細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)總結(jié)-重要

1、細(xì)胞培養(yǎng)及檢測(cè)相關(guān)技術(shù)小結(jié)-、 細(xì)胞培養(yǎng)基配制以1000ml培養(yǎng)基為例。1000ml成骨細(xì)胞培養(yǎng)基=850ml a -mem培養(yǎng)液+ 150 ml特級(jí)胎牛血清fbs (15%)(1) . a mem powder:10. 2 g/l& 67 g for 850 ml(2) . nahc03:2.2 g/l 1.87 g for 850 ml(3) . twice distil led water 850 ml, di ssolve the powder in water(4) . fbs (15%, v/v) 150 ml(5) . filter to sterilized bottl

2、e(6) . labe1 the bottle and store in 4°c.notes: 4, 5 should be operated in the sterile working place. and if necessary, we can add some antibiotics into the medium (usually in primary cell culture).二、pbs (10x)nacl: 80g/lkc1: 2g/lna2hp04： 14.4 g/lkh2p0i： 2.4 g/lph二7. 4, with hc1 or naohtoo much

3、po產(chǎn)is harmful to cell, so only very little amount is necessary. get some certain to dilute this 10 times concontration pbs whon we need.三、胰蛋白酶trypsin- edta消化液(10x)this solution is used for cel 1 released from the culture flask。the final concentration of edta is 0.05%;the final concentration of tryps

4、in is 0.53 mrnol/l.take 40 nil solution for example (10x)(1) . trypsin: 40mlx0. 05%x10 =0. 02g(2) . edta: 40mlx0. 53x 10 3x376(molecular weight) x1010 =0.0797g(3) . pbs 40 ml（4）. filter and distribute it into 2 ml sterilized tubes.四、細(xì)胞凍存液細(xì)胞凍存液是dmso （二甲基亞硯）和fbs的混合液，dmso與fbs的體積比為1： 2,混 合均勻后過濾，加0.5ml混合

5、液入滅菌過的凍存管，放進(jìn)-20°c冰箱中備用。五、傳代細(xì)胞買來時(shí)，多為老細(xì)胞，細(xì)胞活性不強(qiáng)，因此，盂要先傳代以恢復(fù)其活性。細(xì)胞剛買 來時(shí)，培養(yǎng)瓶里面一般都裝滿了培養(yǎng)基，在操作時(shí)，需要先將培養(yǎng)基移出至干凈滅菌的管子 備用。1. 取光鏡觀察己長滿細(xì)胞的培養(yǎng)瓶（下面按一瓶計(jì)算加入液體最），進(jìn)行消化：a）吸取19ml pbs （需用小濾膜過濾去除細(xì)菌等）b）棄去舊培養(yǎng)基c）用5ml pbs晃洗培養(yǎng)瓶，棄去pbs,并重復(fù)一次。d）在剩余的9m 1 pbs中加入lml的trypsin+edta消化液（消化液為10倍于正常濃 度）。過濾后加入培養(yǎng)瓶中。如果細(xì)胞貼壁不牢，只需要加一次，2ml；如果細(xì)

6、胞貼 壁牢固，第一次可加入35inl,水平晃動(dòng)兒秒后棄去，再加入2ml消化液，晃動(dòng)并 輕彈培養(yǎng)瓶底，同時(shí)在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，當(dāng)細(xì)胞被完全消化下來吋，加 入10ml細(xì)胞培養(yǎng)液，并將細(xì)胞液移至離心管。2. 離心,1200rev/min, 5niino棄去上清液,晃動(dòng)離心管使細(xì)胞分散,加入培養(yǎng)基10ml, 用兩個(gè)培養(yǎng)瓶分裝細(xì)胞液；3. 標(biāo)記后半旋開瓶蓋放入孵化箱進(jìn)行培養(yǎng)。notes： 1.細(xì)胞不能長吋間處于無液體狀態(tài)，因此在每個(gè)步驟之間，應(yīng)該作好準(zhǔn)備工 作，如在步驟l.c）和ld）z間，應(yīng)該先準(zhǔn)備消化液，再棄去第二次的pbs清洗液。2. 通常情況下，成骨細(xì)胞的貼壁力較強(qiáng)，因此口j以棄去第一次

7、的消化液，再 加入第二次；反之，如遇到貼壁力較弱細(xì)胞，加入一次消化液肉眼可見細(xì)胞明顯脫落， 則只需加入這一次消化液。3. 在顯微鏡下觀察細(xì)胞脫壁情況時(shí)，細(xì)胞呈圓形并聚集成團(tuán)，水平晃動(dòng)培養(yǎng) 瓶時(shí)，細(xì)胞跟隨瓶子晃動(dòng)，在此，要確認(rèn)細(xì)胞完全從瓶壁上消化下來。4. 在分散離心后的細(xì)胞時(shí)，耍確認(rèn)細(xì)胞分散均勻，因?yàn)槌蓤F(tuán)的細(xì)胞不利于細(xì) 胞住長，并且對(duì)ldh等實(shí)驗(yàn)結(jié)果影響較人。六、換液傳代后，細(xì)胞牛長何兩天就需要換一次液，以補(bǔ)充細(xì)胞牛長所需的養(yǎng)分。換液詢，需在 顯微鏡下觀察細(xì)胞的生長狀態(tài)，要特別注意細(xì)胞是否被污染,如果是被污染，應(yīng)棄去污染的 細(xì)胞。換液時(shí)，棄去ii培養(yǎng)基，加入新鮮培養(yǎng)棊，每瓶5ml。day 0d

8、ay 1day 2day 3day 4day 5day 6day 7七、凍存細(xì)胞（緩凍）1. 滅菌細(xì)胞冷凍管，滅菌前，半旋開管蓋，滅菌完畢以后，旋緊；2. 取出已準(zhǔn)備好的細(xì)胞凍存液（見四）；3. 按照傳代的操作（見五）將細(xì)胞脫壁，分散后加入適最培養(yǎng)基，然后計(jì)數(shù)細(xì)胞，凍 存細(xì)胞時(shí)細(xì)胞的最佳密度為le6 cells/ml；4. 1ml細(xì)胞液進(jìn)細(xì)胞凍存管（已有0.5ml細(xì)胞凍存液，混合均勻）；5. 適量界丙醇c3h70h進(jìn)冷凍盒；（丙醇為一種冷凍介質(zhì)，使冷凍速度為1 °c/min）6. 把冷凍悖放進(jìn)冷凍盒，放進(jìn)70°c的冰箱；7. 一周后（一般大于24h即可），取出冷凍盒，把冷凍

9、管放進(jìn)液氮中t70°c凍存。notes: dmso is harmful to cells at room temperature, but can protect cells atvery low temperature.八、細(xì)胞復(fù)蘇（速溶）1. 液氮中取出冷凍管，迅速放入小燒杯中，注意小燒杯中的水應(yīng)該低于冷凍管口避免 污染，待細(xì)胞液融化后，用酒精擦拭管1丨，然后打開管蓋將細(xì)胞液移至已火菌燒杯；之 后緩慢地加入10ml培養(yǎng)基,在omin內(nèi)完成,（緩慢地讓細(xì)胞內(nèi)的dmso釋放出來）。2. 分裝細(xì)胞液，5ml/瓶，第二天換液去掉凍存液中的dmsoo 九、骨髓細(xì)胞原代培養(yǎng)（綜合上述各步驟

10、）:1. 購買約大鼠3只；滅菌實(shí)驗(yàn)用的器具。2. 用乙讎麻醉后，敲碎頭蓋骨，并剪斷頸椎，致死。3. 剪開腿部皮膚及肌肉，取出上肢骨和下肢骨（要從關(guān)節(jié)處剪開，此時(shí)不應(yīng)眾露骨髓 腔），用pbs浸泡。4. 用手術(shù)刀、剪、切斷骨的兩端，可見骨髓腔，并用已過濾（0.22um濾膜）的培養(yǎng) 基,沖洗骨髓腔,收集沖洗液（含骨髓細(xì)胞）。5. looorpm的速度離心沖洗液。6. 棄去離心管中上清液，加入新培養(yǎng)基，并加入抗生素（青霉素和鏈霉素各200u/ml, 此濃度為正常濃度的兩倍，主要是考慮到操作過程有染菌的可能）。7. 分裝至培養(yǎng)瓶中，每瓶5ml含骨髓細(xì)胞培養(yǎng)基，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。8. 培養(yǎng)三天后，更換培養(yǎng)

11、基，依山加入200u/ml的青霉索和鏈霉素，繼續(xù)培養(yǎng)箱培 養(yǎng)。9. 培養(yǎng)兩天后，更換培養(yǎng)基，依舊加入200u/ml的青霉素和鏈霉素，繼續(xù)培養(yǎng)箱培 養(yǎng)。1（）.培養(yǎng)兩天后，更換培養(yǎng)基，依i口加入200u/ml的青霉素和鏈霉素，繼續(xù)培養(yǎng)箱培 養(yǎng)。（原代培養(yǎng)的前一星期需加抗生索抑菌，后面培養(yǎng)中則不盂加抗生索）11. 培養(yǎng)兩天后，更換培養(yǎng)基，不加抗生素，繼續(xù)培養(yǎng)箱培養(yǎng)，隔兩天換液。（一般在 星期一、三、五進(jìn)行換液）12. 約培養(yǎng)兩星期后，可見小鼠骨髓細(xì)胞生長良好，已長滿25cn?培養(yǎng)瓶的底血，此時(shí) 可以凍存部分細(xì)胞，以備f次實(shí)驗(yàn)使用，凍存過程如下：a）用2倍于常用濃度的trypsin+edta進(jìn)行消化

12、。b）消化后，加入適量培養(yǎng)基（至少與消化液等量的培養(yǎng)基，以保護(hù)離心過程中消 化液對(duì)細(xì)胞沒有過大傷害）,1500卬m下離心5min0c）棄上清后，振蕩分散均勻，然后加入培養(yǎng)棊稀釋成4ml的細(xì)胞液，細(xì)胞計(jì)數(shù)。d）冷凍小瓶屮預(yù)先加入0.5ml的凍存保護(hù)液，然后再加入lml的細(xì)胞液（保護(hù)液 為fbs： dmso=2： 1,則培養(yǎng)瓶中液體的配比為一培養(yǎng)基：fbs： dmso = 6： 3： 1）,寫上細(xì)胞名稱，傳代數(shù)，細(xì)胞濃度，操作人，時(shí)間。凍存濃度：lc6 cclls/mle）將冷凍小瓶放入冷凍盒內(nèi)，盒內(nèi)預(yù)先加入正丙醇或界丙醇（使溫度變化緩慢, 保護(hù)細(xì)胞）,置于70°c低溫冰箱中凍存一星期后

13、,轉(zhuǎn)移到液氮內(nèi)凍存即可。13. 凍存細(xì)胞的復(fù)蘇：a）取出凍存小瓶，常溫解凍后，向溶解的細(xì)胞液中加入8ml培養(yǎng)慕，此培養(yǎng)基 慢加，一般在10分鐘左右加完。b）分裝至培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿中。十、mg63細(xì)胞株培養(yǎng)細(xì)胞株可以無限快速增殖，平常只需正常換細(xì)胞培養(yǎng)基（兩天一次），傳代（細(xì)胞長滿 培養(yǎng)瓶底部即可，一般為一周次）。檢測(cè)方法： cytotoxicity檢測(cè)細(xì)胞毒性 ldh< proliferation and viab訂ity of the cell檢測(cè)細(xì)胞增殖和細(xì)胞活力: mtt, alamar blue functional secretion of the cell 細(xì)胞功能代謝：-al

14、p （堿性磷酸酶為細(xì)胞分化早期標(biāo)志物） immunofluorescence stain：細(xì)胞骨架和其它特異蛋白。morphology of the cell on material surface 形貌觀察: sem, phase contrast microscopyldh （般不選此方法）ldh是一種檢測(cè)細(xì)胞損傷程度的方法，所以一般不采用本方法檢測(cè)成骨細(xì)胞在材料表面 的增殖分化，只用于檢測(cè)某材料對(duì)細(xì)胞的毒性有多大。在材料表面種卜細(xì)胞，細(xì)胞會(huì)在材料表面貼壁牛長，如果材料的牛物功能性不好或有細(xì) 胞毒性，就會(huì)損壞細(xì)胞。ldh是乳酸脫氮酶，只存在于細(xì)胞膜內(nèi)，因此細(xì)胞膜損壞后，ldh 會(huì)釋放在上清

15、液中。加入ldh reagent后，溶液顯色，呈淡蘭色，這是一個(gè)酚動(dòng)力學(xué)反應(yīng)過 程。顏色越深表示ldh的最越多，因此細(xì)胞損傷越嚴(yán)重。它是一種檢測(cè)材料和細(xì)胞剛剛接觸 的一個(gè)反應(yīng)，所以應(yīng)在細(xì)胞種上之后馬上作此實(shí)驗(yàn)。對(duì)于藥物而言，這個(gè)實(shí)驗(yàn)并不是必須, 因?yàn)樗幬飳?duì)細(xì)胞不會(huì)馬上有毒性，所以一般對(duì)藥物不做ldillacatate + nad+pyruvate + nadh + h+1、滅菌樣品、銀子及所需實(shí)驗(yàn)器具；2、配制無血清的培養(yǎng)棊（1 ml/wel 1）ml99:9. 5 g/lnahc03:2.2 g/ltwice distilled water過濾備用；3、取光鏡觀察已長滿細(xì)胞的培養(yǎng)瓶（下面按一

16、瓶計(jì)算加入液體量），進(jìn)行消化：a）吸収19ml pbs （需用小濾膜過濾去除細(xì)菌等）b）棄去舊培養(yǎng)基c）用5ml pbs晃洗培養(yǎng)瓶,棄去pbs,并重復(fù)一次。cl）在剩余的9ml pbs中加入lml的trypsin+edta消化液（消化液為10倍于 正常濃度）。e）吸取5ml上面的消化液至培養(yǎng)瓶中，晃洗3-5秒后，棄去。f）再加入2nd消化液進(jìn)行徹底消化（適當(dāng)彈彈培養(yǎng)瓶外壁后，在倒直光鏡下 觀察是否消化完全）。g）接著向培養(yǎng)瓶中加入10ml培養(yǎng)基后，轉(zhuǎn)移至15ml離心管，在1200rpm下 離心5mino4、棄去離心管上清（注意應(yīng)剩余約0. 5ml上清），振蕩，使離心管內(nèi)的細(xì)胞分散均勻;加入過濾

17、后的無血清培養(yǎng)基適量；5、計(jì)數(shù)細(xì)胞，ldh實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞最佳濃度為5e4 colls/ml；6、把實(shí)驗(yàn)樣品放入無菌的24孔培養(yǎng)板,向每孔中加入lml細(xì)胞液;同時(shí),做8孔的 標(biāo)準(zhǔn)曲線（細(xì)胞濃度呈梯度稀禪，細(xì)胞濃度分別是100%、50%、25%、12. 5%、6. 25%、3. 12%. 1.6%、0%）；然后,將培養(yǎng)板放入孵化箱培養(yǎng)兩個(gè)小時(shí);7 配制 ldh reagent；buffer4.92g tris base5.95g nacl500 ml twice di still ed water, ph 7. 2 wi th iic1reagent solution297mnadh lomg/ml

18、inbuffer187mpyruvat lomg/mlin buffer10. 0mlbuffertriton-pbsdissolve triton in pbs, final concentration is 10%.8、兩小時(shí)后將培養(yǎng)板収出，在標(biāo)準(zhǔn)曲線的第一孔中吸出50ul±清液做陰性對(duì)照；之 后在標(biāo)準(zhǔn)曲線的每孔加入20ul 10%triton液（破壞細(xì)胞）；9、取一個(gè)無菌的96孔培養(yǎng)板，根據(jù)樣品的數(shù)量以及標(biāo)準(zhǔn)曲線的數(shù)量（一般要做兩組 標(biāo)準(zhǔn)曲線），每孔加入200ul reagent液，然后分別加入20"標(biāo)準(zhǔn)曲線及樣品上 清液進(jìn)有reagent的96孔板孔屮；10、把96

19、孔培養(yǎng)板放入酶標(biāo)儀讀數(shù)，并分析結(jié)果。ldhldh星（細(xì)胞損傷程度）樣品編號(hào)免疫熒光染色1. 配置溶液：固定液:pbs+formalin （pbs+甲醛）0. 5mlparaforma1dehyde 37%9.5mlpbspbs+fbs （或 pbs+bsa 小牛血清白蛋白 bsa/ pbs二ig/100ml）400mfetalcalfserum20mlpbs5m1caclstocksolution lmol/1 （幫助結(jié)合抗體）2. 染色過程：a）用固定液固定細(xì)胞，最少20分鐘（可維持很長時(shí)間，沒有影響）；b）用pbs清洗多余的固定液，防i匕后續(xù)步驟屮的fbs或bsa與材料交聯(lián)，清洗三次, 每

20、次lomin；c）用 triton x （triton x： pbs=o. 2： 100, v/v）破壞細(xì)胞膜;d）使特異性蛋白與抗體結(jié)合到pbs-fbs, 0° c, 5min；e）用pbs + fbs清洗樣品,三次,每次lomin；f）elisa方法染特異蛋白：i. primary antibody in pbs-fbs at rt （在恒溫水箱里，37 度），lh；ii. 用pbs+fbs清洗樣品，洗三次，每次lomin；（重要，洗掉未與材料相結(jié) 合的一抗iii. sec. antibody 1:50 （體積比）in pbs-fbs（一般每個(gè)樣品可滴 0. 02ml）, lh；

21、note：在材料表而加入一抗和二抗吋，應(yīng)把材料移到培養(yǎng)板另外干燥和潔凈 的格子里；一抗與細(xì)胞表而的肌動(dòng)蛋白結(jié)合，二抗與一抗結(jié)合，j1帶有大量 的熒光染色成分，從而使特異性的肌動(dòng)蛋白顯色。g）加入 phalloidin tritc 0. 1-1mm （stock 100pm in dmso） sigma p1951：染細(xì)胞 骨架h）加入dapi 0. 5g/ml：染細(xì)胞和i）2x1 omin wash in pbs-fbs （最后液體不用吸掉）adhesion time.green: vinculinrod:f-actinblue:nucleusrat bone marrow cells on

22、stainless steel. 8hmtt：mtt是一種無色或淡黃色的物質(zhì)，活細(xì)胞的線粒體及細(xì)胞質(zhì)會(huì)與之作用，使其還原生成一種藍(lán)黑色的晶體。這種晶體只能溶于1性有機(jī)溶劑，故還需要加入mtt lysis buffer,破壞細(xì)胞膜溶解藍(lán)黑色晶體，此溶液的吸光波長x =570nmo1. 取光鏡觀察已長滿細(xì)胞的培養(yǎng)瓶（下而按一瓶計(jì)算加入液體量），進(jìn)行消化：a）吸取19ml pbs （需用小濾膜過濾去除細(xì)菌等）b）棄去【口培養(yǎng)基c）用5ml pbs晃洗培養(yǎng)瓶，棄去pbs,并重復(fù)一次。d）在剩余的9ml pbs中加入lml的trypsin+edta消化液（消化液為10倍于 正常濃度）。e）吸取5ml上面

23、的消化液至培養(yǎng)瓶中，晃洗3-5秒后，棄去。f）再加入2ml消化液進(jìn)行徹底消化（適當(dāng)彈彈培養(yǎng)瓶外壁后，在倒置光鏡下 觀察是否消化完全）。g）接著向培養(yǎng)瓶中加入10ml培養(yǎng)基后，轉(zhuǎn)移至15ml離心管，在1200rpm -k 離心5minoh）棄去離心管上清（注意應(yīng)剩余約0. 5m 1上清），振蕩，使離心管內(nèi)的細(xì)胞分 散均勻（重要！分散不均的細(xì)胞液可造成較人偏差，并且后面的步驟很難 進(jìn)行分散）。2. 96孔培養(yǎng)板中每孔加looul培養(yǎng)液，算出所需的培養(yǎng)液，然后用相應(yīng)體積的培 養(yǎng)基稀釋上而分散好的細(xì)胞液，再按looul/孔的加入量，加至96孔培養(yǎng)板中, 置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24天。3. 觀察細(xì)胞接近長滿培

24、養(yǎng)板底部時(shí)，可以消化-培養(yǎng)瓶細(xì)胞，接種至培養(yǎng)板中， 并進(jìn)行梯度稀釋（用于獲得細(xì)胞濃度一吸光值的標(biāo)準(zhǔn)曲線）；宜于培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 1天后,可進(jìn)行mtt測(cè)試。4. 配制mtt原液：稱6mgmtt溶于12ml培養(yǎng)基中。5. 棄去培養(yǎng)板屮的舊培養(yǎng)液，加入looul/孔的mtt原液，置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 小時(shí)（2小時(shí)，取出觀察反應(yīng)悄況，細(xì)胞內(nèi)線粒體處呈小黑點(diǎn)，細(xì)胞外呈針狀晶 體）。6. 棄去板中mtt液體,并加入150ul/孔lysis solution,溶解細(xì)胞內(nèi)的黑色生成 物。7. 用酶標(biāo)儀測(cè)570nm （參考波長630nm）下的吸光值。alamar blue testcelltit«-blue

25、 reagentores az ur inresorufinemits fluorescerc© at 59cnmadd reagent to c«lls in culturea0.7rewminbresaainnincubato al 3尸 c for 1-4 hoursfluorome(erreccrd fl(x>resc«xealamar blue可以進(jìn)入細(xì)胞膜而不破壞細(xì)胞，經(jīng)細(xì)胞代謝后培養(yǎng)基由蘭色變成粉紅色，通 過檢測(cè)粉紅色培養(yǎng)基的吸光度從而得到細(xì)胞的活性程度。細(xì)胞活性越強(qiáng)，培養(yǎng)基的粉紅色 越明顯。1. 配制無酚紅的培養(yǎng)棊(0. 5ml/wel 1

26、)ml99 (instained ml99): 9.6 g/lnahc03: 2.2 g/ltwice distilled waterfbs: 10% (v:v)alamar blue: 10% (v:v)過濾備用2. 在實(shí)驗(yàn)前先觀察細(xì)胞，若細(xì)胞只長在樣品上，則不需要換板；若細(xì)胞不僅長在樣品上還 貼壁在培養(yǎng)板上，則盂將樣品移至新孔；3. 棄去樣品孔中的ih培養(yǎng)基，用過濾后的pbs液清洗一次，如需換孔，則在新孔中先加入0. 5ml無酚紅的培養(yǎng)棊，然后將樣品依次移到新孔中；如不需換孔，則棄去pbs后直接 加入無酚紅的培養(yǎng)基；4. 同時(shí)，棄去標(biāo)準(zhǔn)illi線小的上清液，用過濾后的pbs液清洗一次，加入

27、無酚紅的培養(yǎng)基0. 5ml/well；a）注：標(biāo)準(zhǔn)曲線應(yīng)提詢一天準(zhǔn)備，按照傳代的操作，在24孔無菌培養(yǎng)板中種下細(xì)胞,濃度分別為 100%、50%、25%、12.5%、6.25%、3.12%、1.6%、0%, 100%孔中的細(xì)胞液濃發(fā)為le5 cells/mk5. 將培養(yǎng)板査于孵化箱培養(yǎng)24小時(shí)（觀察：蘭色的培養(yǎng)基逐漸變成粉紅色，即可）；6. 時(shí)間到后，取出板子，如果標(biāo)準(zhǔn)曲線不同濃度之間的粉紅色差界明顯，則可，収出板子, 吸取200ul/well進(jìn)96孔板，置入酶標(biāo)儀中讀數(shù)即可。三天以后，垂復(fù)上述操作可得多一組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。alamar bluealamar blue2 樣品編號(hào)堿性磷酸酶(alp)4 - npp +h20 alp > np + pi反應(yīng)物:4-nitrophenyl phosphate (4-npp),無色。產(chǎn)物：nitrophenol (np)，黃色,405nm處有最大吸收峰。alp的量與nitrophenol的生成速度成正比。1、配alp緩沖液(5x)：15.14 g tris-base