生物分離工程 第五章 層析ppt課件

1、層 析主講：楊麗芬主講：楊麗芬1. 起源起源 19031903年，俄國的植物學(xué)家年，俄國的植物學(xué)家茨維特茨維特（TsweetTsweet）提出。）提出。19011901年的時候開始研究色譜現(xiàn)象。年的時候開始研究色譜現(xiàn)象。19031903年，他將年，他將植物植物葉子葉子的的石油醚提取液石油醚提取液倒入到填裝倒入到填裝CaCOCaCO3 3的玻璃的玻璃管內(nèi)，用純凈的管內(nèi)，用純凈的石油醚淋洗石油醚淋洗，產(chǎn)生了不同的，產(chǎn)生了不同的色帶色帶，她們分別為胡蘿卜素、葉黃素、和葉綠素她們分別為胡蘿卜素、葉黃素、和葉綠素A A。所以。所以稱之為色譜法（層析）。稱之為色譜法（層析）。 層析技術(shù)的特點層析技術(shù)的特點

2、 分離精度高分離精度高、設(shè)備簡單設(shè)備簡單、操作方便操作方便，在物質(zhì)成分，在物質(zhì)成分的的定量分析定量分析、檢測檢測、制備分離制備分離與與純化純化方面應(yīng)用廣方面應(yīng)用廣泛，是下游技術(shù)加工過程中最重要的純化技術(shù)之泛，是下游技術(shù)加工過程中最重要的純化技術(shù)之一。一。 2 3 層析的原理層析的原理 據(jù)混合物中，溶質(zhì)在據(jù)混合物中，溶質(zhì)在互不相溶互不相溶的兩相之間的兩相之間分配行為分配行為的差別，引起的差別，引起移動速度移動速度的不同而進(jìn)行分離的方法。的不同而進(jìn)行分離的方法。 互不相溶的兩相分別稱為互不相溶的兩相分別稱為固定相固定相和和流動相流動相，固定相，固定相填充于柱中，在柱的頂端加入一定量的料液后，連填充

3、于柱中，在柱的頂端加入一定量的料液后，連續(xù)輸入流動相，料液中的續(xù)輸入流動相，料液中的溶質(zhì)溶質(zhì)在在固定相固定相和和流動相流動相中中發(fā)生擴散傳質(zhì)，發(fā)生擴散傳質(zhì)，產(chǎn)生分配平衡產(chǎn)生分配平衡。分配系數(shù)大的溶質(zhì)分配系數(shù)大的溶質(zhì)在固定相上存的幾率大，隨流動相移動的速度??；在固定相上存的幾率大，隨流動相移動的速度?。环峙湎禂?shù)小的溶質(zhì)在固定相上存的幾率小，隨流動分配系數(shù)小的溶質(zhì)在固定相上存的幾率小，隨流動相移動的速度大相移動的速度大。 在層析柱出口，各在層析柱出口，各溶質(zhì)濃度溶質(zhì)濃度隨隨時間時間的變化圖稱作的變化圖稱作洗洗脫曲線脫曲線。4 5 層析的分類層析的分類 按流動相的按流動相的相態(tài)相態(tài)：氣相層析法氣相層

4、析法、液相層析法液相層析法、超臨界流體層析法超臨界流體層析法。固定相可以是。固定相可以是固體固體、液體液體、以固體為載體的以固體為載體的液體薄層液體薄層。生物物質(zhì)一般在水溶。生物物質(zhì)一般在水溶液中，故生物分離一般采用液中，故生物分離一般采用液相層析法液相層析法。 按按固定相形狀固定相形狀：液相層析液相層析分為分為紙層析紙層析、薄層層薄層層析析、柱層析柱層析。紙層析和薄層層析主要用于。紙層析和薄層層析主要用于分析分析（定性或定量定性或定量），柱層析主要用于），柱層析主要用于制備分離制備分離。 按按操作壓力操作壓力：以：以固體為固定相固體為固定相的液相層析又分的液相層析又分為為低壓低壓（t0后輸入

5、后輸入不含溶質(zhì)的流動相，則式子的初始和邊界條件為：不含溶質(zhì)的流動相，則式子的初始和邊界條件為：當(dāng)料液量很小式，可認(rèn)為料液為脈沖輸入，上式為洗當(dāng)料液量很小式，可認(rèn)為料液為脈沖輸入，上式為洗脫曲線，呈脫曲線，呈Poisson分布（泊松分布）。若果分布（泊松分布）。若果N值很大值很大，則溶質(zhì)的洗脫曲線則溶質(zhì)的洗脫曲線可用可用Gauss分布分布（正態(tài)分布）（正態(tài)分布）近似近似，即即15 其中 16 或說明，理說明，理論板數(shù)越多論板數(shù)越多，洗脫峰越窄洗脫峰越窄，溶質(zhì)之間的分離，溶質(zhì)之間的分離程度越好，利用程度越好，利用實測的洗脫峰實測的洗脫峰和式子可計算層析柱的和式子可計算層析柱的理論板數(shù)理論板數(shù)。17

6、 理論板模型僅用一個理論板模型僅用一個理論板數(shù)理論板數(shù)描述層析柱的描述層析柱的分離性分離性能能，使用方便，使用方便，特別適合于料液濃度很低的分析過特別適合于料液濃度很低的分析過程程。但是，理論板模型。但是，理論板模型不能確定層析柱的分離性能不能確定層析柱的分離性能的影響因素的影響因素，特別對于料液濃度較高的制備分離過，特別對于料液濃度較高的制備分離過程。程。 軸向擴散模型軸向擴散模型 考慮到溶質(zhì)在流動向和固定相間的考慮到溶質(zhì)在流動向和固定相間的傳質(zhì)速率傳質(zhì)速率及流動及流動向的向的流動狀態(tài)流動狀態(tài)。該模型假設(shè)固定相為均質(zhì)球形顆粒，。該模型假設(shè)固定相為均質(zhì)球形顆粒，溶質(zhì)在固定相內(nèi)溶質(zhì)在固定相內(nèi)無對

7、流運動無對流運動，利用，利用均質(zhì)固相模型均質(zhì)固相模型進(jìn)進(jìn)行物料衡算，最后求出：行物料衡算，最后求出：18 從圖上可知，從圖上可知，存在某一流速使存在某一流速使HETPHETP最小最小，在此流速下塔板理在此流速下塔板理論數(shù)最大，分離效果最好論數(shù)最大，分離效果最好。在。在液相層析液相層析的操作條件下，一般的操作條件下，一般分子擴散的影響可忽略不計。分子擴散的影響可忽略不計。因此，因此，為提高分離效果為提高分離效果，可通，可通過過降低流速降低流速或或減小固定相粒徑減小固定相粒徑來降低來降低HETPHETP，提高理論板數(shù)提高理論板數(shù)。由于減低流速意味著增加分離由于減低流速意味著增加分離時間，故時間，故

8、采用減小粒徑的方法采用減小粒徑的方法可同時保證分離操作的速度和可同時保證分離操作的速度和高精度高精度，這是高效液相層析的，這是高效液相層析的理論基礎(chǔ)。很短的層析柱具有理論基礎(chǔ)。很短的層析柱具有很大的理論板數(shù)，對高速度和很大的理論板數(shù)，對高速度和高精度的分析非常有利。高精度的分析非常有利。19分離度？分離度？又稱為又稱為分別率分別率。表示兩個。表示兩個相鄰相鄰的的洗脫峰洗脫峰之間的之間的距離距離與兩個與兩個縫寬的代數(shù)平均值縫寬的代數(shù)平均值之之比比。 通過通過增大峰間距離增大峰間距離或或降低縫寬降低縫寬可提高溶質(zhì)之間的分離可提高溶質(zhì)之間的分離度。度。容量因子容量因子（k）固定相和流動相間固定相和流

9、動相間溶質(zhì)分配量之比溶質(zhì)分配量之比。選擇性（選擇性（）洗脫峰相鄰的兩種溶質(zhì)的洗脫峰相鄰的兩種溶質(zhì)的容量因子之比容量因子之比。20Rs1時，溶時，溶質(zhì)的分離已質(zhì)的分離已經(jīng)較好。一經(jīng)較好。一般把般把Rs值應(yīng)值應(yīng)在在11.3之間之間21 假定曲線呈高斯分布，將假定曲線呈高斯分布，將平均洗脫時間平均洗脫時間和和底線處切底線處切線縫寬線縫寬的的公式公式代入分離度的公式得：代入分離度的公式得： 對于兩個相鄰的洗脫組分，假定對于兩個相鄰的洗脫組分，假定洗脫縫寬洗脫縫寬和和分配系分配系數(shù)近似相等數(shù)近似相等，即，即W1=W2，m1=m2，上式簡化：上式簡化： 將將塔板數(shù)塔板數(shù)的公式代入得：的公式代入得：22將容

10、量因子的公式代入得：將容量因子的公式代入得：分離度隨著理論塔板數(shù)的增大而增大分離度隨著理論塔板數(shù)的增大而增大，當(dāng)兩種溶質(zhì)的當(dāng)兩種溶質(zhì)的分配系數(shù)（容量因子）相差較小時分配系數(shù)（容量因子）相差較小時，需要較多的理論需要較多的理論板數(shù)板數(shù)才能獲得較大的分離度。才能獲得較大的分離度。23 凝膠過濾層析凝膠過濾層析（Gel filtration chromatography，GFC）1. 1. 原理與操作原理與操作用用凝膠粒子凝膠粒子為固定相，根據(jù)料液中溶質(zhì)為固定相，根據(jù)料液中溶質(zhì)相對分子質(zhì)量相對分子質(zhì)量的的差別差別進(jìn)行分離的液相層析法。進(jìn)行分離的液相層析法。2425 26 基本概念基本概念洗脫體積洗脫

11、體積 27GFC的洗脫曲線的洗脫曲線28洗脫體積洗脫體積（V Ve e）是指將樣品中某一組分洗脫下來所是指將樣品中某一組分洗脫下來所需洗脫液的體積。需洗脫液的體積。它包括自它包括自加入樣品加入樣品時算起，到組時算起，到組分分最大濃度出現(xiàn)最大濃度出現(xiàn)時所流出的體積。時所流出的體積。 V Ve e一般是介于一般是介于V Vo o 和和之間的。之間的。 對于對于完全排阻完全排阻的大分子由于其不進(jìn)入凝膠顆粒內(nèi)，的大分子由于其不進(jìn)入凝膠顆粒內(nèi)， 故其洗脫體積：故其洗脫體積： V Ve e V Vo o 對于對于完全滲透完全滲透的小分子由于它可以存在于凝膠柱整的小分子由于它可以存在于凝膠柱整個體積內(nèi)，故其

12、洗脫體積：個體積內(nèi)，故其洗脫體積： V Ve e 分子量介于二者之間的分子，它們的洗脫體積也介分子量介于二者之間的分子，它們的洗脫體積也介于二者之間。于二者之間。29洗脫體積的測定？洗脫體積的測定？可以通過測定可以通過測定完全排阻完全排阻的大分子物的大分子物質(zhì)的洗脫體積來測定，一般常用質(zhì)的洗脫體積來測定，一般常用作作為為測定測定?？梢酝ㄟ^測定可以通過測定的小分子溶的小分子溶質(zhì)質(zhì)的洗脫體積來測定的洗脫體積來測定 即即 V Ve eV Vo oV Vi i 推出推出 V Vi i V Ve e V Vo o可用下式計算：可用下式計算： VtVt（D/2D/2）2 2h h 2 2）根據(jù)）根據(jù) Vt

13、VtV Vo oV Vi i V Vs s 可以得到可以得到 3 3）加入一定量的水至層析柱預(yù)定標(biāo)記處，然后測量）加入一定量的水至層析柱預(yù)定標(biāo)記處，然后測量水的體積水的體積。30對某物質(zhì)在凝膠柱內(nèi)洗脫體積對某物質(zhì)在凝膠柱內(nèi)洗脫體積VeVe、V Vo o和和ViVi之間的關(guān)之間的關(guān)系可用下式表示：系可用下式表示： VeVomVi m m為每個溶質(zhì)分子在流動相和固定相之間的一個特為每個溶質(zhì)分子在流動相和固定相之間的一個特定的定的分配系數(shù)分配系數(shù)。m m可通過實驗由可通過實驗由VeVe、VoVo和和ViVi求得。求得。V V0 0 VomVi VVt t 推出推出0m0m1 1，所以，所以GFCGF

14、C的分離的分離精度有限。精度有限。 對于對于的大分子的大分子 V Ve e V Vo o 故故 對于對于的小分子的小分子 V Ve e V Vt t 故故 m m 1 1mVeV0Vi31 但實際上，約有但實際上，約有1/51/5的內(nèi)水因溶劑化作用而呈水合的內(nèi)水因溶劑化作用而呈水合狀態(tài)，妨礙小分子的自由擴散。故實際上狀態(tài)，妨礙小分子的自由擴散。故實際上VeVe小分子小分子 VoVo0.8Vi0.8Vi；當(dāng)當(dāng)0 0m ml l時時，意味著溶質(zhì)分子只有，意味著溶質(zhì)分子只有部分向凝膠顆粒內(nèi)擴散部分向凝膠顆粒內(nèi)擴散，m m愈大，進(jìn)入凝膠顆粒內(nèi)愈大，進(jìn)入凝膠顆粒內(nèi)的程度愈大；的程度愈大；m m0.50.

15、5時，其洗脫體積時，其洗脫體積VeVeVoVo十十0.5Vi0.5Vi。 GFCGFC中溶質(zhì)的分配系數(shù)中溶質(zhì)的分配系數(shù)m m只是只是相對分子質(zhì)量相對分子質(zhì)量、分子形分子形狀狀、和、和凝膠結(jié)構(gòu)凝膠結(jié)構(gòu)的函數(shù)，與洗脫液的的函數(shù)，與洗脫液的pHpH和和離子強度離子強度等物性等物性無關(guān)無關(guān)，即在一般的層析操作條件下，即在一般的層析操作條件下，相對分相對分子質(zhì)量一定的溶質(zhì)的分配系數(shù)為一常數(shù)子質(zhì)量一定的溶質(zhì)的分配系數(shù)為一常數(shù)。GFCGFC一般一般采用組成一定的洗脫液進(jìn)行洗脫即采用組成一定的洗脫液進(jìn)行洗脫即恒定洗脫法恒定洗脫法。 322.凝膠過濾介質(zhì)凝膠過濾介質(zhì)良好凝膠過濾介質(zhì)的要求：良好凝膠過濾介質(zhì)的要求

16、：親水性高、表面惰性（不存在相互作用）；親水性高、表面惰性（不存在相互作用）；穩(wěn)定性強，在較寬的穩(wěn)定性強，在較寬的pHpH范圍及化學(xué)試劑中保持穩(wěn)定；范圍及化學(xué)試劑中保持穩(wěn)定；具有一定的孔徑分布范圍；具有一定的孔徑分布范圍；機械強度高，允許較高的操作壓力；機械強度高，允許較高的操作壓力；常用的凝膠介質(zhì)常用的凝膠介質(zhì)33名稱名稱基質(zhì)基質(zhì)制造商制造商Sephadex G(10-200)Sephadex G(10-200)交聯(lián)葡聚糖交聯(lián)葡聚糖PharmaciaPharmaciaSepharose 2BSepharose 2B、4B4B、6B6B瓊脂糖瓊脂糖PharmaciaPharmaciaSepha

17、rose CL 4BSepharose CL 4B、6B 6B 交聯(lián)瓊脂糖交聯(lián)瓊脂糖PharmaciaPharmaciaSephacryl S Sephacryl S 系列系列聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺- -葡聚糖葡聚糖PharmaciaPharmaciaSuperdex Superdex 系列系列高交聯(lián)瓊脂糖高交聯(lián)瓊脂糖- -葡聚糖葡聚糖PharmaciaPharmaciaSuperose Superose 系列系列高交聯(lián)瓊脂糖（二次交聯(lián)）高交聯(lián)瓊脂糖（二次交聯(lián)）PharmaciaPharmaciaBio-Beads S-XBio-Beads S-X系列系列苯乙烯苯乙烯- -二乙烯苯二乙烯苯Bio

18、RadBioRadBio-GelP Bio-GelP 系列系列聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺BioRadBioRadBio-GelA Bio-GelA 系列系列瓊脂糖瓊脂糖BioRadBioRadTSKgel SW TSKgel SW 系列系列硅膠硅膠ToyoSodaToyoSodaTSKgel Toyopearl HW TSKgel Toyopearl HW 系系列列親水性聚乙烯醇親水性聚乙烯醇ToyoSodaToyoSodaTSKgel PW TSKgel PW 系列系列親水性聚乙烯親水性聚乙烯ToyoSodaToyoSodaTSKgel CW-35 TSKgel CW-35 系列系列纖維素纖維素T

19、oyoSodaToyoSodaCellulofineCellulofine纖維素纖維素ChissoChisso機械強度高半剛性凝膠，中壓液相層析用高壓液相層析用兩者均具剛性結(jié)構(gòu)34 凝膠的特性參數(shù)凝膠的特性參數(shù)排阻極限排阻極限：不能擴散到凝膠網(wǎng)絡(luò)內(nèi)部的最小分子的不能擴散到凝膠網(wǎng)絡(luò)內(nèi)部的最小分子的相對分子質(zhì)量。如：相對分子質(zhì)量。如：Sephadex G50的排阻極限為的排阻極限為30KD。分級范圍分級范圍：能為凝膠阻滯并且相互之間可以得到分：能為凝膠阻滯并且相互之間可以得到分離的溶質(zhì)的相對分子質(zhì)量范圍。離的溶質(zhì)的相對分子質(zhì)量范圍。 Sephadex G50：1.530KD。溶脹率溶脹率：每克干凝

20、膠所吸收的水分的百分?jǐn)?shù)。：每克干凝膠所吸收的水分的百分?jǐn)?shù)。 溶脹率溶脹率=100%（溶脹處理平衡后的重量）（溶脹處理平衡后的重量）/干燥重量干燥重量床體積床體積：1g干燥凝膠溶脹后所占的體積。凝膠的床干燥凝膠溶脹后所占的體積。凝膠的床體積可用于體積可用于估算估算裝滿一定體積的層析柱所需要的裝滿一定體積的層析柱所需要的干干凝膠量凝膠量。凝膠粒徑凝膠粒徑：多用篩目或微米表示。：多用篩目或微米表示。35孔隙體積孔隙體積：層析柱中凝膠之間孔隙的體積，用：層析柱中凝膠之間孔隙的體積，用V0表表示。用相對分子質(zhì)量大于排阻極限的溶質(zhì)測定。示。用相對分子質(zhì)量大于排阻極限的溶質(zhì)測定。3.影響分離特性的因素影響分

21、離特性的因素 HETP影響溶質(zhì)的分離度，影響影響溶質(zhì)的分離度，影響HETP的因素：的因素：線速度：流動相在軸向上的流動速度。線速度：流動相在軸向上的流動速度。料液體積料液體積料液濃度料液濃度 根據(jù)分離原理來說，根據(jù)分離原理來說，溶質(zhì)的洗脫時間溶質(zhì)的洗脫時間tR和和HETP與料與料液的濃度無關(guān)。液的濃度無關(guān)。實際操作中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)料實際操作中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)料液濃度較高液濃度較高時，洗脫曲線不對稱，出現(xiàn)時，洗脫曲線不對稱，出現(xiàn)吐舌吐舌和和拖尾拖尾，甚至出現(xiàn)，甚至出現(xiàn)分裂的兩個峰分裂的兩個峰，原因使料液和流動相的，原因使料液和流動相的粘度差粘度差引起引起的。經(jīng)驗表明料液和流動相的的。經(jīng)驗表明料液和流動相的粘度

22、比粘度比需要需要小于小于2。36排阻極限極小排阻極限很大分子擴散引起急速下降37 用無因此進(jìn)料時間表示料液體積38相對分子質(zhì)量與分配系數(shù)的關(guān)系相對分子質(zhì)量與分配系數(shù)的關(guān)系m m是判斷是判斷分離效果分離效果的一個重要參數(shù)，同時也是的一個重要參數(shù)，同時也是測定蛋測定蛋白質(zhì)分子質(zhì)量白質(zhì)分子質(zhì)量的一個依據(jù)。的一個依據(jù)。對于某一型號的凝膠，在一定的分子質(zhì)量范圍內(nèi)，對于某一型號的凝膠，在一定的分子質(zhì)量范圍內(nèi)，各個組分的各個組分的m m與其與其分子質(zhì)量的對數(shù)分子質(zhì)量的對數(shù)成成線性線性關(guān)系：關(guān)系： m m b blgMr+lgMr+c c 由于由于V Ve e 和和m m也成線性關(guān)系所以同樣有：也成線性關(guān)系所

23、以同樣有： V Ve e b blglgM Mr+r+c c通過將一些已知分子質(zhì)量的通過將一些已知分子質(zhì)量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)在同一凝膠在同一凝膠柱上以柱上以相同條件相同條件進(jìn)行進(jìn)行洗脫洗脫，分別測定，分別測定V Ve e 或或m m，并根據(jù)并根據(jù)上述的線性關(guān)系繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后上述的線性關(guān)系繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后V Ve e 或或m m，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線即可求出其分通過標(biāo)準(zhǔn)曲線即可求出其分子質(zhì)量。子質(zhì)量。39凝膠粒徑凝膠粒徑 通過通過減小粒徑減小粒徑，不僅可以，不僅可以降低降低HETP，還可以，還可以提高提高分離速度分離速度。4.GFC4.GFC的應(yīng)用、特點的應(yīng)用、特點生物大分子的純化生物大分子的

24、純化分子量測定分子量測定脫鹽及去除小分子雜質(zhì)脫鹽及去除小分子雜質(zhì)去熱源物質(zhì)去熱源物質(zhì) 溶液的濃縮溶液的濃縮40A. 凝膠層析凝膠層析操作簡便操作簡便，所需，所需設(shè)備簡單設(shè)備簡單。有時只要。有時只要有一根層析柱便可進(jìn)行工作。分離介質(zhì)有一根層析柱便可進(jìn)行工作。分離介質(zhì)凝膠凝膠完全不需要像離子交換劑那樣復(fù)雜的完全不需要像離子交換劑那樣復(fù)雜的再生再生過程過程便可重復(fù)使用。便可重復(fù)使用。B.B. 分離分離效果較好效果較好，重復(fù)性高。最突出的是樣品，重復(fù)性高。最突出的是樣品回回收率高收率高，接近，接近100100。C. 分離條件分離條件緩和緩和。凝膠骨架親水，分離過程又不。凝膠骨架親水，分離過程又不涉及化

25、學(xué)鍵的變化，所以對分離物的活性沒有涉及化學(xué)鍵的變化，所以對分離物的活性沒有不良影響。不良影響。D.D. 應(yīng)用廣泛應(yīng)用廣泛。適用于各種生化物質(zhì)，如肽類、激。適用于各種生化物質(zhì)，如肽類、激素、蛋白質(zhì)、多糖、核酸的分離純化、脫鹽、素、蛋白質(zhì)、多糖、核酸的分離純化、脫鹽、濃縮以及分析測定等。濃縮以及分析測定等。分離的分子量范圍也很分離的分子量范圍也很寬寬，如，如Sephadex GSephadex G類為類為10102 210105 5d d；SepharoseSepharose類類為為10105 510108 8d d。41離子交換層析離子交換層析 利用利用離子交換劑離子交換劑為固定相，根據(jù)荷電溶質(zhì)

26、與離子交為固定相，根據(jù)荷電溶質(zhì)與離子交換劑之間的換劑之間的靜電相互作用力的差別靜電相互作用力的差別進(jìn)行溶質(zhì)分離的進(jìn)行溶質(zhì)分離的洗脫層析方法。洗脫層析方法。1.原理與操作原理與操作 荷電溶質(zhì)在離子交換劑上的分配系數(shù)可用下式：荷電溶質(zhì)在離子交換劑上的分配系數(shù)可用下式： I 為流動相的離子強度，為流動相的離子強度，A和和B為常數(shù)，為常數(shù)，m為離子強為離子強度無限大時溶質(zhì)的分配系數(shù)度無限大時溶質(zhì)的分配系數(shù)，是，是靜電相互作用以為靜電相互作用以為的非特異性吸附引起的溶質(zhì)在離子交換劑上的分配的非特異性吸附引起的溶質(zhì)在離子交換劑上的分配。42 蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)的分配系數(shù)對離子強度非常敏感分配系數(shù)對離子強度非常

27、敏感，即離子強，即離子強度的微小變化，會引起分配系數(shù)的很大變化。度的微小變化，會引起分配系數(shù)的很大變化。 同一離子強度下不同的蛋白質(zhì)的分配系數(shù)可能相差同一離子強度下不同的蛋白質(zhì)的分配系數(shù)可能相差很大很大。如果采用離子強度不變的流動相進(jìn)行洗脫，。如果采用離子強度不變的流動相進(jìn)行洗脫，兩種蛋白質(zhì)的洗脫體積相差很大，甚至分配系數(shù)大兩種蛋白質(zhì)的洗脫體積相差很大，甚至分配系數(shù)大的蛋白質(zhì)很難得到洗脫，造成的蛋白質(zhì)很難得到洗脫，造成洗脫劑的大量消耗和洗脫劑的大量消耗和洗脫時間的大幅度增加洗脫時間的大幅度增加。所以，。所以，IECIEC很少采用恒定洗很少采用恒定洗脫，多采用流動相離子強度線性增大的脫，多采用流

28、動相離子強度線性增大的線性梯度洗線性梯度洗脫法脫法和離子強度階段改變的和離子強度階段改變的逐次洗脫法逐次洗脫法。 線性洗脫過程中，流動相的離子強度線性增大，溶線性洗脫過程中，流動相的離子強度線性增大，溶質(zhì)的分配系數(shù)連續(xù)降低，移動速度逐漸增大。線性質(zhì)的分配系數(shù)連續(xù)降低，移動速度逐漸增大。線性洗脫可通過洗脫可通過改變離子強度的增大速度改變離子強度的增大速度（濃度梯度），（濃度梯度），調(diào)整溶質(zhì)的洗脫體積調(diào)整溶質(zhì)的洗脫體積，即溶質(zhì)洗脫峰間的距離即溶質(zhì)洗脫峰間的距離，改改變分離度的同時縮短洗脫時間變分離度的同時縮短洗脫時間。43洗脫體積相差很大，消耗大量的洗脫液及洗脫時間44 45逐次洗脫過程逐次洗脫過

29、程，流動相的，流動相的離子強度階段性增大離子強度階段性增大，溶，溶質(zhì)質(zhì)分配系數(shù)的降低分配系數(shù)的降低和和移動速度的增大移動速度的增大也是也是階段性階段性。如果流動相的階躍速度很快，在每種離子強度下的如果流動相的階躍速度很快，在每種離子強度下的洗脫時間都很短，逐次洗脫接近線性梯度洗脫，反洗脫時間都很短，逐次洗脫接近線性梯度洗脫，反之接近恒定洗脫。之接近恒定洗脫。逐次洗脫介于恒定洗脫和線性洗逐次洗脫介于恒定洗脫和線性洗脫之間。脫之間。線性洗脫法線性洗脫法 優(yōu)點：流動相離子強度連續(xù)增大，優(yōu)點：流動相離子強度連續(xù)增大，不出現(xiàn)干擾峰不出現(xiàn)干擾峰，操作范圍廣。操作范圍廣。 缺點：需要特殊缺點：需要特殊設(shè)備調(diào)

30、配濃度梯度設(shè)備調(diào)配濃度梯度。逐次洗脫法逐次洗脫法 優(yōu)點：切換不同鹽濃度的流動相溶液進(jìn)行洗脫，優(yōu)點：切換不同鹽濃度的流動相溶液進(jìn)行洗脫，不不許特殊設(shè)備，操作簡單許特殊設(shè)備，操作簡單 缺點：流動相不連續(xù)變化，缺點：流動相不連續(xù)變化，容易出現(xiàn)干擾峰容易出現(xiàn)干擾峰。46 線性洗脫過程線性洗脫過程線性洗脫條件下，線性洗脫條件下，IEC柱內(nèi)溶質(zhì)區(qū)帶的柱內(nèi)溶質(zhì)區(qū)帶的后部移動速度后部移動速度高于前部高于前部，即線性洗脫具有，即線性洗脫具有區(qū)帶濃縮區(qū)帶濃縮作用。作用。由于由于軸向返混軸向返混和和傳質(zhì)阻力傳質(zhì)阻力的影響，溶質(zhì)區(qū)帶在洗脫的影響，溶質(zhì)區(qū)帶在洗脫過程中不短的過程中不短的分散分散。區(qū)帶濃縮作用和分散作用達(dá)

31、到一平衡時，區(qū)帶濃縮作用和分散作用達(dá)到一平衡時，區(qū)帶將以區(qū)帶將以一定的寬度向下移動一定的寬度向下移動，即達(dá)到，即達(dá)到準(zhǔn)穩(wěn)態(tài)準(zhǔn)穩(wěn)態(tài)。影響分離度的因素影響分離度的因素 當(dāng)離子強度梯度當(dāng)離子強度梯度I I/ V一定時，一定時，分離度與柱高無分離度與柱高無關(guān)關(guān)。柱高一定時分離度隨離子強度梯度的降低而增柱高一定時分離度隨離子強度梯度的降低而增大大。 分離度與分離度與介質(zhì)粒徑成反比介質(zhì)粒徑成反比，與，與流速的平方根成反比流速的平方根成反比。47 料液量對分離料液量對分離度的影響度的影響利用利用濃縮料液濃縮料液有利于在不影有利于在不影響分離度的前響分離度的前提下提高提下提高IEC柱柱的處理能力的處理能力。（

32、7.5mg蛋白） （3.75mg蛋白）48逐次洗脫過程逐次洗脫過程 如果如果鹽濃度的階躍合理鹽濃度的階躍合理，可以，可以使目標(biāo)溶質(zhì)得到高度使目標(biāo)溶質(zhì)得到高度濃縮濃縮。不合理，鹽濃度太高，會使許多溶質(zhì)同時洗。不合理，鹽濃度太高，會使許多溶質(zhì)同時洗脫，造成分離失敗。脫，造成分離失敗。 A吸附B完全脫附相當(dāng)于梯度非常大的線性梯度濃縮，溶質(zhì)高度濃縮相當(dāng)于恒定洗脫，區(qū)帶寬度增大。49IECIEC的應(yīng)用及特點的應(yīng)用及特點 GFCGFC主要用于生物產(chǎn)物的初步純化和中后期的脫鹽，主要用于生物產(chǎn)物的初步純化和中后期的脫鹽，IECIEC則是蛋白質(zhì)、肽、核酸等生物產(chǎn)物的主要純化則是蛋白質(zhì)、肽、核酸等生物產(chǎn)物的主要純

33、化手段手段。 料液處理量大，具有濃縮作用，可以在較高的流速料液處理量大，具有濃縮作用，可以在較高的流速下操作；下操作； 應(yīng)用范圍廣，優(yōu)化操作條件可大幅度的提高分離的應(yīng)用范圍廣，優(yōu)化操作條件可大幅度的提高分離的選擇性，所需柱長較短；選擇性，所需柱長較短； 產(chǎn)品回收率高；產(chǎn)品回收率高； 商品化的離子交換劑種類多，選擇余地大，價格遠(yuǎn)商品化的離子交換劑種類多，選擇余地大，價格遠(yuǎn)低于親和吸附劑。低于親和吸附劑。 IECIEC的操作變量遠(yuǎn)多用的操作變量遠(yuǎn)多用GFCGFC，影響分離特性的因素非，影響分離特性的因素非常的復(fù)雜，增加了常的復(fù)雜，增加了過程設(shè)計和規(guī)模放大過程設(shè)計和規(guī)模放大的的難度難度。小。小型層析

34、柱的實驗數(shù)據(jù)一般不能用于規(guī)模放大。型層析柱的實驗數(shù)據(jù)一般不能用于規(guī)模放大。50聚焦層析聚焦層析(focusing chromatography) 利用兩性電解質(zhì)分子間利用兩性電解質(zhì)分子間等電點的不同等電點的不同進(jìn)行分離純化進(jìn)行分離純化的的洗脫層析方法洗脫層析方法。利用在較寬。利用在較寬pH范圍內(nèi)具有緩沖作范圍內(nèi)具有緩沖作用的用的多緩沖離子交換劑多緩沖離子交換劑為固定相，同時，利用在較為固定相，同時，利用在較寬寬pH范圍內(nèi)具有緩沖作用的范圍內(nèi)具有緩沖作用的多緩沖劑多緩沖劑做流動相。當(dāng)做流動相。當(dāng)在層析柱內(nèi)通入與柱內(nèi)初始在層析柱內(nèi)通入與柱內(nèi)初始pH不同的多緩沖劑時，不同的多緩沖劑時，柱內(nèi)柱內(nèi)pH緩

35、慢改變，在緩慢改變，在軸向形成連續(xù)的軸向形成連續(xù)的pH梯度梯度，使料，使料液中的溶質(zhì)依據(jù)各自的等電點或者吸附，或者洗脫，液中的溶質(zhì)依據(jù)各自的等電點或者吸附，或者洗脫，逐次向下移動，彼此間得到分離，該方法稱之為逐次向下移動，彼此間得到分離，該方法稱之為聚聚焦層析焦層析。 51 層析聚焦過程示意圖層析聚焦過程示意圖柱內(nèi)pH為pH0用pHe的多緩存液洗脫52 由于溶質(zhì)區(qū)帶由于溶質(zhì)區(qū)帶后部的后部的pH總是總是低于前部低于前部，所以區(qū)帶后，所以區(qū)帶后部總是先于前部移動，區(qū)帶部總是先于前部移動，區(qū)帶受到壓縮受到壓縮，因此，層析，因此，層析聚焦有聚焦有濃縮溶質(zhì)濃縮溶質(zhì)的作用。的作用。多緩沖劑和多離子交換劑多

36、緩沖劑和多離子交換劑 多緩沖劑是多緩沖劑是兩性電解質(zhì)緩沖劑兩性電解質(zhì)緩沖劑，由相對分子質(zhì)量大，由相對分子質(zhì)量大小不一的各種組分構(gòu)成，每種構(gòu)成成分均為小不一的各種組分構(gòu)成，每種構(gòu)成成分均為多羧基多羧基和和多氨基多氨基化合物，存在各自的等電點。化合物，存在各自的等電點。 Pollybuffer 96 pH 96 Pollybuffer 74 pH7 4 Pharmalyte pH10.5 8 53 多緩沖離子交換劑多緩沖離子交換劑可用普通的可用普通的凝膠凝膠過濾介質(zhì)偶聯(lián)過濾介質(zhì)偶聯(lián)特殊的特殊的離子交換基離子交換基制備。制備。 PBE118、94是以是以Sepharose 6B為載體陰離子為載體陰離

37、子交換劑。交換劑。 PBE118 配配 Pharmalyte PBE 94 配配 Pollybuffer 96、 Pollybuffer 74 Mono P是一種弱堿性的陽離子交換劑，可與上是一種弱堿性的陽離子交換劑，可與上述三種緩沖液相配。述三種緩沖液相配。 層析聚焦的應(yīng)用層析聚焦的應(yīng)用 生化生化實驗室規(guī)模實驗室規(guī)模的樣品制備或成分分析。的樣品制備或成分分析。54疏水作用層析疏水作用層析(hydrophobic chromatography)利用固定相利用固定相載體載體上偶聯(lián)的上偶聯(lián)的疏水性配基疏水性配基與流動相中的與流動相中的一些一些疏水分子疏水分子發(fā)生可逆性結(jié)合而進(jìn)行分離的方法，發(fā)生可逆

38、性結(jié)合而進(jìn)行分離的方法，稱之為疏水層析。稱之為疏水層析。疏水性吸附劑疏水性吸附劑 各種凝膠過濾介質(zhì)經(jīng)偶聯(lián)疏水性配基。常用的疏水各種凝膠過濾介質(zhì)經(jīng)偶聯(lián)疏水性配基。常用的疏水性配基主要有性配基主要有苯基苯基、短鏈烷基短鏈烷基（C C3 3C C8 8）、）、烷氨基烷氨基、聚乙二醇聚乙二醇、聚醚聚醚等。等。55 R代表疏水配基代表疏水配基 56 影響疏水性吸附的因素影響疏水性吸附的因素 離子強度及種類。離子強度及種類。 蛋白質(zhì)的疏水作用蛋白質(zhì)的疏水作用隨離子強度的提高而增大隨離子強度的提高而增大，高價離子對疏水作用的影響強高價離子對疏水作用的影響強。 破壞疏水作用的物質(zhì)破壞疏水作用的物質(zhì) SCN-，

39、ClO4-和和I-等離子半徑較大、電荷密度低等離子半徑較大、電荷密度低的陰離子可的陰離子可減弱水分子間的相互作用減弱水分子間的相互作用。 表面活性劑表面活性劑 減弱減弱蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)的疏水性疏水性。 溫度溫度 吸附結(jié)合作用吸附結(jié)合作用隨溫度的升高而增大隨溫度的升高而增大。57HIC的特點的特點由于高濃度鹽溶液中疏水吸附作用增大，可由于高濃度鹽溶液中疏水吸附作用增大，可直接分離鹽析后的蛋白溶液直接分離鹽析后的蛋白溶液?？赏ㄟ^調(diào)節(jié)可通過調(diào)節(jié)疏水配基鏈長和密度調(diào)節(jié)疏水配基鏈長和密度調(diào)節(jié)吸附力，吸附力，可根據(jù)目標(biāo)產(chǎn)物的特性選擇適宜的吸附劑?？筛鶕?jù)目標(biāo)產(chǎn)物的特性選擇適宜的吸附劑。疏水性吸附劑疏水性吸附劑

40、種類多種類多，選擇余地大，價格與，選擇余地大，價格與離子交換劑相當(dāng)。離子交換劑相當(dāng)。58反向?qū)游龇聪驅(qū)游?reverse phase chromatography(reverse phase chromatography，RPC)RPC) 利用利用非極性非極性的的反相介質(zhì)反相介質(zhì)為固定相，為固定相，極性有機溶劑的極性有機溶劑的水溶液水溶液為流動相，根據(jù)溶質(zhì)的為流動相，根據(jù)溶質(zhì)的極性（疏水性）的差極性（疏水性）的差別別進(jìn)行溶質(zhì)分離純化的洗脫層析法，稱之為進(jìn)行溶質(zhì)分離純化的洗脫層析法，稱之為反相層反相層析。析。 RPC中溶質(zhì)通過疏水性相互作用分配于固定相，但中溶質(zhì)通過疏水性相互作用分配于固定相，但

41、RPC固定相表面完全被非極性基團(tuán)所覆蓋固定相表面完全被非極性基團(tuán)所覆蓋，表現(xiàn)強，表現(xiàn)強烈的疏水性。因此，必須采用烈的疏水性。因此，必須采用極性有機溶劑極性有機溶劑（甲醇、甲醇、乙腈）乙腈）或或其水溶液其水溶液進(jìn)行溶質(zhì)的洗脫分離。進(jìn)行溶質(zhì)的洗脫分離。 RPC主要應(yīng)用于主要應(yīng)用于相對分子質(zhì)量低于相對分子質(zhì)量低于5000，特別是，特別是1000以下的非極性小分子以下的非極性小分子物質(zhì)的分析和純化，也可物質(zhì)的分析和純化，也可用于蛋白質(zhì)等生物大分子的分析和純化。用于蛋白質(zhì)等生物大分子的分析和純化。59溶質(zhì)在反相介質(zhì)上的溶質(zhì)在反相介質(zhì)上的分配系數(shù)分配系數(shù)取決于取決于溶質(zhì)溶質(zhì)的的疏水性疏水性。一般疏水性越大

42、，分配系數(shù)越大。一般疏水性越大，分配系數(shù)越大。RPC多采用多采用降低流動相極性的（含水量）的線性梯降低流動相極性的（含水量）的線性梯度洗脫法度洗脫法。 反相介質(zhì)反相介質(zhì) 以以硅膠硅膠為載體，通過為載體，通過硅烷化硅烷化反應(yīng)在硅膠的表面反應(yīng)在硅膠的表面鍵合鍵合非極性分子層非極性分子層制備。制備。 R1和和R2多為甲基，多為甲基，R為為C4、C8、C18烷基或苯基烷基或苯基。其中。其中利用利用C18硅烷化制備的反相介質(zhì)最多，通稱硅烷化制備的反相介質(zhì)最多，通稱ODS。60 高分子聚合物高分子聚合物也可作為反相介質(zhì)的載體也可作為反相介質(zhì)的載體 TSK gel Octadecy1-4PW TSK gel

43、 Octadecy1-NPR（聚丙烯酸酯（聚丙烯酸酯C18） 反相介質(zhì)反相介質(zhì)性能穩(wěn)定性能穩(wěn)定，分離效率高分離效率高，可分離蛋白質(zhì)、，可分離蛋白質(zhì)、肽、氨基酸、核酸、甾類脂類、脂肪酸、糖類、肽、氨基酸、核酸、甾類脂類、脂肪酸、糖類、植物堿。植物堿。RPC作為作為定量分析手段定量分析手段，廣泛應(yīng)用于，廣泛應(yīng)用于科科學(xué)研究學(xué)研究、臨床診斷臨床診斷、工業(yè)檢測工業(yè)檢測、環(huán)保環(huán)保等各行業(yè)。等各行業(yè)。作為作為產(chǎn)品純化制備產(chǎn)品純化制備手段，由于反相介質(zhì)與其分離手段，由于反相介質(zhì)與其分離的對象比的對象比價格較高價格較高，多限于，多限于實驗室規(guī)模實驗室規(guī)模的應(yīng)用。的應(yīng)用。61羥基磷灰石層析羥基磷灰石層析（hyd

44、roxyapatite, HAP） 羥基磷灰石是一種羥基磷灰石是一種磷酸鈣晶體磷酸鈣晶體，基本分子結(jié)構(gòu)，基本分子結(jié)構(gòu) Ca10(PO4)6(OH)2。HAP的表面存在兩種不同的吸附的表面存在兩種不同的吸附晶面，各存在晶面，各存在吸附點吸附點C點和點和P點點，前者起陰離子交前者起陰離子交換作用換作用，后者起陽離子交換作用后者起陽離子交換作用。當(dāng)在。當(dāng)在中性環(huán)境中性環(huán)境下，下，酸性蛋白質(zhì)主要吸附于酸性蛋白質(zhì)主要吸附于C點點，堿性蛋白主要吸附于堿性蛋白主要吸附于P點點，利用，利用磷酸緩沖液磷酸緩沖液（K2HPO4和和KH2PO4）為流）為流動相動相洗脫展開洗脫展開時，磷酸根離子在時，磷酸根離子在C點

45、競爭性吸附，點競爭性吸附，交換出酸性蛋白；交換出酸性蛋白；K+在在P點競爭吸附，交換出堿性點競爭吸附，交換出堿性蛋白質(zhì)。所以，蛋白質(zhì)。所以，HAP層析通常層析通常以磷酸鹽緩存液為流以磷酸鹽緩存液為流動相，采用提高鹽濃度的線性洗脫法動相，采用提高鹽濃度的線性洗脫法。62 HAP晶體可用于晶體可用于識別識別DNA和和RNA的單鏈和雙鏈的單鏈和雙鏈，分離分離IEC和和HIC難于分離的蛋白質(zhì)物系，難于分離的蛋白質(zhì)物系，分辨率更分辨率更高高。如：人腫瘤壞死因子，用。如：人腫瘤壞死因子，用IEC法、高效法、高效RPC法和電泳法只得到一個洗脫峰，而用法和電泳法只得到一個洗脫峰，而用HAP層析可層析可得到四個

46、洗脫峰。得到四個洗脫峰。 HAP吸附劑吸附劑價格便宜價格便宜，遠(yuǎn)低于離子交換劑，適用，遠(yuǎn)低于離子交換劑，適用于于大規(guī)模的分離純化過程大規(guī)模的分離純化過程，已經(jīng)成為，已經(jīng)成為純化單克隆純化單克隆抗體的主要手段抗體的主要手段。63灌注層析灌注層析(perfusion chromatography) 灌柱層析是美國灌柱層析是美國Perseptive Biosystems公司開發(fā)公司開發(fā)的層析分離技術(shù)。灌柱層析的關(guān)鍵是以的層析分離技術(shù)。灌柱層析的關(guān)鍵是以POROS命命名的名的固定相粒子的特殊結(jié)構(gòu)固定相粒子的特殊結(jié)構(gòu)：基質(zhì)是聚苯乙烯：基質(zhì)是聚苯乙烯-二二乙烯苯，含有乙烯苯，含有兩種大小不同的孔道兩種大小

47、不同的孔道。大孔徑的直徑。大孔徑的直徑為為0.6-0.8m0.6-0.8m，流體以，流體以對流對流形式通過，稱為形式通過，稱為穿透孔穿透孔。小孔徑與一般介質(zhì)一樣，流體擴散的形式通過，稱小孔徑與一般介質(zhì)一樣，流體擴散的形式通過，稱為為擴散孔擴散孔。穿透孔之間以擴散孔相連。穿透孔之間以擴散孔相連。64 灌柱層析的灌柱層析的流速一般較高流速一般較高，500-5000cm/h，在此，在此范圍內(nèi)，范圍內(nèi)，HETP僅是僅是粒徑粒徑的函數(shù)與流速無關(guān)，所以的函數(shù)與流速無關(guān)，所以高流速下操作不影響柱效高流速下操作不影響柱效。超過上述范圍，。超過上述范圍，HETP隨流速的增大而增大隨流速的增大而增大。 灌柱層析最大的特點是灌柱層析最大的特點是分離速度快分離速度快。65超臨界流體層析超臨界流體層析6667親和純化親和純化 生物親和作用生物親和作用：生物分子能夠：生物分子能夠區(qū)分結(jié)構(gòu)區(qū)分結(jié)構(gòu)和和性質(zhì)性質(zhì)非非常相近的其他分子，選擇性的與其中某一種分子常相近的其他分子，選擇性的與其中某一種分子結(jié)合，生物分子的這種特異性相互作用，具有排結(jié)合，生物分子的這種特異性相互作用，具有排他性。他性。 親和純化技術(shù)親和純化技術(shù)：利用生物分子間的特異性結(jié)合作：利用生物分子間的特異性結(jié)合作用的原理進(jìn)行生物物質(zhì)分離純化的技術(shù)。用的原理進(jìn)行生物物質(zhì)分離純化的技術(shù)。 親和作用不只限于生物物質(zhì)之間，親和作用不只限于生物