谷胱甘肽生物轉(zhuǎn)化研究

1、生物轉(zhuǎn)化法合成谷胱甘肽的研究 張磊 薛釗坤 （浙江工業(yè)大學(xué)生物與環(huán)境工程學(xué)院 杭州 310014）摘要：本文以編號(hào)X23的藤黃八疊球菌為研究對(duì)象，研究其生物轉(zhuǎn)化合成谷胱甘肽的可能性。通過(guò)從物理、化學(xué)和生物三方面因素改進(jìn)轉(zhuǎn)化條件：轉(zhuǎn)化過(guò)程中以100mg/L濕菌含量加入新配制pH為7.5的轉(zhuǎn)化液137、轉(zhuǎn)速200r/min的搖床轉(zhuǎn)化6h，用超聲波對(duì)含菌的轉(zhuǎn)化液破壁10min，接著于3500r/min離心機(jī)離心20min后取上清液,為最佳的物理因素；通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)分析方法得轉(zhuǎn)化液最佳成份濃度為葡萄糖0.75mol/L、MgCl20.01mol/L、底物濃度0.03mol/L，找到并證實(shí)微量元素濃度20

2、mg/L的ZnSO4·7H2O對(duì)谷胱甘肽合成酶有激活作用，為最佳化學(xué)因素；連續(xù)生物轉(zhuǎn)化進(jìn)行兩步可使轉(zhuǎn)化產(chǎn)量達(dá)到88.43mg/L，一次從發(fā)酵到轉(zhuǎn)化兩步的生產(chǎn)過(guò)程可產(chǎn)谷胱甘肽231.27mg/L，較原菌株只發(fā)酵的產(chǎn)量142.75mg/L提高61.94%。關(guān)鍵詞：谷胱甘肽、藤黃球菌、生物轉(zhuǎn)化RESERCH OF BIOLOGY SYNTHESIS OF GLUTATHIONE ZHANG Lei XUE Zhao-Kun (College of Biology and Environment Engineering Zhejiang University of Technology ,H

3、angzhou ,310014)Abstract:Sarcina lutea strain X23,which was stored in the microbiologic lab of the Zhejiang university of technology was studied for the biological transform of glutathione.The condition of the glutathione biologic transform and component of the productive liquid through were improve

4、d through physical chemical and biologic factors. The productive liquid pH 7.5 contained Sarcina lutea 100mg cell/L,was placed in a flask and incubated at 37with shaking at 200r/min for 6h,then the strain with productive liquid was smashed for 10min by sonicate, supernatent was got by centrifugation

5、 at the speed of 3500r/min for 20min,that was the optimum physical factor. Composition of the productive liquid, Glucose 0.25mg/L、MgCl2 0.01mg/L、Amino acids 0.03mg/L. was obtained by the quadratic design. the ZnSO4·7H2O at the concentration of 20mg/L which was discovered and confirmed can activ

6、ate the endosynthase of glutathione, that was the optimum chemical factor. The result indicated that the glutathione production reached 88.43 mg/L after two steps biologic transform process, The productivity of glutathione can be obtained 231.27 mg/L of during the whole process, which was 61.94 high

7、er than in the synthesis. Key words: Glutathione Sarcina lutea biologic synthesis還原型谷胱甘肽（L-Glutathione，簡(jiǎn)稱(chēng)GSH）是由谷氨酸，半胱氨酸和甘氨酸構(gòu)成的活性三肽。自1938年發(fā)表了由酵母?jìng)渲乒入赘孰牡淖钤鐚?zhuān)利以來(lái)3，還原型谷胱甘肽在臨床上有著廣泛的應(yīng)用，它能夠防止皮膚色素沉積、改善皮膚光澤，是治療肝病、重金屬中毒、放射性損傷、腫瘤、白內(nèi)障等疾病的有效藥物，最近還發(fā)現(xiàn)谷胱甘肽可能具有抗艾滋病毒的功效。谷胱甘肽現(xiàn)在已廣泛運(yùn)用于食品加工的各個(gè)領(lǐng)域，在日本谷胱甘肽被認(rèn)為是21世紀(jì)最有希望的保健食品之一。

8、谷胱甘肽作為一種重要的氨基酸類(lèi)生化藥物，隨著人們?cè)谑称诽砑觿?、臨床醫(yī)學(xué)和運(yùn)動(dòng)營(yíng)養(yǎng)學(xué)上對(duì)它的興趣日益增長(zhǎng)，市場(chǎng)需求量不斷增加。目前生產(chǎn)谷胱甘肽最普遍的方法是發(fā)酵法生產(chǎn)，發(fā)酵法生產(chǎn)谷胱甘肽基本以酵母發(fā)酵為主，國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)到以革藍(lán)氏陽(yáng)性菌產(chǎn)生的酶系催化合成谷胱甘肽的報(bào)道，本課題旨在彌補(bǔ)這一空白。由于GSH合成酶在細(xì)菌體內(nèi)的活性和產(chǎn)量受細(xì)菌調(diào)控，因此要提高轉(zhuǎn)化率一個(gè)重要途徑是優(yōu)化生物轉(zhuǎn)化條件。本論文通過(guò)一定方法提取細(xì)菌中相應(yīng)的活性酶，研究其最適轉(zhuǎn)化條件和最佳配方以提高谷胱甘肽的生物轉(zhuǎn)化率。由于藤黃八疊菌的生長(zhǎng)周期僅為酵母的1/3，利用該細(xì)菌高產(chǎn)谷胱甘肽合成酶菌株進(jìn)行轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)谷胱甘肽，可以大大縮短生產(chǎn)

9、周期提高經(jīng)濟(jì)效益，促進(jìn)產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。1 材料與儀器1.1 菌種來(lái)源 藤黃八疊球菌（浙江工業(yè)大學(xué)生物實(shí)驗(yàn)室收集和保藏）1.2 培養(yǎng)基1.2.1 斜面培養(yǎng)基（完全培養(yǎng)基）及培養(yǎng)條件2：培養(yǎng)基：葡萄糖30g、蛋白胨10g、牛肉膏3g、氯化鈉 5g、瓊脂20g定容至1L水。pH自然，1.0×105Pa 滅菌20min。1.2.2 種子培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件：葡萄糖30g、蛋白胨10g、牛肉膏3g、氯化鈉 5g、定容到1L， pH自然，1.0×105Pa 滅菌20min。1.2.3 發(fā)酵培養(yǎng)及培養(yǎng)條件：培養(yǎng)基：糖蜜30g、白胨25g、七水硫酸鎂 5g、 磷酸二氫鎂 1g cysHCl 1.5

10、g,加水定容1000ml pH7.0,1.0×105Pa、滅菌 20min。 1.3 TL0轉(zhuǎn)化液配方1轉(zhuǎn)化液TL0：pH 7.0，K2HPO4-KH2PO4緩沖液，葡萄糖9g/L，MgCl2 2.05g/L，底物氨基酸0.03mol/L（谷氨酸4.4g/L，甘氨酸2.25g/L，半胱氨酸5.25g/L）。1.4 主要儀器：LS-B50L立式蒸汽滅菌鍋，上海醫(yī)用核子儀器廠；751-GW，分光光度計(jì),上海分析儀器廠；高速離心機(jī)LD5-10；超聲波粉碎機(jī)（CPS-IA）上海超聲波儀器廠，搖床（HWY-V11）上海智城分析儀器廠。2 實(shí)驗(yàn)方法2.1 菌種培養(yǎng)及發(fā)酵方法取實(shí)驗(yàn)室保藏的藤黃八疊

11、球菌種，接種于斜面培養(yǎng)基上活化2代后，取2-3代長(zhǎng)勢(shì)良好的菌群，無(wú)菌操作，將菌接于種子液中，30搖床轉(zhuǎn)速180r/min，培養(yǎng)20h，將含菌種子液以10%接種量用無(wú)菌移液管移取加入新配制的發(fā)酵液中，30搖床轉(zhuǎn)速180r/min，培養(yǎng)18h。2.2 生物轉(zhuǎn)化方法將發(fā)酵后的發(fā)酵液于3500r/min離心后去除上清液，沉淀為濕菌種，加少量TLo轉(zhuǎn)化液用超聲波細(xì)胞搗碎機(jī)破壁10min后，按100mg/ml菌體量加入TLo轉(zhuǎn)化液,于30、轉(zhuǎn)速180r/min震蕩轉(zhuǎn)化6h。 2.3 GSH產(chǎn)量分析方法2.3.1 胞內(nèi)谷胱甘肽含量測(cè)定：ALLOXAN試劑衍生法，見(jiàn)文獻(xiàn)42.3.2 GSH樣品標(biāo)準(zhǔn)曲線：利用最

12、小二乘法可得到兩者關(guān)系，C（GSH）=（812.13*A-6.03388）×307.33 相關(guān)系數(shù)R=0.9983 見(jiàn)文獻(xiàn)2 2.4 轉(zhuǎn)化物理因素的研究 圖.1 樣品GSH標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard line of specimen GSH對(duì)轉(zhuǎn)化的溫度、pH、時(shí)間、搖床轉(zhuǎn)速、菌種破壁時(shí)間選擇依次進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，以確定最佳的轉(zhuǎn)化條件中物理因素。2.4.1溫度發(fā)酵液按100mg/ml菌體量加入TLo轉(zhuǎn)化液，用超聲波破壁后，取4個(gè)三角瓶，按15ml/瓶加入三角瓶中，分別放入溫度為28、30、37、50 轉(zhuǎn)速均為180r/min的搖床轉(zhuǎn)化6h，測(cè)轉(zhuǎn)化液GHS產(chǎn)量。2.4.2pH新配制的T

13、Lo轉(zhuǎn)化液，以15ml/瓶分裝4個(gè)三角瓶，用1N NaOH 將pH調(diào)至6.5、7.0、7.5、8.0，同樣按100mg/ml菌體等量加入4種不同pH轉(zhuǎn)化液中，溫度37搖床轉(zhuǎn)速180r/min，6小時(shí)后測(cè)轉(zhuǎn)化液GHS產(chǎn)量。2.4.3時(shí)間發(fā)酵液按100mg/ml濕菌量加入新配制的pH為7.5轉(zhuǎn)化液，取250ml瓶4個(gè)，每瓶加入15ml含濕菌的TLo轉(zhuǎn)化液，搖床設(shè)定37、180r/min，轉(zhuǎn)化時(shí)間為3h、6h、9h、12h后各取出一瓶測(cè)轉(zhuǎn)化液GHS產(chǎn)量。 2.4.4搖床轉(zhuǎn)速按100mg/ml濕菌量加入新配制的pH為7.5轉(zhuǎn)化液，取250ml的三角瓶4個(gè)，每瓶用移液管移取15ml含濕菌轉(zhuǎn)化液，放入溫度

14、為37轉(zhuǎn)速分別設(shè)為150r/min、180r/min、200r/min、230r/min的搖床，轉(zhuǎn)化6h然后測(cè)轉(zhuǎn)化液GHS產(chǎn)量。2.4.5菌種破壁時(shí)間選擇離心除去發(fā)酵液，對(duì)濕菌進(jìn)行分步同時(shí)實(shí)驗(yàn)如下:1、 濕菌1.5g加pH7.5 TLo轉(zhuǎn)化液15ml，用超聲波破壁20min，試驗(yàn)號(hào)記為d2、取濕菌3g加少量pH7.5TLo轉(zhuǎn)化液，搖勻用超聲波破壁10min，加轉(zhuǎn)化液至30ml（即含濕菌100mg/ml）分入兩個(gè)三角瓶，15ml/瓶，試驗(yàn)號(hào)記a、b3、同時(shí)取濕菌1.5g加pH7.5Tlo轉(zhuǎn)化液15ml移入三角瓶試驗(yàn)號(hào)記為c4、a放入冰箱冷凍，b、c、d放入37 速200r/min搖床轉(zhuǎn)化6h后，

15、C用超聲波破壁10min后和b、c、d同時(shí)以3500r/min離心機(jī)離心15min 測(cè)轉(zhuǎn)化液GHS產(chǎn)量。2.5 轉(zhuǎn)化化學(xué)因素的研究2.5.1轉(zhuǎn)化液成分 用正交試驗(yàn)方法對(duì)轉(zhuǎn)化液中葡萄糖、MgCl2、底物氨基酸的濃度的比例進(jìn)行優(yōu)化。2.5.2酶液激活劑酶激活劑一般以無(wú)機(jī)鹽離子為主，本文選用生物實(shí)驗(yàn)中常用無(wú)機(jī)鹽微量元素進(jìn)行研究，欲尋找能激活胞內(nèi)谷胱甘肽酶的微量元素。 表.1 微量元素的種類(lèi)和濃度Table.1 Species and consistency of micro-mineral編號(hào) 12345678化合物名稱(chēng)H3BO3CoCl2FeCl3ZnSO4MnCl2(NH4)6Mo7O24CuS

16、O4·5N2OCaCl2化合物濃度(mg/L)0.021.000.2020.00.020.140.021.11g/L在發(fā)酵進(jìn)行到18h時(shí)，用離心機(jī)離心得具有最大酶活的濕菌，按100mg濕菌/ml加入新配制的轉(zhuǎn)化液，分裝入9個(gè)三角瓶，15ml/瓶，編號(hào)0-8，0號(hào)為對(duì)照樣不加其他微量元素，1-8號(hào)按表1加入微量元素。轉(zhuǎn)化后測(cè)GSN含量。2.6 轉(zhuǎn)化生物因素的研究二步轉(zhuǎn)化以2.4.1中菌種破壁時(shí)間選擇中編號(hào)為a、c的實(shí)驗(yàn)三角瓶制做方法加新配制轉(zhuǎn)化液轉(zhuǎn)化后記編號(hào)為a1、c1 。 測(cè)a1（只發(fā)酵不轉(zhuǎn)化）和c1（發(fā)酵后轉(zhuǎn)化一步）的GSM產(chǎn)量。c1用轉(zhuǎn)速3500r/min離心15min后去除第一

17、步轉(zhuǎn)化時(shí)的殘菌體，上清液繼續(xù)按100mg/ml 加入發(fā)酵成熟的新菌種，取3個(gè)三角瓶，15mg/瓶編號(hào)H1，H2，H3進(jìn)行第二步轉(zhuǎn)化，測(cè)GSN產(chǎn)量。3 結(jié)果與討論：3.1 物理因素對(duì)GSH產(chǎn)量的影響:3.1.1 轉(zhuǎn)化溫度對(duì)GSH產(chǎn)量的影響：表.2 溫度上升對(duì)GSH產(chǎn)量的影響Table.2 Effect of increased temperature on production of GSH表.3 pH改變對(duì)GSH產(chǎn)量的影響 Table.3 Effect of changed pH on production of GSH在轉(zhuǎn)化過(guò)程中選擇一般適合細(xì)菌生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)室有培養(yǎng)箱的幾個(gè)溫度點(diǎn)如28、30、3

18、7、50進(jìn)行轉(zhuǎn)化試驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果(見(jiàn)表2),GSH在溫度較低時(shí)隨溫度升高而增加，37時(shí)產(chǎn)量達(dá)到最大，溫度再升高，到50GSH的產(chǎn)量下降了。這表明，在37谷胱甘肽合成酶具有最大活性。如有機(jī)會(huì)可進(jìn)行3750之間的溫度試驗(yàn)，以尋找更精確的溫度點(diǎn)。編號(hào)pH1pH2pH3pH4pH6.57.07.58.2A3050.6440.6890.7320.301C(mg/L)158.7169.93180.65172.92編號(hào)T1T2T3T4T()28303750A3050.7680.8070.8730.801C(mg/L)169.6199.4215.8197.93.1.2 轉(zhuǎn)化液pH對(duì)GSH產(chǎn)量的影響:轉(zhuǎn)化過(guò)程中選

19、擇菌種生長(zhǎng)的合適的pH6.5 7.0 7.5 8.0 試驗(yàn)結(jié)果顯示（見(jiàn)表3）,pH從弱酸性到中性過(guò)程,GHS產(chǎn)量隨pH升高而增加.當(dāng)pH達(dá)到7.5成弱堿性時(shí)產(chǎn)量最大180.65mg/L堿性繼續(xù)增強(qiáng)到8.0時(shí)產(chǎn)量下降.這表明pH7.5時(shí)最合適谷胱甘肽合成酶生理活性的發(fā)揮。3.1.3 轉(zhuǎn)化時(shí)間對(duì)GSH產(chǎn)量的影響：編號(hào)R1R2R3R4轉(zhuǎn)速(r/min)150180200230A3050.5120.6080.430.647C(mg/L)125.80149.74158.46159.46表.5 搖床轉(zhuǎn)速增加對(duì)GSH產(chǎn)量的影響Table.5 Effect of increased rotational sp

20、eed on production of GSH轉(zhuǎn)化過(guò)程開(kāi)始后每隔3h取樣一次測(cè)GSH的產(chǎn)量，3h、6h、9h、12h共四次。實(shí)驗(yàn)結(jié)果（見(jiàn)表4），在轉(zhuǎn)化到達(dá)6h時(shí)GSH的產(chǎn)量達(dá)最大值166.19mg/L 繼續(xù)延長(zhǎng)轉(zhuǎn)化時(shí)間產(chǎn)量沒(méi)有明顯增加，并且可以從實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)看出長(zhǎng)時(shí)間的搖床運(yùn)行會(huì)使GSH有所氧化而導(dǎo)致產(chǎn)量的下降。編號(hào)t1t2t3t4T (h)36912A3050.5720.6740.6820.669C(mg/L)140.76166.19168.1164.9表.4 轉(zhuǎn)化時(shí)間對(duì)GSH的影響Table.4 Effect of length of time on production of GSH 3.

21、1.4 搖床轉(zhuǎn)速對(duì)GSH產(chǎn)量的影響：由于藤黃八疊菌種是好氧菌GSH合成需要大量ATP，所以轉(zhuǎn)化過(guò)程中提高搖床轉(zhuǎn)速有利于產(chǎn)量的增加。但通氧量的增加同時(shí)加速了GSH的氧化。因此當(dāng)兩者達(dá)到平衡時(shí)搖床的轉(zhuǎn)速是最佳的。實(shí)驗(yàn)轉(zhuǎn)速設(shè)定為150r/min 180r/min 200r/min 230r/min 四檔，結(jié)果表明（見(jiàn)表5），當(dāng)轉(zhuǎn)速達(dá)到200r/min時(shí)產(chǎn)量接近最大值158.46mg/L。繼續(xù)提高轉(zhuǎn)速到230r/min產(chǎn)量沒(méi)有明顯增加。3.1.5 細(xì)胞破壁時(shí)間選擇對(duì)GSH產(chǎn)量的影響：實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明（見(jiàn)表6、圖2），對(duì)菌種在轉(zhuǎn)化后破壁比轉(zhuǎn)化前破壁產(chǎn)品GSH的產(chǎn)量要高，破壁時(shí)間10min比20min效果要好

22、。數(shù)據(jù)顯示c瓶產(chǎn)量181.90mg/L最高。 表.6 細(xì)胞破壁時(shí)間不同對(duì)GSH產(chǎn)量的影響 Table.6 Effect of different time of cellwall broken On production of GSH 圖.2 GSH產(chǎn)量的比較 Fig.2 Comparison of production of GSH編號(hào)abcdA3050.5870.6140.7370.704C (mg/L)144.50151.23181.90173.67（注釋?zhuān)篴 只發(fā)酵不轉(zhuǎn)化時(shí)GSH的產(chǎn)量（對(duì)照樣）, b 轉(zhuǎn)化前破壁10min, c 轉(zhuǎn)化后破壁10min, d 轉(zhuǎn)化前破壁20min）.32

23、化學(xué)因素對(duì)GSH產(chǎn)量的影響：321轉(zhuǎn)化液基本成分對(duì)GSH產(chǎn)量的影響因?yàn)榧?xì)菌生物轉(zhuǎn)化合成谷胱甘肽的必需營(yíng)養(yǎng)包括葡萄糖，谷氨酸、甘氨酸，半胱氨酸三種底物和必要的酶激活劑。以TLo轉(zhuǎn)化液為基礎(chǔ)對(duì)葡萄糖、MgCl2 底物濃度進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)。表.7 實(shí)驗(yàn)水平和因素Table.7 Factors and level of experiment因素 1(葡萄糖)2(MgCl2)3(底物)A305C(mg/L)11110.633155.9721220.647159.4631330.512125.8042120.654161.2152230.663163.4562310.553136.0273130.721177

24、.9183210.789194.8693320.569140.01K1 (mg/L)441.23495.09486.85K2 (mg/L)160.68517.77460.68K3 ( mg/L)512.78401.83467.16R71.55115.9426.17 因素 葡萄糖（mol/L）MgCl2 （mol/L）底物濃度 （mol/L） 10.250.0050.0320.50.010.1030.750.020.20表.8 正交實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)Table.8 Date of orthogonal optimization正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果（見(jiàn)表7、表8）顯示：從GSH產(chǎn)量看最佳實(shí)際配方為8號(hào)瓶，從K值分析

25、最佳理論配方為3、2、1組合也是8號(hào)瓶，理論與實(shí)際吻合。從R值分析表明葡萄糖和MgCl2的濃度和對(duì)轉(zhuǎn)化的影響較大，底物濃度的影響較小，從實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定轉(zhuǎn)化液的配制為：葡萄糖0.75mol/L，MgCl2 0.01mol/L, 底物濃度0.03mol/L。有機(jī)會(huì)還可對(duì)MgCl2濃度進(jìn)行微調(diào)研究，以更好的優(yōu)化配方。322 微量元素對(duì)GSH產(chǎn)量的影響：編號(hào)012345678A3050.5860.6340.4930.5940.7660.5040.6020.6360.590C(mg/L)144.25156.22121.06146.25189.13123.81148.24156.72145.25在發(fā)酵進(jìn)行到

26、18h時(shí)，用離心機(jī)離心得具有最大酶活的濕菌，按100mg/ml加入新配制的轉(zhuǎn)化液分裝入9個(gè)三角瓶 15ml/瓶，編號(hào)0-8，0號(hào)為對(duì)照樣不加其他微量元素，1-8號(hào)按表1加入微量元素。轉(zhuǎn)化后測(cè)GSN含量。表.9 比較各種微量元素對(duì)GSH產(chǎn)量的影響Table.9 comparison of different micro-minerals effect on production of GSH 由此實(shí)驗(yàn)0到8號(hào)GSH的產(chǎn)量數(shù)據(jù)（見(jiàn)表9、圖3）顯示：加有微量元素Zn的4號(hào)其GSH產(chǎn)量為189.13mg/l最大，較不加微量元素的0號(hào)144.25mg/l高出44.88mg/l ，提高33.11%證明轉(zhuǎn)化

27、液中，如加入20mg/l ZnSO4·7H2O時(shí)，可提高酶活，從而提高GSH產(chǎn)量。 圖.3 0-8號(hào)瓶GSH產(chǎn)量的比較Fig.3 comparison of production of GSH range from No.0-833 生物因素對(duì)GSH產(chǎn)量的影響： 實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)同一批菌種進(jìn)行只發(fā)酵不轉(zhuǎn)化的a1瓶測(cè)GSH的產(chǎn)量（對(duì)照樣）c1瓶發(fā)酵一步測(cè)GSH產(chǎn)量。H1 H2 H3瓶發(fā)酵二步后測(cè)GSH產(chǎn)量， H是H1 H2 H3的平均值。 表.10 生物轉(zhuǎn)化中各步GSH產(chǎn)量的比較 Table.10 Comparison of production of GSH on different steps編號(hào)a1c1H1H2H3c1-A1H-a1A3050.5800.7620.9320.9370.9350.1820.193C(mg/L)142.75188.13230.52231.76231.2745.3843.05 由實(shí)驗(yàn)得出（見(jiàn)表10、圖4）二步轉(zhuǎn)化產(chǎn)量平均值43.05mg/L和一步轉(zhuǎn)化的產(chǎn)量持平，一二步轉(zhuǎn)化總產(chǎn)量較菌種發(fā)酵后轉(zhuǎn)化前提高88.43mg/l，提高率61.94%。圖.4 各步GSH產(chǎn)量的比較Fig.4 comparison of production of GSH 4 結(jié)論 綜上所述，通過(guò)一系列從探索到證明的系統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)，證明了藤黃八疊球菌X2