小鼠LIGHT胞外段基因原核表達(dá)載體構(gòu)建和其多克隆抗體制備

1、小鼠light胞外段基因原核表達(dá)載體構(gòu)建和其多克隆抗體制備【摘 要】目的:pcr擴(kuò)增小鼠light胞外段基因(lightecd),構(gòu)建含lightecd的原核表達(dá)載體，誘導(dǎo)表達(dá) 重組蛋白，并免疫新西蘭兔，制備多克隆抗體。方法：提取 小鼠骨髓來源的未成熟樹突狀細(xì)胞中的總mrna, rt-pcr技 術(shù)擴(kuò)增lightecd,克隆至原核表達(dá)質(zhì)粒pgex-6p-2中，構(gòu)建 重組表達(dá)載體pgex-6p-2-lightecdo重組質(zhì)粒進(jìn)行pcr和基 因測序鑒定后，轉(zhuǎn)化大腸桿菌xl-1 blue, iptg誘導(dǎo)表達(dá)。 融合蛋白純化后純化后免疫新西蘭兔，elisa及western- blot分析兔血清中抗lig

2、htecd抗體的效價和特異性。結(jié)果: rt-pcr擴(kuò)增得到525 bp lightecd目的片段；經(jīng)pcr和測序 鑒定，證明構(gòu)建的重組質(zhì)粒中插入的片段為lightecd基因, 測序結(jié)果經(jīng)blast分析，與genbank上登錄序列完全一致； 經(jīng)iptg誘導(dǎo)，重組質(zhì)粒表達(dá)一相對分子量(mr)約為45kd 的目的蛋白條帶。elisa檢測免疫兔血清效價為1 ： 20 000o 結(jié)論：成功地克隆了小鼠light胞外段基因，并表達(dá)了相應(yīng) 可溶性蛋白，準(zhǔn)備了高效價的兔抗lightecd多克隆抗體， 為進(jìn)一步研究其功能奠定了基礎(chǔ)?！娟P(guān)鍵詞】light；原核表達(dá)；免疫原性；多克隆抗體light (lymphot

3、oxin-like inducible protein that competes with glycoprotein d for herpesvirus entry on t cells)最早是mauri等1在對單純皰疹病毒入侵活化t 細(xì)胞的研究中發(fā)現(xiàn)的，是腫瘤壞死因子超家族的第14個成 員，又名 hvemhl (herpesvirus entry mdeiator-ligand) 或tnfsf14,是一種非cd28依賴的協(xié)同刺激分子。light是 一種ii型跨膜糖蛋白，多以三聚體形式表達(dá)于活化的t細(xì)胞、 未成熟dc、單核細(xì)胞、脾細(xì)胞及粒細(xì)胞膜上，也可以分泌型 形式存在2。目前已經(jīng)證實(shí)tnf

4、sf14可以與3種膜結(jié)合型 的tnf受體家族成員結(jié)合，即tnfrsf14、lt b r (lymphotoxin 3 receptor)和dcr3,啟動不同的生物學(xué) 效應(yīng)?，F(xiàn)有研究已發(fā)現(xiàn)，tnfsf14信號通路通過刺激t細(xì)胞 增殖、分化和誘導(dǎo)靶細(xì)胞凋亡，在抗腫瘤免疫、誘導(dǎo)自身免 疫病和移植排斥反應(yīng)、調(diào)節(jié)神經(jīng)觸突的發(fā)育和脂代謝及抗感 染免疫中發(fā)揮重要功能3-9 olight作為一個多功能多效應(yīng)分子，具有共刺激和細(xì)胞 毒等活性，克隆light基因并獲得其重組蛋白對研究該蛋白 的生物學(xué)功能具有重要作用。而light胞外段基因 (lightecd)是其與相應(yīng)受體結(jié)合，從而發(fā)揮作用的關(guān)鍵部 位，因此本實(shí)

5、驗(yàn)擬克隆lightecd,構(gòu)建原核表達(dá)載體，表達(dá) 可溶性蛋白，并制備多克隆抗體，為進(jìn)一步研究其功能奠定 基礎(chǔ)。1材料與方法1.1實(shí)驗(yàn)動物、質(zhì)粒及主要試劑46w雄性c57bl/6小鼠，購自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動 物有限公司。e. coli xl-1 blue及原核表達(dá)質(zhì)粒pgex-6p-2 均由本研究所保存。rmil-4 ( cat#404- ml)、rmgm-csf (cat#415- ml)購自r&d公司。dna膠回收純化試劑盒、 小量質(zhì)粒提取試劑盒、限制性內(nèi)切酶(bamh i , not i )均 購自takara公司。細(xì)胞總mrna提取試劑盒、rt-pcr試劑盒 購自invitro

6、gen公司1. 2樹突狀細(xì)胞總mrna的提取及cdna的合成收集小鼠骨髓來源的樹突狀細(xì)胞，體外用rmil-4和 rmgm-csf刺激，誘導(dǎo)分化為未成熟樹突狀細(xì)胞。離心收集細(xì) 胞，用細(xì)胞總mrna提取試劑盒按說明書操作提取細(xì)胞總 mrna,紫外分光光度法測定其濃度和純度后保存。按rt-pcr 試劑盒介紹的方法反轉(zhuǎn)錄成cdnao1.3小鼠light胞外段基因的擴(kuò)增根據(jù)pubmed數(shù)據(jù)庫小鼠light基因序列，對照 pgex-6p-2載體上的多克隆酶切位點(diǎn)，設(shè)計(jì)lightecd的特異 性擴(kuò)增引物。上游引物為： 5 -cgggatccatagtagctcatctgccaga-3，下劃線序列為 bamh

7、 i 酶切位點(diǎn)，下游引物為： 5 -ataagaatgcggccgctcagaccatgaaagctccg-3',下劃 線序列為not i酶切位點(diǎn)。以cdna為模板，pcr擴(kuò)增 lightecdo擴(kuò)增條件為：預(yù)變性94°c 3miri后，進(jìn)入變性94°c 30s，退火58°c 30s,延伸72°c 45s的循環(huán)，共計(jì)35次， 末次循環(huán)后補(bǔ)延72°c lomin,終止反應(yīng)。經(jīng)電泳鑒定后，用 dna膠回收純化試劑盒純化pcr產(chǎn)物。1.4小鼠light胞外段基因的克隆及鑒定純化的lightecd pcr擴(kuò)增產(chǎn)物和pgex-6p-2空質(zhì)粒經(jīng) b

8、amh i和not i雙酶切后，用t4 dna ligase連接，轉(zhuǎn)化至 e. coli xl-1 blue感受態(tài)細(xì)胞中，用含氨節(jié)青霉素的lb固 體培養(yǎng)基培養(yǎng)過夜，篩選陽性克隆并用pcr初步鑒定。挑取 pcr初篩陽性的單個菌落，接種于含氨節(jié)青霉素的13液體培 養(yǎng)基中，提取質(zhì)粒送往北京賽諾基因組研究中心測序，序列 正確的重組質(zhì)粒命名為pgex-6p-2-lightecdo1. 5小鼠light蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)和sds-page分析挑取經(jīng)測序鑒定的陽性菌落到lb液體培養(yǎng)基（含有10011 g/ml氨節(jié)青霉素）中，37°c培養(yǎng)1618h。按1 : 100比 例接種于400 ml含100 ug

9、/ml氨節(jié)青霉素的lb培養(yǎng)基中 后,37°c培養(yǎng)至a600 nm達(dá)0.8。加入iptg （終濃度為200 umol/l）, 22°c振蕩培養(yǎng)5 h,同時設(shè)不加iptg組作為對 照。6000 r/min離心收集細(xì)菌，將細(xì)菌沉淀重懸于20 ml含 蛋白酶抑制劑的細(xì)胞裂解液中，超聲。4°c, 15000r/min離 心15 min,收集上清，分裝，保存于-80 °c備用。取1 ml 上清液，加20 pl pbs洗滌過的谷胱昔肽瓊脂糖珠4b,室溫旋轉(zhuǎn)孵育lh,離心收集谷胱昔肽瓊脂糖珠，用0.25%pbst 洗滌2次，再用pbs洗滌1次后，得到純化的融合蛋白。經(jīng)

10、12% sds-page凝膠電泳，coomassie blue染色，鑒定融合 蛋白的表達(dá)情況。用該重組蛋白免疫新西蘭兔制備免疫血清，elisa測定特異性抗體滴度達(dá)1 : 20 000,說明 該蛋白具有較強(qiáng)的免疫原性。western blot結(jié)果顯示該原 核表達(dá)的融合蛋白能與相應(yīng)的抗體特異性結(jié)合。本研究成功構(gòu)建了重組質(zhì)粒pgex-6p-2-lightecd,并得 到相應(yīng)的可溶性蛋白和兔免疫血清，為下一步的功能研究奠 定了基礎(chǔ)。參考文獻(xiàn)：1 mauri dn, ebner r, montgomery ri. light, anew member of the tnf superfamily, an

11、d lymphotoxin alpha are ligands for herpesvirus entry mediatorj. immunity, 1998,(01 )： 21-30.2 steinberg mw, shui jw, ware cf, et al. regulating the mucosal immune system： the contrasting roles of light, hvem, and their various par tn ers j semin immunopathol. 2009； 31 (2)： 207-21.3 chellan b, korol

12、eva ep, sontag tj, et al. light/tnfsr14 can regulate hepatic lipase expression by hepatocytes independent of t cells and kupffer cells.plos one. 2013 ；8( 1 ) ：e54719. doi :10. 1371/journal. pone. 0054719.4 pasero c, barbarat b, just-landi s, et al. a role for hvem, but not lymphotoxin-beta receptor,

13、 in light-induced tumor cell death and chemokine product ionj. eur j immunol. 2009； 39 (9)： 2502-2514.5 edwards jr, sun sg, locklin r, et al. light (tnfsf14) , a novel mediator of bone resorp tion,is elevated in rheumatoid arthritisj a rthritis rheum. 2006；54(5): 1451-1462.6 gavald a n , gutierrez h

14、 , davies am. developmental regulation of sensory neurite growth by the tumor necrosis factor superfamily member light j j neurosci. 2009； 29 (6)： 1599-1607.7 bassols j, moreno-navarrete jm, ortega f, et al. light is associated with hypertriglyceridemia in obese subjects and increased cytokine secretion from cultured human adipocytes j int j obes (lond). 2010； 34 (1)： 146-156.8 lombardi v, singh ak, akbari 0. the role of costimulatory molecules in allergic disease and asthmajint arch allergy immunol. 2009； 151 (3)：179