WesternBlot操作步驟

1、Western Blot 操作步驟一、Western blot 實(shí)驗(yàn)步驟概述 二、 Western blot 具體實(shí)驗(yàn)步驟三、 Western blot 實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng) 四、 Western blot 關(guān)于內(nèi)參抗體一、 Western blot 實(shí)驗(yàn)步驟概述1. 組織取材：組織塊稱重2. 利用液氮、研缽粉碎組織塊3. 加入RIPA緩沖液（每克組織3 ml RIPA） , PMSF（每克組織30卩l(xiāng) 10 mg/ml PMSF），利用Polytron進(jìn)一 步勻漿（15,000轉(zhuǎn)/分*1分鐘）維持4 °C4. 加入PMSF（每克組織30卩l(xiāng) 10 mg/ml PMSF），冰上孵育 30分鐘

2、5. 移入離心管 4C 約 20,000 g（ 約 15,000 轉(zhuǎn)）15 分鐘6. 上清液為細(xì)胞裂解液可分裝-20 C保存7. 進(jìn)行 Bradford 比色法測定蛋白質(zhì)濃度8. 取相同質(zhì)量的細(xì)胞裂解液（體積*蛋白質(zhì)濃度），并加等體積的2 X電泳加樣緩沖液9. 沸水浴中 3 分鐘10. 上樣11. 電泳（濃縮膠20mA，分離膠35mA）12. 電轉(zhuǎn)膜儀轉(zhuǎn)膜 （100mA 40 分鐘）13. 膜用麗春紅染色，膠用考馬斯亮藍(lán)染色14. Westernblot 試劑盒顯色15. 分析比較記錄二、Western 具體實(shí)驗(yàn)步驟Western ，也稱 Western blot 、Western blott

3、ing 、Western 印跡，是用抗體檢測蛋白的重要方法之一。 Western 可以參考如下步驟進(jìn)行操作。1. 收集蛋白樣品 （Protein sample preparation） 可以使用適當(dāng)?shù)牧呀庖毫呀赓N壁細(xì)胞、懸浮細(xì)胞或組織樣品。對于某些特定的亞細(xì)胞組份蛋白，例如細(xì)胞核蛋白、細(xì)胞漿蛋白、線粒體蛋白等，可以參考相關(guān)文獻(xiàn)提取這些亞細(xì)胞組份蛋白，也可以使用試劑盒 進(jìn)行抽提。收集完蛋白樣品后，為確保每個蛋白樣品的上樣量一致，需要測定每個蛋白樣品的蛋白濃度。根據(jù)所使用 的裂解液的不同，需要采用適當(dāng)?shù)牡鞍诐舛葴y定方法。因?yàn)椴煌牡鞍诐舛葴y定方法對于一些去垢劑和還 原劑等的兼容性差別很大。如果使用

4、北京博奧森生物技術(shù)公司生產(chǎn)的WIP 細(xì)胞裂解液，可以使用 BCA 蛋白濃度測定試劑盒。2. 電泳 （Electrophoresis）（1）SDS-PAGE 凝膠配制SDS-PAGE 凝膠可以參考一些文獻(xiàn)資料進(jìn)行配制，也可以使用博奧森生產(chǎn)的SDS-PAGE 凝膠配制試劑盒。該試劑盒提供了除水和配膠器具外的所有試劑以及配制各種濃度SDS-PAGE 的配方。（2）樣品處理在收集的蛋白樣品中加入適量濃縮的SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液。例如2X或5X的SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液。使用 5X 的 SDS-PAGE 蛋白上樣緩沖液可以減小上樣體積，在相同體積的上樣孔內(nèi)可以上樣更多的蛋白樣品。 5X 的

5、 SDS-PAGE 蛋白上樣緩沖液可以參考相關(guān)文獻(xiàn)資料配制，也可以使用博奧森生產(chǎn)的SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液(5X)。100 'C或沸水浴加熱3-5分鐘，以充分變性蛋白。(3) 上樣與電泳冷卻到室溫后，把蛋白樣品直接上樣到 SDS-PAGE 膠加樣孔內(nèi)即可。 為了便于觀察電泳效果和轉(zhuǎn)膜效果，以及判斷蛋白分子量大小，最好使用預(yù)染蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)。電泳時通常推薦在上層膠時使用低電壓恒壓電泳，而在溴酚藍(lán)進(jìn)入下層膠時使用高電壓恒壓電泳。對于 Bio-Rad 的標(biāo)準(zhǔn)電泳裝置或類似電泳裝置，低電壓可以設(shè)置在 80-100V ，高電壓可以設(shè)置在 120V 左右。 SDS-PAGE 可以采用普通的

6、電泳儀就可以滿足要求。為了電泳方便起見，也可以采用整個SDS-PAGE 過程恒壓的方式，通常把電壓設(shè)置在 100V ，然后設(shè)定定時時間為 90120 分鐘。設(shè)置定時可以避免經(jīng)常發(fā) 生的電泳過頭。通常電泳時溴酚藍(lán)到達(dá)膠的底端處附近即可停止電泳， 或者可以根據(jù)預(yù)染蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)的電泳情況， 預(yù)計(jì)目的蛋白已經(jīng)被適當(dāng)分離后即可停止電泳。3. 轉(zhuǎn)膜 (Transfer)我們推薦在 Western 實(shí)驗(yàn)中選用 PVDF 膜。硝酸纖維素膜 (NC 膜)也可以使用，但硝酸纖維素膜比較脆， 在操作過程中特別是用鑷子夾取等過程中容易裂開。膜的使用請參考生產(chǎn)商的推薦使用步驟。通常如果使用 Bio-Rad 的標(biāo)準(zhǔn)濕

7、式轉(zhuǎn)膜裝置，可以設(shè)定轉(zhuǎn)膜電流為 300-400mA ，轉(zhuǎn)膜時間為 30-60 分 鐘。也可以在 15-20mA 轉(zhuǎn)膜過夜。具體的轉(zhuǎn)膜時間要根據(jù)目的蛋白的大小而定，目的蛋白的分子量越大， 需要的轉(zhuǎn)膜時間越長，目的蛋白的分子量越小，需要的轉(zhuǎn)膜時間越短。在轉(zhuǎn)膜過程中，特別是高電流快速轉(zhuǎn)膜時，通常會有非常嚴(yán)重的發(fā)熱現(xiàn)象，最好把轉(zhuǎn)膜槽放置在冰浴中 進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。 轉(zhuǎn)膜的效果可以觀察所使用的預(yù)染蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)， 通常分子量最大的 1-2 條帶較難全部轉(zhuǎn) 到膜上。轉(zhuǎn)膜的效果也可以用麗春紅染色液對膜進(jìn)行染色，以觀察實(shí)際的轉(zhuǎn)膜效果。也可以用考馬斯亮藍(lán) 快速染色液對完成轉(zhuǎn)膜的 SDS-PAGE 膠進(jìn)行染色，以觀察蛋

8、白的殘留情況。4. 封閉 (Blocking)轉(zhuǎn)膜完畢后，立即把蛋白膜放置到預(yù)先準(zhǔn)備好的 Western 洗滌液中，漂洗 1-2 分鐘，以洗去膜上的轉(zhuǎn)膜 液。從轉(zhuǎn)膜完畢后所有的步驟，一定要注意膜的保濕，避免膜的干燥，否則極易產(chǎn)生較高的背景。 用微型臺式真空泵吸盡洗滌液，加入 Western 封閉液，在搖床上緩慢搖動 ,室溫封閉 60 分鐘。對于一些背 景較高的抗體，可以在 4C 封閉過夜。5. 一抗孵育 (Primary antibody incubation)參考一抗的說明書，按照適當(dāng)比例用 Western 一抗稀釋液稀釋一抗。用微型臺式真空泵吸盡封閉液，立即加入稀釋好的一抗，室溫或4 C在

9、側(cè)擺搖床上緩慢搖動孵育一小時。 如果一抗孵育一小時效果不佳，可以在4 C緩慢搖動孵育過夜?；厥找豢埂＜尤隬estern洗滌液，在側(cè)擺搖床上緩慢搖動洗滌 5-10 分鐘。吸盡洗滌液后，再加入洗滌液，洗滌 5-10 分鐘。共洗滌 3 次。如果結(jié)果 背景較高可以適當(dāng)延長洗滌時間并增加洗滌次數(shù)。6. 二抗孵育 (Secondary antibody inucubation) 參考二抗的說明書，按照適當(dāng)比例用 Western 二抗稀釋液稀釋辣根過氧化物酶 (HRP) 標(biāo)記的二抗。 用微型臺式真空泵吸盡洗滌液，立即加入稀釋好的二抗，室溫或4 C在側(cè)擺搖床上緩慢搖動孵育一小時。 回收二抗。加入 Wester

10、n 洗滌液，在側(cè)擺搖床上緩慢搖動洗滌 5-10 分鐘。吸盡洗滌液后，再加入洗滌液，洗滌 5-10 分鐘。共洗滌 3 次。如果結(jié)果背景較高可以適當(dāng)延長洗滌時間并增加洗滌次數(shù)。7. 蛋白檢測 (Detection of proteins)參考相關(guān)說明書，使用 BeyoECL, Western 熒光檢測試劑等 ECL 類試劑來檢測蛋白。 洗片時可以使用 X 光片自動洗片機(jī)。 如果沒有自動洗片機(jī)， 可以用顯影定影試劑盒自行配制顯影液和定影液進(jìn)行手工洗片。8. 膜的重復(fù)利用 (Membrane recovery)如果蛋白樣品非常寶貴，可以使用 Western 一抗二抗去除液處理蛋白膜，以重復(fù)利用蛋白膜三

11、、實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)1. 把聚丙烯酰胺凝膠中的蛋白質(zhì)電泳轉(zhuǎn)移到硝酸纖維膜上。1）轉(zhuǎn)移緩沖液洗滌凝膠和硝酸纖維素膜，將硝酸纖維素膜鋪在凝膠上，用5ml 移液管在凝膠上來回滾動去除所有的氣泡。2）在凝膠 /濾膜外再包一張 3mm 濾紙 （預(yù)先用轉(zhuǎn)移緩沖液浸濕 ），將凝膠夾在中間，保持濕潤和沒有氣泡。3）將此濾紙 /凝膠 /薄膜濾紙按照廠家建議方法放入電泳裝置中，凝膠面向陰極。4）將上述裝置放入緩沖液槽中，并灌滿轉(zhuǎn)移緩沖液以淹沒凝膠。5）按照廠家所示接通電源開始電泳轉(zhuǎn)移。6）轉(zhuǎn)移結(jié)束后，取出薄膜和凝膠，棄去凝膠。2. 將薄膜漂在氨基黑中快速染色，直至分子量標(biāo)準(zhǔn)顯現(xiàn)時取出，記錄下標(biāo)準(zhǔn)位置。3. 用 100m

12、l 水洗滌纖維素膜，必要時可用脫色緩沖液。4. 膜置印跡緩沖液中于 37 C保溫1小時。5. 室溫下，用 PBS-Tween 緩沖液洗滌薄膜。6. 用封口機(jī)將薄膜封入塑料袋中，盡可能不留空氣。7 袋的一角剪一緩沖液的小口，用透析袋夾緊。8混合： NGS（100 微升），印跡緩沖液中的抗體 （2.5-5 毫升），加在裝薄膜的袋中，于室溫下?lián)u動 2 小時（或4C過夜）9用總體積 300ml PBS-Tween 緩沖液，分 4次在一淺盤中洗滌薄膜，每次 75ml。10 將連接生物素的羊抗兔lgG（40微升溶于10毫升印跡緩沖液/100微升NGS）加在袋內(nèi)，于室溫下?lián)u動 1 小時。11 .按步驟9洗滌

13、。12 .加入抗生素蛋白-HRP（40微升溶于10毫升印跡緩沖液/100微升NGS），于室溫下?lián)u動。13. western blot 中轉(zhuǎn)移在膜上的蛋白處于變性狀態(tài)，空間結(jié)構(gòu)改變，因此那些識別空間表位的抗體不能用 于 western blot 檢測。這種情況可以將表達(dá)目的蛋白的細(xì)胞或細(xì)胞裂解液中的所有蛋白先生物素化，再用 酶標(biāo)記親和素進(jìn)行 western blot 。實(shí)驗(yàn)中取膠和膜需帶手套。四、關(guān)于內(nèi)參抗體眾所周知，要用 Western Blot 比較不同條件下或者不同組織中，目的蛋白表達(dá)量的相對多少，前提條件 是等量的蛋白上樣，才有比較的基礎(chǔ)。特別是在表達(dá)量不高時，上樣量的差別就很可能影響結(jié)

14、果的分析。 所以需要內(nèi)參做對比。內(nèi)參即是內(nèi)部參照 （lnternal Control） ，對于哺乳動物細(xì)胞表達(dá)來說一般是指由管家基因編碼表達(dá)的蛋白 （Housekeeping Proteins） ，它們在各組織和細(xì)胞中的表達(dá)相對恒定，在檢測蛋白的表達(dá)水平變化時常用它 來做參照物。在 Western Blotting 實(shí)驗(yàn)中，除了需要進(jìn)行蛋白抽提、蛋白定量、等量蛋白上樣電泳、轉(zhuǎn)膜、 靶蛋白抗體孵育、顯色等步驟以外，還需要進(jìn)行內(nèi)參的檢測，以校正蛋白質(zhì)定量、上樣過程中存在的實(shí)驗(yàn) 誤差，以保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。有我公司自主研發(fā)的 3-Actin肌動蛋白（抗體）特點(diǎn)優(yōu)勢1 .經(jīng)親和層析純化的濃縮液 （或

15、凍干粉 ） ，該抗體質(zhì)量超過國外任何公司的同種產(chǎn)品；2. 用于 Western Blotting 為非常清晰的一條帶稀釋比達(dá)1：400 ；3. 用于免疫組化表達(dá)位置準(zhǔn)確，特異性強(qiáng)、效價高；4. 分子量： 42Kda ，根據(jù)需要可提供各種不同的包裝；5gG 含量為 100 卩 g/0.2ml 500ug/1ml ;6. 價格僅為 0.2ml/480.00 元人民幣；7. 只需4 'C保存運(yùn)輸，有效期：-20 'C液體長達(dá)兩年（凍干粉狀態(tài)長達(dá)5年以上）；8. 產(chǎn)品費(fèi)用低 ，性能穩(wěn)定、質(zhì)量可靠、易于保存；9. 該抗體適用廣泛，可用于人、羊、狗、豬、牛、兔、雞和大、小鼠等動物種屬蛋白檢

16、測；在國外發(fā)表的文章中， Western Blotting 實(shí)驗(yàn)結(jié)果須進(jìn)行內(nèi)參校正已成為一種慣例。但是，國內(nèi)仍有不 少科研人員在 Western Blotting 實(shí)驗(yàn)中忽略了內(nèi)參的使用，將蛋白濃度測定作為規(guī)范需相互比較的各種樣 品間上樣量等同的唯一方法。然而各種蛋白質(zhì)濃度定量方法，都存在局限性，不能完全準(zhǔn)確的確定各種樣 品的準(zhǔn)確蛋白濃度。 蛋白質(zhì)定量以后進(jìn)行電泳時需要等量上樣，此步驟也存在操作誤差。在Westernblotting 實(shí)驗(yàn)時使用內(nèi)參， 即可簡便地對定量和上樣步驟產(chǎn)生的誤差進(jìn)行校正。 此外使用內(nèi)參可以作為空白 對照，檢測蛋白轉(zhuǎn)膜情況是否完全、整個 Western Blot 顯色或者發(fā)光體系是否正常。實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析其實(shí)很簡單：如果樣品蛋白量有限，只夠進(jìn)行一次電泳轉(zhuǎn)膜實(shí)驗(yàn)時，分別檢測樣品的內(nèi)參 量和目的蛋白量。