(xì)胞。雜交瘤細(xì)胞在小鼠腹腔 內(nèi)增殖，并產(chǎn)生和分泌單克隆抗體。約1-2周，可見(jiàn)小鼠腹部膨大。用注射器抽取腹水，即可獲得大量單克隆抗體。(2) 體外培養(yǎng)法 將雜交瘤細(xì)胞置于培養(yǎng)瓶中進(jìn)行培養(yǎng)。在培養(yǎng)過(guò)程中， 雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生并分泌單克隆抗體，收集培養(yǎng)上清液，離心去除細(xì)胞及其 碎片，即可獲得所需要的單克隆抗體。但這種方法產(chǎn)生

26、的抗體量有限。近 年來(lái)，各種新型培養(yǎng)技術(shù)和裝置不斷出現(xiàn)，大大提高了抗體的生產(chǎn)量?？乖瓬?zhǔn)備抗原，是指能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生(特異性)免疫應(yīng)答，并能與免疫應(yīng)答 產(chǎn)物抗體和致敏淋巴細(xì)胞在體外結(jié)合，發(fā)生免疫效應(yīng)(特異性反應(yīng))的物 質(zhì)。抗原的基本特性有兩種，一是誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的能力，也就是免疫原性， 二是與免疫應(yīng)答的產(chǎn)物發(fā)生反應(yīng)，也就是抗原性。很多物質(zhì)都可以成為抗原，抗原的具體分類可以參見(jiàn)抗原，在進(jìn)行單 克隆抗體制備過(guò)程中，很多物質(zhì)都可以成為抗原，在常規(guī)的科研實(shí)驗(yàn)中， 科研者經(jīng)常選用每只小鼠 /大鼠每次注射1050ug重組蛋白、偶聯(lián)多肽、 偶 聯(lián)小分子等作為抗原產(chǎn)生特異性的單克隆抗體。動(dòng)物免疫單克隆抗體制備的宿

27、主動(dòng)物一般選用Balb/c小鼠，鼠單抗的應(yīng)用范圍相當(dāng)廣泛，也有一些公司聲稱開(kāi)發(fā)出了兔的單克隆抗體制備技術(shù)。免疫原分為可溶性抗原和顆粒性（細(xì)胞）抗原，用無(wú)菌鹽水稀釋并與 佐劑混合，腹腔注射抗原與佐劑徹底混勻后形成的穩(wěn)定乳狀液，在免疫原 提供持續(xù)的免疫應(yīng)答基礎(chǔ)上進(jìn)行加強(qiáng)免疫周期第1天 采血0.2ml （獲得0.1ml免疫前血清）第一次免疫（抗原加弗氏完全佐劑）第14天 第二次免疫（抗原加弗氏不完全佐劑）第21天 采血和ELISA檢測(cè)第35天 第三次免疫（抗原加弗氏不完全佐劑）第42天 采血和ELISA檢測(cè)第56天 第四次免疫（抗原溶于 PBS或鹽水）第61天細(xì)胞融合細(xì)胞融合（一）融合劑細(xì)胞融合的方

28、法有物理法，如電融合、激光融合，化學(xué)融合法和生物 融合法，如滅活的仙臺(tái)病毒，此處例舉化學(xué)融合法中的一種即聚乙二醇融 合法。聚乙二醇（PEG，在分子量為 200700時(shí)，呈無(wú)色、無(wú)臭的粘稠 狀液體，分子量大于1000時(shí)，呈乳白色蠟狀固體，能溶于水、乙醇及其他許多有機(jī)溶劑，對(duì)熱穩(wěn)定，與許多化學(xué)藥品不起作用。用作細(xì)胞融合劑的 聚乙二醇一般選用分子量為4000者，常用濃度為 50% pH8.0pH8.2 （用10%NaHCO調(diào)整），分子量小的 PEG融合效應(yīng)差，又有毒性，分子量過(guò)大， 則粘性太大，不易操作。50%濃度，pH偏堿時(shí)融合效應(yīng)最高。也有采用30%50%濃度的PEG加上10%X甲亞砜。不同批號(hào)

29、的PEG即使分子量相同，但融合率卻有明顯差異，選用時(shí)必須注意。每批都必須進(jìn)行細(xì)胞毒性試驗(yàn)后 方可應(yīng)用。要買高純度的，一般選供氣相色譜用的PEG（二）融合過(guò)程融合的方法很多，常用的有轉(zhuǎn)動(dòng)法和離心法。融合時(shí)脾細(xì)胞和骨髓瘤 細(xì)胞的比例為1:1至10:1不等。3:1或5:1最為常用。1 試劑與材料（1）供融合用的脾細(xì)胞及骨髓瘤細(xì)胞。（2）1640 培養(yǎng)液 100ml。（3）完全 1640 液 100ml。（4）2.5%FCS - 1640 液 50ml。（5）HAT 培養(yǎng)液 100ml。(6) 50%PEG:取分子量 4000，高純度的(日本進(jìn)口或 Serva ) PEGIOg放入25ml瓶中高壓滅菌

30、，使用前用預(yù)熱于40C的1640液10ml等量(W/V)混合，以酚紅檢查 pH, 般不必調(diào) pH。女口 pH有改變，可用 HCI或NaHC03 調(diào)整。(7) 10ml和50ml的滅菌沉淀管或瓶。(8) 40孔塑料培養(yǎng)盤(pán)。2 操作方法準(zhǔn)備好脾細(xì)胞。在50ml沉淀管中混合108脾細(xì)胞和107小鼠骨髓瘤細(xì)胞，并加入 50ml2.5%FCS 1640 液。室溫400g離心3min，使細(xì)胞沉淀。移去上清液。輕敲管底部，使沉淀流動(dòng)，把沉淀管放于40C水浴中，使其達(dá)融合溫度。加預(yù)熱至40C的50%PEG0.8ml,用1ml吸管緩慢滴加，邊加邊搖沉 淀管，肉眼觀察可見(jiàn)有顆粒出現(xiàn)，滴加過(guò)程要求持續(xù)2min。加1

31、ml1640液，邊加邊搖動(dòng)，持續(xù)1min。重復(fù)一次。加1ml1640液，邊加邊搖動(dòng)，持續(xù)0.5min。重復(fù)一次。(11) 加 1640 液 15ml。(12) 室溫，400g離心1min，使細(xì)胞沉淀。(13) 去上清，輕敲管底部，加25ml含有HAT的完全1640液。(14) 往已于前一日種有飼養(yǎng)細(xì)胞的40孔塑料培養(yǎng)盤(pán)中滴加融合的細(xì)胞液，每孔1滴(約0.05ml )。(15) 輕搖后，放入 5%CO2飽和濕度的37C溫箱中培育。(16) 第3、6、9、10日換入含HAT的完全1640培養(yǎng)液。注意輕輕吸取上 清液，勿將固定于孔底的細(xì)胞吸出，根據(jù)需要加入適量的飼養(yǎng)細(xì)胞。(17) 于第12、15日加

32、入含有HAT的完全1640培養(yǎng)液。在每次換液前用倒置顯微鏡觀察，大約在10天左右就可觀察到雜交瘤細(xì)胞生長(zhǎng)出來(lái)。大多數(shù)雜交瘤細(xì)胞在1020天內(nèi)出現(xiàn)，但也有在 1個(gè)月左右才能出現(xiàn)的。雜交 瘤細(xì)胞出現(xiàn)后，吸取上清液，檢查抗體。(18) 對(duì)繼續(xù)生長(zhǎng)的雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行增殖傳代。在傳代過(guò)程中，依情況取消HAT液和完全1640液而代之以10%FC 1640液。同時(shí)保存于液氮和進(jìn) 行克隆化，在這期間每代都要檢查抗體，以防止產(chǎn)生抗體細(xì)胞的變異和丟 失。(三) 細(xì)胞融合的關(guān)鍵1. 技術(shù)上的誤差常常導(dǎo)致融合的失敗。例如，供者淋巴細(xì)胞沒(méi)有查到 免疫應(yīng)答。這必然要失敗的。2. 融合試驗(yàn)最大的失敗原因是污染，融合成功的關(guān)鍵

33、是提供一個(gè)干凈 的環(huán)境，以及適宜的無(wú)菌操作技術(shù)。雜交瘤技術(shù)：克隆化的細(xì)胞可以在體外進(jìn)行大量培養(yǎng)，收集上清液而獲得大量的單一的克隆化抗體。不過(guò)體外培養(yǎng)法得到的單克隆抗體有限， 其不能超過(guò)特定的細(xì)胞濃度，且每天要換培養(yǎng)液。而體內(nèi)雜交瘤細(xì)胞繁殖 可以克服這些限制。雜交瘤細(xì)胞具有從親代淋巴細(xì)胞得來(lái)的腫瘤細(xì)胞的遺 傳特性。如接種到組織相容性的同系小鼠或不能排斥雜交瘤的小鼠（無(wú)胸 腺的裸鼠），雜交瘤細(xì)胞就開(kāi)始無(wú)限地繁殖，直至宿主死亡。產(chǎn)生腫瘤細(xì) 胞的小鼠腹水和血清中含有大量的雜交瘤細(xì)胞分泌的單克隆抗體，這種抗 體的效價(jià)往往高于培養(yǎng)細(xì)胞上清液的 1001000倍。利用免疫抑制劑，如降植烷、液體石蠟、抗淋巴細(xì)

34、胞血清等，可 以加速和促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)。（流程圖）佇怖細(xì)胞波瑋AT ：殺死脾細(xì)臉逐漸0 LI 一匚 LT> =-=.=冷；- . 二、 ;瞬抗體陽(yáng)性孔通過(guò)結(jié)構(gòu)分析表明,抗體可變區(qū)內(nèi)具有 6個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)（CDR ）起與抗原結(jié) 合作用,其它區(qū)域做為支架（FR ）維持構(gòu)象,通過(guò)CDR移植已構(gòu)了30多種改型的人源化鼠抗(一種改型抗體)，并通過(guò)序列分析比較和計(jì)算機(jī)模擬進(jìn)行分子設(shè)計(jì)，對(duì)FR區(qū)特定堿基進(jìn)行替換，保證了改型后抗體親和力不下降，這種抗體有人稱之為第二代基因工程抗 體，亦即蛋白質(zhì)工程抗體。雖然單克隆抗體給人類疾病的藥物導(dǎo)向治療帶來(lái)了曙光，但應(yīng)用上遇到鼠抗體對(duì)人具有免疫原作用的問(wèn)題，蛋白質(zhì)工程已

35、成功用于解決這個(gè)問(wèn)題。由于單克隆抗體具有純度高、特異性強(qiáng)、效價(jià)高、少有交叉反應(yīng)的優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)廣泛用于生命科學(xué)的各領(lǐng)域，如作為診斷試劑用于許多血清學(xué)檢測(cè)， 用于治療腫瘤、自身免疫疾病，抑制同種異體移植排異反應(yīng)等。例如，利 妥西單抗(rituimab )是美國(guó)FDA批準(zhǔn)的首個(gè)抗腫瘤單抗。首先用人B淋巴細(xì)胞免疫小鼠，然后篩選鼠源抗CD2 0的單克隆抗體，再利用基因工程技術(shù)將鼠源CD20抗體的可變區(qū)與人 lgG1恒定區(qū)連接而成?，F(xiàn)在解決抗體人 源化問(wèn)題主要是通過(guò)基因工程技術(shù)，正如上文舉例。單克隆抗體的優(yōu)點(diǎn)與局限性1 單克隆抗體的優(yōu)點(diǎn)(1) 雜交瘤可以在體外“永久”地存活并傳代，只要不發(fā)生細(xì)胞株的基 因突

36、變，就可以不斷地生產(chǎn)高特異性、高均一性的抗體。(2) 可以用相對(duì)不純的抗原，獲得大量高度特異的、均一的抗體。(3) 由于可能得到“無(wú)限量”的均一性抗體，所以適用于以標(biāo)記抗體為特點(diǎn)的免疫學(xué)分析方法，如IRMA和ELISA等。(4) 由于單克隆抗體的高特異性和單一生物學(xué)功能，可用于體內(nèi)的放射 免疫顯像和免疫導(dǎo)向治療。2單克隆抗體的局限性(1) 單克隆抗體固有的親和性和局限的生物活性限制了它的應(yīng)用范圍。 由于單克隆抗體不能進(jìn)行沉淀和凝集反應(yīng)，所以很多檢測(cè)方法不能用單克 隆抗體完成。(2) 單克隆抗體的反應(yīng)強(qiáng)度不如多克隆抗體。(3) 制備技術(shù)復(fù)雜，而且費(fèi)時(shí)費(fèi)工，所以單克隆抗體的價(jià)格也較高。行業(yè)發(fā)展情況

37、 銷售及增長(zhǎng)2010年全球治療用單抗藥物的銷售總額達(dá)到440億美元，如果加上100億美元的單抗診斷和研究試劑，單抗藥物的市場(chǎng)總量達(dá)到550億美元。2011年單抗藥物的市場(chǎng)總量已經(jīng)達(dá)到628億美元。未來(lái)，全球單克隆抗體藥依舊會(huì)保持較高的增長(zhǎng)率。到2015年，全球單克隆抗體藥銷售額有望達(dá)980億美元左右。我國(guó)的單克隆抗體藥物從無(wú)到有，并且在我國(guó)醫(yī)藥市場(chǎng)發(fā)揮 越來(lái)越重要的作用。目前我國(guó)單抗市場(chǎng)規(guī)模每年以50%上的速度遞增。單克隆抗體在我國(guó)市場(chǎng)仍屬高端產(chǎn)品，主要依賴進(jìn)口。羅氏是我國(guó)單抗市場(chǎng) 最大的贏家，市場(chǎng)份額最高的品種利妥昔單抗和曲妥珠單抗均來(lái)自羅氏制 藥，羅氏所有產(chǎn)品份額超過(guò)國(guó)內(nèi)單抗產(chǎn)品份額半數(shù)。

38、2010年我國(guó)腫瘤藥物市場(chǎng)銷售額達(dá)160億元，同比增長(zhǎng) 24%全球排名第七，遠(yuǎn)超美國(guó)4.4%和其他成熟或新興市場(chǎng)；2011年市場(chǎng)銷售額達(dá)到 208億元。同比增長(zhǎng)率 30%。對(duì)生物仿制藥的市場(chǎng)滲透率形成制約的其中一個(gè)因素是立法，它阻止了用 生物仿制藥來(lái)替代原研產(chǎn)品。這意味著，生物仿制藥的使用只限于新病人 和短期適應(yīng)癥。然而，使用生物仿制藥創(chuàng)造的醫(yī)療成本控制機(jī)會(huì)卻是巨大 的。在那些尚未為生物仿制藥確定監(jiān)管路徑的市場(chǎng)上（其中包括美國(guó)）， 生物仿制藥獲得成功的關(guān)鍵因素是專利的獨(dú)有性、臨床試驗(yàn)要求和互換性。研發(fā)的政策支持"十二五"期間，我國(guó)"重大新藥創(chuàng)制"專項(xiàng)將獲

39、中央財(cái)政下?lián)苜Y金100億元，配套資金 300億元。專項(xiàng)戰(zhàn)略重點(diǎn)包括創(chuàng)新藥物研究開(kāi)發(fā)、藥物大 品種技術(shù)改造等。惡性腫瘤、心腦血管疾病、神經(jīng)退行性疾病、糖尿病、 肺結(jié)核等10類重大疾病藥物的研發(fā)是創(chuàng)制資金支持重點(diǎn)。"十二五"期間，醫(yī)藥工業(yè)發(fā)展目標(biāo)為總產(chǎn)值年均增長(zhǎng)20%到2015年達(dá)到3.1萬(wàn)億元。2011年，單克隆抗體藥物繼續(xù)領(lǐng)跑全球藥品市場(chǎng)，同比有較大的增長(zhǎng)。2000-2010年10年間，全球單克隆抗體藥物市場(chǎng)的復(fù)合增長(zhǎng)率高達(dá)32% 2011年，全球處方藥前20位中，有6個(gè)為單克隆抗體藥物，其中有5個(gè)銷售額超過(guò)50億美元。而在此前的2009年和2008年，該數(shù)字分別為 400

40、億美元和370億美元。當(dāng)前，幾乎所有大型制藥公司都有單抗研發(fā)項(xiàng)目。在2011年全球最暢銷的20種藥品中，美國(guó)輝瑞公司用于降低膽固醇的阿托伐他汀鈣居于 首位，達(dá)到133億美元。2011年，全球生物制藥產(chǎn)品的市場(chǎng)規(guī)模超過(guò)1550億美元，占制藥/生物制藥產(chǎn)品的25%不過(guò)，有研究數(shù)據(jù)表明，生物制藥 產(chǎn)品今后幾年在全球市場(chǎng)上的占比將明顯上升。據(jù)預(yù)測(cè)，到2014年，全球銷售額前三大產(chǎn)品都將是生物技術(shù)藥物（Avast in，Humira和En brel），屆時(shí)它們的銷售額合計(jì)將達(dá)到254億美元。單克隆抗體藥物已經(jīng)成為生物制藥中最為重要的一類：2011年銷售規(guī)模最大的 7種抗體藥物的銷售額達(dá)到了 388.2億

41、美元，占整個(gè)生物制藥市場(chǎng)份額接近50%單克隆抗體仍是目前研發(fā)的熱點(diǎn)，也將是未來(lái)生物制藥行業(yè)發(fā)展的重要?jiǎng)恿λ凇?3) 基因工程抗體( genetically engineering antibody): 基因工程抗體是以基因工程技術(shù)等高新生物技術(shù)為平臺(tái)，制備的生物藥物總稱。由于目前制備的抗體均為鼠源性，臨床應(yīng)用時(shí)，對(duì)人是異種抗原， 重復(fù)注射可使人產(chǎn)生抗鼠抗體，從而減弱或失去療效，并增加了超敏反應(yīng) 的發(fā)生，因此，在 80年代早期，人們開(kāi)始利用基因工程制備抗體，以降 低鼠源抗體的免疫原性及其功能。目前多采用人抗體的部分氨基酸序列代 替某些鼠源性抗體的序列，經(jīng)修飾制備基因工程抗體，稱為第三代抗體?；?/p>

42、因工程抗體主要包括嵌合抗體、人源化抗體、完全人源抗體、單鏈抗體、 雙特異性抗體等?；蚬こ炭贵w發(fā)展細(xì)胞內(nèi)抗體 ；最近，美國(guó)FDA強(qiáng)調(diào)：目前在臨床試驗(yàn)中基因工程抗體 約占生物制劑的 30%=重組抗體的體積越來(lái)越小，或被重新構(gòu)建成多價(jià)分子，或與其它分子相融合，如放射性核素、毒素、酶、脂質(zhì)體和病毒。重組技 術(shù)的出現(xiàn)使篩選、人源化、抗體的生產(chǎn)得到革新，并取代雜交瘤技術(shù)，從 而使以抗體為基礎(chǔ)的藥劑設(shè)計(jì)成為可能。由于雜交瘤單克隆抗體為異源性蛋白， 應(yīng)用于人時(shí)易產(chǎn)生抗小鼠抗體， 基因工程抗體通過(guò) 基因工程技術(shù)改造現(xiàn)有優(yōu)良的鼠單克隆抗體基因。盡量減少抗體中鼠源成分， 保留原有抗體特異性，從而創(chuàng)造出一種新型抗體

43、。一、人源化抗體人源化抗體主要指鼠源單克隆抗體以基因克隆及DNA重組技術(shù)改造，重新表達(dá)的抗體，其大部分氨基酸序列為人源序列取代，基本保留親本鼠單克隆抗體的親和力和特異性，又降低了其異源性，有利應(yīng)用于人體。1. 人-鼠嵌合抗體此抗體為通過(guò)基因工程技術(shù)，將人IgG C區(qū)與鼠IgV區(qū)連接，導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)表達(dá)制備而成的抗體。2. 抗體的表面修飾，使 Fv表面人源化。二、小分子抗體此為分子量小，具有抗原結(jié)合功能的分子片段，包括Fab，F(xiàn)v，單鏈抗體，醫(yī)學(xué)教*育網(wǎng)整理單區(qū)抗體等。此種抗體分子量小，可在大腸桿菌等原核細(xì)胞表達(dá)，在人體內(nèi)穿透力強(qiáng)，有利于疾病的治療。三、抗體融合蛋白將抗體分子片段與其他蛋白融合，可得

44、到多樣性生物功能的融合蛋白，如:1. 含F(xiàn)v段的抗體融合蛋白： 將Fv與某些毒素、酶、細(xì)胞因子基因拼連，通過(guò)這些抗體的引導(dǎo)，可將其生物活性物質(zhì)導(dǎo)向靶細(xì)胞特定部位，所謂“生物導(dǎo)彈”。2. 嵌合受體：將ScFv與某些細(xì)胞膜蛋白分子融合，形成的融合蛋白，可表達(dá)于細(xì)胞表面，稱為嵌合受體，由于其介導(dǎo)的殺傷效應(yīng)不受MHC艮制，在過(guò)繼性免疫治療中有潛在應(yīng)用價(jià)值。3. 含F(xiàn)c的抗體融合蛋白：CD4分子細(xì)胞膜外部分與 Fc融合后由真核細(xì)胞表達(dá)。此融合 蛋白能競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合 HIV，阻斷HIV對(duì)敏感細(xì)胞的感染；還可介導(dǎo) ADCC及 CDC可通過(guò)胎盤(pán)。四、特異性抗體雙特異性不同的兩個(gè)小分子抗體醫(yī)學(xué)教*育網(wǎng)整理連接在一起可

45、得到雙特異性抗體。雙特異性抗體能同時(shí)結(jié)合兩種抗原，因而可介導(dǎo)標(biāo)記物與靶抗原結(jié)合或某些效應(yīng)因子定位于靶細(xì)胞，在免疫學(xué)檢測(cè)中可簡(jiǎn)化操作步驟，提高檢驗(yàn)質(zhì)量；應(yīng)用雙特異性抗體介導(dǎo)的藥物殺傷效應(yīng)可用于腫瘤等的治療。五、抗體庫(kù)技術(shù)抗體庫(kù)技術(shù)是指基因克隆技術(shù)將全套抗體重鏈及輕鏈可變區(qū)基因克隆出來(lái)，重組到質(zhì)粒表達(dá)載體，通過(guò)大腸桿菌直接表達(dá)有功能的抗體分子片段，最后篩選到特異的可變區(qū)基因， 現(xiàn)有組合抗體庫(kù)技術(shù)及菌體抗體庫(kù)技術(shù)。3.抗體融合蛋白(hybrid molecule ):將抗體分子片段與其他蛋白融合，可得到多 樣性生物功能的融合蛋白，如：1. 含F(xiàn)v段的抗體融合蛋白： 將Fv與某些毒素、酶、細(xì)胞因子基因

46、拼連，通過(guò)這些抗體的引導(dǎo)，可將其生物活性物質(zhì)導(dǎo)向靶細(xì)胞特定部位，所謂“生物導(dǎo)彈”。2. 嵌合受體：將ScFv與某些細(xì)胞膜蛋白分子融合， 形成的融合蛋白醫(yī)學(xué)教|育網(wǎng)搜集整 理，可表達(dá)于細(xì)胞表面， 稱為嵌合受體，由于其介導(dǎo)的殺傷效應(yīng)不受 MHC艮制，在過(guò)繼性免 疫治療中有潛在應(yīng)用價(jià)值。3. 含F(xiàn)c的抗體融合蛋白：CD4分子細(xì)胞膜外部分與 Fc融合后由真核細(xì)胞表達(dá)。此融合 蛋白能競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合 HIV，阻斷HIV對(duì)敏感細(xì)胞的感染；還可介導(dǎo)ADCC及 CDC可通過(guò)胎盤(pán)。(1) 免疫毒素(ITS):又稱抗毒素(antitoxin)。外毒素(來(lái)自動(dòng)植物或細(xì)菌的毒素)的對(duì)應(yīng)抗體或含這種抗體的抗毒素血清。機(jī)體經(jīng)感染

47、某種 傳染病或被注射外毒素時(shí)即能產(chǎn)生。通常制備系以外毒素注射于馬體，使 馬產(chǎn)生免疫毒素，然后取其血清加工提純即得(血清不提純也可直接應(yīng)用)用于防治相應(yīng)的疾病。被用于把高效藥劑送到特定的區(qū)域，特別是送入癌 細(xì)胞。惡性腫瘤是危害人類健康的一類重要疾病，隨著人類生存環(huán)境的惡化和 社會(huì)壓力的增大，惡性腫瘤的發(fā)病率和病死率逐漸增高，每年全球癌癥死亡 人數(shù)約為700萬(wàn)人。腫瘤的治療以外科手術(shù)為主，以放化療為輔，但放化療缺乏特異性，對(duì)正常組織器官的毒副作用較大，使患者身心備受影響。對(duì)腫 瘤的特異性治療一直是醫(yī)學(xué)工作者的夢(mèng)想。免疫毒素作用機(jī)理:FxlraceilularFntracflJIuardaveage

48、EndosomeMembrane insertionin II15 pre5nch ofT37-0H_T37- GftjcosgRh« +UDPG|ucMe（ RhoUDP Inacllvelijl-'alKrs.n n! Dhn UTDQQan 免疫毒素分子中受體結(jié)合域與靶細(xì)胞表面相應(yīng)抗原或受體的結(jié)合； 免疫毒素分子的轉(zhuǎn)位結(jié)合域，通過(guò)內(nèi)化和跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程，轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞質(zhì) 中； 免疫毒素分子的催化結(jié)構(gòu)域，通過(guò)胞內(nèi)催化抑制蛋白質(zhì)合成，或誘導(dǎo)凋亡。1. 免疫毒素總體發(fā)展第一代免疫毒素是化學(xué)交聯(lián)免疫毒素；第二代免疫毒素是抗體或抗體的活性片段與雙鏈毒素A鏈或單鏈RIP的化學(xué)偶聯(lián)物，第三代

49、免疫毒素是基因工程免疫毒素2. 第一第二代免疫毒素與第三代免疫毒素的比較：（下表）免疫毒素第一代第二代第三代結(jié)構(gòu)組成完整的抗體與毒抗體片段與改造抗體片段與改造毒素素毒素制備方法體外化學(xué)交聯(lián)體外化學(xué)交聯(lián)宿主菌體內(nèi)重組表達(dá)優(yōu)缺點(diǎn)穩(wěn)定性差、分子 穩(wěn)定性差、分子 穩(wěn)定性強(qiáng)，滲透性好，特量大、免疫原性 量大、免疫原性 異性更好，制備時(shí)簡(jiǎn)單易 強(qiáng)、滲透性差 強(qiáng)、滲透性差 行，可短期內(nèi)大量制備2. 分別對(duì)于抗體，毒素和其他方面的研究進(jìn)展對(duì)抗體的研究：完整Ig分子量大，滲透性差，應(yīng)用過(guò)程中受到一定的限制；FV是能介導(dǎo)特異性結(jié)合的最小抗體亞單位。在輕鏈和重鏈可變區(qū)用一個(gè)連 接肽連接，保留其穩(wěn)定性的同時(shí)充分保留了

50、特異性結(jié)合能力，且免疫原性 大大降低；通過(guò)二硫鍵相連，scFV與dsFV免疫毒素的體外實(shí)驗(yàn)顯示，兩者活性及特異 性相似，但dsFV的產(chǎn)量高，對(duì)熱和化學(xué)處理有耐受作用，在各種緩沖液及 人血清中較穩(wěn)定。對(duì)于毒素的研究:制備免疫毒素最常用的毒素有白喉毒素、蓖麻毒素、假單胞桿菌外毒素和其它毒素其他方面的研究a) 免疫毒素在體內(nèi)的清除及降低其清除速度的研究應(yīng)用免疫毒素的重要目的是治療腫瘤。應(yīng)用中一個(gè)令人關(guān)心的問(wèn)題是它的 體內(nèi)清除，降低免疫毒素在體內(nèi)的清除速度，延長(zhǎng)其半衰期，在免疫毒素 的應(yīng)用研究中具有重要的意義Thorpe等(1985)發(fā)現(xiàn)用高碘酸處理，并經(jīng)氰硼氫化鈉還原的蓖麻毒素，發(fā) 現(xiàn)毒素在小鼠體內(nèi)

51、的清除速度，不像天然毒素那么快。修飾過(guò)的毒素對(duì)培 養(yǎng)細(xì)胞的毒性僅及天然毒素的1/10，但在動(dòng)物體內(nèi)其毒性卻是天然毒素的4倍b) 免疫毒素在小鼠體內(nèi)應(yīng)用的研究毒素在小鼠體內(nèi)的藥物動(dòng)力學(xué)、對(duì)腫瘤的定位能力以及治 療腫瘤效果的研究，是免疫毒素應(yīng)用于臨床的重要研究方面3. 免疫毒素在體內(nèi)腫瘤治療的中的問(wèn)題 特異性：免疫毒素的特異性是進(jìn)行導(dǎo)向治療的前提，它取決于所用載體 如抗體或細(xì)胞因子的特異性；尋找腫瘤細(xì)胞表面特異性表達(dá)的受體或抗原 活性：取決于其半衰期與穩(wěn)定性，而半衰期與穩(wěn)定性則取決于免疫毒素 的大小及其與腫瘤的親和力，研究如何使免疫毒素有較長(zhǎng)的半衰期和較好 穩(wěn)定性也是急需解決的問(wèn)題； 毒性：對(duì)毒素

52、分子和運(yùn)載體進(jìn)行克隆修飾，降低其非特異性細(xì)胞毒性作 用； 免疫原性：主要取決于毒素部分，多年的臨床試驗(yàn)表明，50% 100 %的實(shí)體瘤病人和040%的血液瘤病人在經(jīng)過(guò)一輪的免疫毒素治療后，會(huì)產(chǎn)生針對(duì)免疫毒素的抗體。當(dāng)產(chǎn)生的抗體為中和性抗體時(shí)，免疫毒素的細(xì)胞毒作用就會(huì)降低，設(shè)法盡量減小免疫原性； 毒副作用：最常見(jiàn)的副作用為血管滲漏綜合征(vesselleak syn drome，VL s)這是因?yàn)槊庖叨舅貜难艿竭_(dá)靶器官必須穿過(guò)血管內(nèi)皮細(xì)胞，還有對(duì)肝臟毒性 ，這是Fv的殘基與帶負(fù)電荷的肝細(xì)胞結(jié)合導(dǎo)致的。盡管免疫毒素導(dǎo)向治療腫瘤尚存在一些問(wèn)題，但已顯示出很大的臨床 應(yīng)用前景。隨著蛋白質(zhì)及基因工程技

53、術(shù)的深入研究，免疫毒素導(dǎo)向治療惡 性腫瘤必將成為行之有效的治療手段。(2) 基因工程抗體-酶融合蛋白(ADEPT :抗體融合蛋白(antibodyfusionprotein)是指利用基因工程技術(shù)將抗體片段與其他生物活性蛋白 融合所得的產(chǎn)物。由于融合蛋白的不同，這種抗體融合蛋白具有多種生物學(xué)功能， 并且表達(dá)的重組蛋白既不影響單鏈抗體的抗原結(jié)合能力，也不影響與之融合的蛋白質(zhì)的生物學(xué)特性。如將ScFv與某些細(xì)胞膜蛋白融合，可形成嵌合受體，賦予 特定細(xì)胞結(jié)合某種抗原的能力；如將Fab或ScFv與其他生物活性蛋白融合，就 可將特定的生物學(xué)效應(yīng)物質(zhì)導(dǎo)向靶部位。盡管多克隆抗體和單克隆抗體得到了廣泛的應(yīng)用，但它們還有許多難以克服的缺點(diǎn)。特別是在治療的研究方面，由于以往的抗體來(lái)自異種動(dòng)物，所以抗原性很強(qiáng)，不能直接用于人體， 否則會(huì)引起很強(qiáng)的免疫排斥反應(yīng)。為此在 20世紀(jì)80年代誕生了應(yīng)用 DNA重組及蛋白工程 技術(shù)對(duì)編碼抗體基因按不同需要進(jìn)行改造和裝配，經(jīng)導(dǎo)