雙水相萃取實(shí)驗(yàn)

1、1生化物質(zhì)分離純化基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)生化物質(zhì)分離純化基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)兩水相萃取蛋白質(zhì)的相圖兩水相萃取蛋白質(zhì)的相圖及分配系數(shù)及分配系數(shù)2PEG/(NH4)2SO4兩水相系統(tǒng)的相圖兩水相系統(tǒng)的相圖生化物質(zhì)分離純化基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)生化物質(zhì)分離純化基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)一一. . 實(shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)原理 高聚物與無(wú)機(jī)鹽成相的原因：高聚物與無(wú)機(jī)鹽成相的原因： 用相圖表示兩水相形成的條件和定量關(guān)系，用相圖表示兩水相形成的條件和定量關(guān)系， 它是一根雙節(jié)線（它是一根雙節(jié)線（binodalbinodal）。）。無(wú)機(jī)鹽鹽析作用。無(wú)機(jī)鹽鹽析作用。PQ互溶區(qū)互溶區(qū)兩相區(qū)兩相區(qū)3二. 相圖的制作方法(一一) 溶液配制溶液配制 配制配制43.00%（g/ml）的（）

2、的（NH4)2SO4溶液：溶液： 稱硫酸胺稱硫酸胺215.0g少量水少量水溶解溶解稀釋至稀釋至500ml密度計(jì)測(cè)密度計(jì)測(cè)密度密度生化物質(zhì)分離純化基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)生化物質(zhì)分離純化基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)4PEG400% (NH4)2SO4%按表格重復(fù)操作按表格重復(fù)操作PEG400 0.700g H2O 0.5ml (NH4)2SO4混和混和 H2O 0.3ml渾濁渾濁記錄記錄(NH4)2SO4 ml數(shù)數(shù)混均混均（二）相圖的制作（二）相圖的制作澄清澄清生化物質(zhì)分離純化基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)生化物質(zhì)分離純化基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)5表表1. 相圖制作表相圖制作表次次數(shù)數(shù)H H2 2O Og g(NH(NH4 4) )2 2SOSO4 4溶液加量溶液加量

3、 ml ml g g純純(NH(NH4 4) )2 2SOSO4 4累計(jì)量累計(jì)量 g g溶液累溶液累計(jì)總量計(jì)總量 g gPEGPEG%(g/g%(g/g) )(NH(NH4 4) )2 2SOSO4 4%(g/g)%(g/g)12345670.50.50.30.30.30.30.30.30.50.50.50.50.50.5(NH4)2SO4溶液濃度溶液濃度 43.00 % (g/ml) 密度密度 1.20 g 溶液溶液 /ml溶液溶液PEG400 = _ g 溫度溫度 = _生化物質(zhì)分離純化基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)生化物質(zhì)分離純化基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)6兩水相系統(tǒng)中蛋白質(zhì)分配系數(shù)的測(cè)定兩水相系統(tǒng)中蛋白質(zhì)分配系數(shù)的測(cè)定1實(shí)驗(yàn)

4、原理實(shí)驗(yàn)原理 1. 糖化酶為生物大分子蛋白，在雙水相系統(tǒng)中不同程度糖化酶為生物大分子蛋白，在雙水相系統(tǒng)中不同程度地分配，分配系數(shù)地分配，分配系數(shù) K = C上上/ C下下。 相比相比R = V上上/ V下下 2. 考馬斯亮蘭（考馬斯亮蘭（Coomassie Brilliant Blue G-250） 比色比色法測(cè)定兩相中蛋白質(zhì)濃度：考馬斯亮蘭法測(cè)定兩相中蛋白質(zhì)濃度：考馬斯亮蘭G250是一種是一種染料，酸性溶液中呈棕紅色。與蛋白質(zhì)通過(guò)范德華鍵染料，酸性溶液中呈棕紅色。與蛋白質(zhì)通過(guò)范德華鍵結(jié)合成蘭色復(fù)合物，結(jié)合成蘭色復(fù)合物，595nm波長(zhǎng)有最大吸收值。波長(zhǎng)有最大吸收值。 低濃度時(shí)，與蛋白質(zhì)濃度的關(guān)

5、系服從比爾定律。低濃度時(shí)，與蛋白質(zhì)濃度的關(guān)系服從比爾定律。生化物質(zhì)分離純化基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)生化物質(zhì)分離純化基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)72操作方法操作方法（一）蛋白質(zhì)在兩相中的分配：（一）蛋白質(zhì)在兩相中的分配： 10ml10ml刻度刻度離心試管離心試管 加加(NH(NH4 4) )2 2SOSO4 4固體固體1.301.30克克 加加PEG400PEG4002.002.00克克 加入糖化酶加入糖化酶2.00ml2.00ml 加水加水總重總重8.00g8.00g離心離心 30003000轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)/ /分分5min5min 振搖混和振搖混和( (固體溶解固體溶解) ) 求相比求相比 R R =V =V上上/V/V下下求蛋白質(zhì)分配

6、系數(shù)求蛋白質(zhì)分配系數(shù) K = CK = C上上/ C/ C下下生化物質(zhì)分離純化基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)生化物質(zhì)分離純化基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)8生化物質(zhì)分離純化基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)生化物質(zhì)分離純化基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn) 試劑配制試劑配制1. 1. 考馬斯亮蘭考馬斯亮蘭G-250G-250溶液配制：溶液配制： 精確稱取精確稱取50mg50mg考馬斯亮蘭，溶于考馬斯亮蘭，溶于10ml 95%10ml 95%乙醇中，并乙醇中，并加入加入50ml 85% 50ml 85% 濃磷酸，然后，用濃磷酸，然后，用H H2 2O O稀釋定容至稀釋定容至500ml500ml。2. 2. 牛血清蛋白溶液配制：牛血清蛋白溶液配制： 精確稱取精確稱取0.012g0.012g左

7、右的牛血清蛋白，加入左右的牛血清蛋白，加入0.105gNaCl,0.105gNaCl,溶于少量蒸餾水中，然后，稀釋定容至溶于少量蒸餾水中，然后，稀釋定容至100ml100ml，配成，配成 120120 g/mlg/ml的牛血清蛋白原液。的牛血清蛋白原液。 （二）比色測(cè)定上、下相蛋白質(zhì)濃度：（二）比色測(cè)定上、下相蛋白質(zhì)濃度：9生化物質(zhì)分離純化基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)生化物質(zhì)分離純化基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)牛血清蛋白牛血清蛋白mlmlH H2 2O mlO ml0.2 0.4 0.6 0.2 0.4 0.6 0.8 1.00.8 1.00.8 0.6 0.4 0.8 0.6 0.4 0.2 / 0.2 / 上相液上相液1.0ml

8、1.0ml/ /下相液下相液0.1ml0.1ml 0.9ml0.9ml加考馬斯亮蘭加考馬斯亮蘭5.00ml5.00ml，混勻，混勻，252511保溫保溫1010分鐘，冷卻分鐘，冷卻 蛋白質(zhì)總重蛋白質(zhì)總重 g g/ODOD（595nm595nm） 標(biāo)準(zhǔn)曲線制作方法：見(jiàn)下表標(biāo)準(zhǔn)曲線制作方法：見(jiàn)下表 上相液：吸取上相液：吸取0.5ml 0.5ml 蒸餾水定容至蒸餾水定容至50ml 50ml 按按下表操作。下表操作。 下相液：直接按下表操作。下相液：直接按下表操作。 空白液：吸取空白液：吸取1.0ml 1.0ml 蒸餾水蒸餾水 5ml 5ml 考馬斯亮蘭液。考馬斯亮蘭液。 表表1. 標(biāo)準(zhǔn)曲線和樣品的測(cè)

9、定標(biāo)準(zhǔn)曲線和樣品的測(cè)定 牛血清蛋白濃度牛血清蛋白濃度 120 g /ml10mlgKbODC/100上上相標(biāo)準(zhǔn)曲線圖：標(biāo)準(zhǔn)曲線圖：ODgOD = K OD = K g g b b 求斜率求斜率K K和截距和截距b b mlgKbODC/1 . 01下下相生化物質(zhì)分離純化基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)生化物質(zhì)分離純化基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)11生化物質(zhì)分離純化基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)生化物質(zhì)分離純化基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn) 思考和討論思考和討論: :二二. . 選擇正確的離心操作順序選擇正確的離心操作順序: : 1. 1. 將裝有相等體積的兩只離心試管將裝有相等體積的兩只離心試管( (水和樣品液水和樣品液) )對(duì)稱放在對(duì)稱放在離心機(jī)中。離心機(jī)中。 2. 2. 將兩

10、只裝有液體的離心試管放入套管中一起稱重平衡將兩只裝有液體的離心試管放入套管中一起稱重平衡 對(duì)稱放在離心機(jī)中。對(duì)稱放在離心機(jī)中。1 1加完物料后必須將離心試管沿軸向充分振搖，直至固體全加完物料后必須將離心試管沿軸向充分振搖，直至固體全部溶解，原因是什么？部溶解，原因是什么？ 3 3選擇正確的吸出上、下相操作方法：選擇正確的吸出上、下相操作方法： 1. 1. 吸管小心插入下相，吸出下相吸管小心插入下相，吸出下相 換吸管，吸出上換吸管，吸出上相。相。 2. 2. 吸管小心吸出上相吸管小心吸出上相 插入下相，吸出下相。插入下相，吸出下相。 3. 3. 吸管小心吸出上相吸管小心吸出上相 將多余上相和少量下相棄將多余上相和少量下相棄去去 換吸管，吸出下相。換吸管，吸出下相。12生化物質(zhì)分離純化基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)生化物質(zhì)分離純化基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)四四. 可調(diào)式移液器（槍）正確的操作方法（是非題）：可調(diào)式移液器（槍）正確的操作方法（是非題）： 1. 要吸取要吸取0.4ml液體，可用液體，可用1000 5000 l 規(guī)格的槍。規(guī)格的槍。 2. 向順時(shí)針?lè)较蛐瑪?shù)值減??；逆時(shí)針?lè)较蛐?/p>