藥用真菌豬苓菌核滲出液理化性質(zhì)探究

1、藥用真菌豬苓菌核滲出液理化性質(zhì)探究摘要探討不同發(fā)育階段人工培養(yǎng)的豬苓菌核滲 出液的理化性質(zhì)。對(duì)藥用真菌豬苓進(jìn)行培養(yǎng)，系統(tǒng)地觀察不 同發(fā)育階段的豬苓菌核及其滲出液的形態(tài)特征；對(duì)不同發(fā)育 階段豬苓菌核滲出液的ph進(jìn)行測(cè)定；采用硫酸-苯酚法測(cè)定 豬苓菌核滲出液的多糖含量；并利用bca蛋白含量測(cè)定方法 測(cè)定豬苓菌核滲出液的蛋白含量，利用紫外吸收法測(cè)定豬苓 菌核滲出液中過(guò)氧化氫酶（cat）的含量。在豬苓菌核發(fā)育 過(guò)程中，菌核滲出液ph出現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)；滲出液 的多糖含量逐漸下降；滲出液的蛋白含量及cat含量出現(xiàn)逐 漸升高的趨勢(shì)，說(shuō)明豬苓菌核滲出液形成過(guò)程中伴隨著高水 平的氧化應(yīng)激反應(yīng)。添加維生素c

2、以后，部分地消除了活性 氧，因此cat活力下降。豬苓菌核滲出液的ph在豬苓菌核 形成過(guò)程中一直維持酸性狀態(tài)，間接反應(yīng)出酸性環(huán)境有利于 豬苓菌核的形成；菌核滲出液具有逐漸產(chǎn)生且最終被菌核重 新吸收的特征。關(guān)鍵詞豬苓；菌核；滲出液；多糖；cat收稿日期2013-07-07基金項(xiàng)目國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31201666）；國(guó)際 科技合作項(xiàng)目（2011dfa31260）通信作者*郭順星，研究員，博士生導(dǎo)師，研究方向 為藥用植物菌根生物學(xué)，tel: (010) 62829619, e-mail： sxguol986163. com作者簡(jiǎn)介邢詠梅，博士，助理研究員，研究方向?yàn)?藥用真菌學(xué)，tel :( 0

3、10 ) 62819871 , e-mail :meimary163. com 豬苓 polyporus umbellatus (pers. ) fr. 是一種珍貴的藥用真菌。豬苓的藥用部位是菌核，用于治療 水腫、急性腎炎、尿頻尿急、黃疸以及腹瀉等疾病1-4。 然而，隨著豬苓藥用范圍的擴(kuò)大，加上野生豬苓資源的商業(yè) 采挖，導(dǎo)致野生豬苓資源瀕臨枯竭。目前，人工栽培豬苓存 在菌核生長(zhǎng)緩慢，需要以天然豬苓菌核作為種苓等缺點(diǎn)，嚴(yán) 重制約了豬苓的大面積栽培。本實(shí)驗(yàn)室在以往的研究中發(fā) 現(xiàn)，人工培養(yǎng)的豬苓菌核與天然豬苓菌核特征性化學(xué)成分的 指紋圖譜基本一致，具有潛在的應(yīng)用價(jià)值5。然而，許多研究者致力于植物病原

4、菌菌核生理生化特性 的研究，而對(duì)于藥用真菌菌核的研究報(bào)道較少。本研究對(duì)人 工培養(yǎng)的豬苓菌核滲出液的理化性質(zhì)進(jìn)行研究，為豬苓菌核 形成的生理過(guò)程提供重要的理論依據(jù)。1材料本實(shí)驗(yàn)所用豬苓采自山西古縣北平鎮(zhèn)黨家山村，由中國(guó) 醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所郭順星研究員分離鑒定，保存于 麥魏瓊脂培養(yǎng)基。麥芽糖，k2hp04, kh2p04, mgso4 7h20,維生素 b1, 除菌濾器，微孔濾膜（孔徑0.22 um,直徑13 mm）,瓊脂 粉等購(gòu)自北京科百奧生物科技有限公司。novagen bca protein assay kit購(gòu)自默克公司，過(guò)氧化氫酶（cat）測(cè)定 試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所。培

5、養(yǎng)基：麥芽糖 20. 0 g, k2hp04 1. 0 g, kh2po4 0. 5 g, mgs047h20 0. 5 g,瓊脂粉15. 0 g,去離子水1 lo2方法常規(guī)高壓滅菌后冷卻至60 °c左右，0. 05 g - l-1維生 素b1通過(guò)0.22 um微孔濾膜加入到滅菌后的培養(yǎng)基中，充 分混勻后于直徑9 cm的培養(yǎng)皿中倒平板，每個(gè)平皿倒入20 ml 培養(yǎng)基2, 5o維生素c （vit c）添加組在分裝培養(yǎng)基前， 將維生素c通過(guò)0.22 um微孔濾膜加入至培養(yǎng)基中配制成 終濃度為0. 5g l-1的溶液后再倒平皿，每個(gè)平皿倒入20 ml 培養(yǎng)基。2.1觀察豬苓菌核滲出液形成情

6、況隨著培養(yǎng)時(shí)間的延 長(zhǎng)，觀察豬苓菌核的形態(tài)特征及滲出液的產(chǎn)生，并在菌核發(fā) 育的不同階段收集豬苓菌核滲出液，置-80 £備用。2.2豬苓菌核滲出液的ph測(cè)定 取豬苓菌核發(fā)育不同階 段（30, 50, 70, 80 d）的菌核滲出液，以 mettler toledo ph計(jì)測(cè)定其ph。每個(gè)樣本重復(fù)3次，該實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。2.3豬苓菌核滲出液多糖含量的測(cè)定精確稱(chēng)取無(wú)水葡 萄糖（105工干燥至恒重）10 mg置10 ml量瓶，加去離子 水溶解并稀釋至刻度，搖勻。分別精確吸取上述溶液0.1,0. 2, 0. 3, 0. 4, 0. 5, 0. 6, 0. 7, 0.8, 0. 9, 1. oml

7、 于具塞 試管中，加去離子水1 ml,加6%苯酚溶液1 ml,加濃硫酸 5 ml,混勻，置沸水浴中加熱15 min,取出后立即置冰水中 冷卻30 min,在490 nm波長(zhǎng)處分別測(cè)定吸光度。繪制標(biāo)準(zhǔn) 曲線，求出回歸方程。精密量取不同培養(yǎng)時(shí)間的豬苓菌核滲 出液lml,以氯仿、丙酮抽提除色素，以石油瞇除酯。加入 8 ml石油瞇，充分混勻，4 500 r min-1離心10 min后， 棄上清，加5 ml去離子水，混勻，超聲提取30 min, 4 800 r - min-1離心10 min,棄上清，藥渣60 i干燥后轉(zhuǎn)至50 nil 具塞三角瓶，加去離子水20 ml, 80 °c水浴3 h

8、,抽濾，棄 藥渣，上清液定容至25 ml,精密吸取1 ml,置10 ml離心 管，加無(wú)水乙醇4 ml, 4 °c存放過(guò)液。4 800 r min-1離 心10 min,棄上清，沉淀物用80%乙醇洗滌2次，每次2ml, 將沉淀用去離子水溶解，定容至2 ml,精確吸取0.25 ml, 加去離子水175 ml,加6%苯酚溶液1 ml,加濃硫酸5 ml, 混勻，沸水浴15 min,取出置冰水中冷卻30 min,在490 nm 波長(zhǎng)處分別測(cè)定吸光度。2.4豬苓菌核滲出液蛋白含量測(cè)定利用novagen bca protein assay kit測(cè)定豬苓 菌核不同發(fā)育階段菌核滲出液的蛋白含量。bc

9、a蛋白定量方 法是基于雙縮豚反應(yīng)，即在堿性溶液中蛋白將cu2+還原成 cu+,根據(jù)檢測(cè)到的cu+濃度可以計(jì)算體系中的蛋白含量。bicinchoninic acid是一種顯色劑，可以螯合cu+,產(chǎn)生一 種在562 nm有強(qiáng)吸收的紫色復(fù)合物。制備bsa濃度標(biāo)準(zhǔn)曲 線后，測(cè)定豬苓菌核發(fā)育的不同階段菌核滲出液的蛋白含 量。每個(gè)樣本重復(fù)3次，該實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。2. 5豬苓菌核滲出液過(guò)氧化氫酶（cat）含量測(cè)定過(guò)氧 化氫酶（cat）分解h202的反應(yīng)可被鈕酸鐵迅速中止，剩余 的h202與鈕酸鐵作用后產(chǎn)生一種淡黃色的絡(luò)合物，在405 nm 處測(cè)定其生成量，可計(jì)算出cat酶活力。測(cè)定無(wú)維生素c添 加組及維生素c

10、添加組豬苓菌核發(fā)育不同階段菌核滲出液的 cat含量。每個(gè)樣本重復(fù)3次，該實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。按照過(guò)氧化氫酶（cat）測(cè)定試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。對(duì)照 管中加入經(jīng)過(guò)37 £預(yù)溫的試劑一（l.oml）、試劑二（0. 1 ml）, 充分混勻后在37 °c精確反應(yīng)lmin后，加入試劑三（l.oml） 和試劑四（0.1 ml）以及菌核滲出液0. 05 ml,充分混勻， 在405 nm測(cè)定其吸光度。測(cè)試管中先加入菌核滲出液0. 05 ml,再加入經(jīng)過(guò)37 °c預(yù)溫的試劑一（l.oml）、試劑二（0.1 ml）,充分混勻后在37工精確反應(yīng)1 min后，加入試劑三（1. 0 ml）和試劑四（

11、0.1 ml）,充分混勻，在405 nm測(cè)定其吸光 度。每毫克組織蛋白每秒鐘分解1 nmol h202定義為1個(gè) 酶活力單位。組織勻漿中cat活力（umg-1） = （a對(duì)照-a測(cè)定）x271x160x取樣量待測(cè)樣本勻漿蛋白濃度（271為斜率的 倒數(shù)）。3結(jié)果與分析3. 1豬苓菌核培養(yǎng)過(guò)程中菌核滲出液的產(chǎn)生生長(zhǎng)15 d 后，在麥芽糖完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)的豬苓菌絲萌發(fā)形成灰白 色、蓬松的球形菌核，體積較小，菌核表面生長(zhǎng)的菌絲呈絨 毛狀、疏松而柔軟，表面平滑（圖1）。a.培養(yǎng)15 d的豬苓菌核（菌核形成初期）；b.培養(yǎng)30 d的豬苓菌核（菌核生長(zhǎng)期）；c.培養(yǎng)70d的豬苓菌核（菌 核成熟期）；d.培養(yǎng)

12、90 d的豬苓菌核（菌核成熟期）。圖1豬苓菌核發(fā)育過(guò)程中菌核及滲出液的形態(tài)特征fig. 1 morphological characteristics of the sclerotia and the exudate of polyporus umbellatus during sclerotial formation隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，豬苓菌核迅速增殖，體積增大， 當(dāng)生長(zhǎng)至30 d時(shí)，豬苓菌核變成潔白、致密的球形或呈不 規(guī)則狀，菌核表面的菌絲變得致密，上面均勻布滿大小不等 的無(wú)色透明或半透明液滴，此時(shí)豬苓菌核發(fā)育進(jìn)入菌核生長(zhǎng) 期（圖1）。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，豬苓菌核繼續(xù)增殖成球形或不規(guī) 則形

13、。生長(zhǎng)至70 d時(shí)，菌核表面的菌絲變得更加致密，上 面不均勻地布滿大小不等的棕褐色或棕黃色透明或半透明 的液滴，有時(shí)液滴出現(xiàn)逐漸融合現(xiàn)象，此時(shí)豬苓菌核發(fā)育進(jìn) 入成熟期（圖1）。隨著培養(yǎng)時(shí)間進(jìn)一步延長(zhǎng)，當(dāng)培養(yǎng)至90 d時(shí)，豬苓菌 核表面變?yōu)楦又旅?、?jiān)硬的球形或不規(guī)則形，菌核表面有 灰褐色色素沉著，分布不均勻，同時(shí)伴有黑褐色或深褐色點(diǎn) 狀色素樣物質(zhì)沉積在豬苓菌核外表面，棕褐色或棕黃色液滴 消失。灰褐色色素沉著部位的豬苓菌核呈固縮狀，表面凹凸 不平（圖1 ）。3.2豬苓菌核滲出液ph、多糖含量、蛋白含量及cat活 性在豬苓菌核發(fā)育過(guò)程中，菌核滲出液的ph出現(xiàn)先升高后 降低的趨勢(shì)。但菌核滲出液的ph

14、在豬苓菌核形成過(guò)程中一 直維持酸性狀態(tài)，菌核滲出液在培養(yǎng)30 d后，即菌核形成 期產(chǎn)生，此時(shí)菌核滲出液的ph最低；當(dāng)豬苓菌核處于成熟 期時(shí)，其ph達(dá)到最高，隨后又出現(xiàn)下降。豬苓菌核生長(zhǎng)過(guò) 程中，當(dāng)豬苓菌核發(fā)育處于菌核生長(zhǎng)期（培養(yǎng)30 d）時(shí)，其 滲出液多糖含量最高，隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，其多糖含量呈逐漸 下降趨勢(shì)。當(dāng)菌核處于成熟期時(shí)，豬苓菌核滲出液的多糖含 量最低。豬苓菌核培養(yǎng)過(guò)程中，當(dāng)豬苓菌核發(fā)育處于菌核生 長(zhǎng)期（培養(yǎng)30 d）時(shí)，其滲出液蛋白含量及cat含量最低， 隨后出現(xiàn)逐漸升高的趨勢(shì)，培養(yǎng)80 d的菌核滲出液的蛋白 含量及cat活力最強(qiáng)，此時(shí)豬苓菌核發(fā)育處于成熟期階段。 添加外源性維生素c以

15、后，cat活力下降，結(jié)果見(jiàn)表1。表1豬苓菌核滲出液ph、多糖含量、蛋白含量及cat活性(土s, n=3)table 1 the ph, polysaccharides, protein contentand cat activity of polyporus umbellatus sclerotial exudate (+s, n=3)注：catvc表示vit c添加組的cat酶活性。4討論真菌的菌絲體生長(zhǎng)到一定的階段，為適應(yīng)一定的環(huán)境條 件或者抵御不良環(huán)境，菌絲體變?yōu)榫o密交織而成的休眠體， 形成特殊的組織體，稱(chēng)為菌核。真菌菌核的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程依 據(jù)其明顯的宏觀特征被劃分為3個(gè)階段2-3,即菌核

16、形成 初始期、菌核形成生長(zhǎng)期和菌核成熟期。菌核形成初始 期一一高度增殖、相互交織的菌絲形成小的明顯的菌核原基 (sclerotia initiation, si),即菌核形成初期；菌核形 成的生長(zhǎng)期一一在菌核形成初始期的基礎(chǔ)上，菌核原基體積 逐漸增大；菌核形成的成熟期 包括菌核表面分界、內(nèi)部 加固以及色素沉著。在真菌菌核形成階段，菌核的表面出現(xiàn) 大量透明小液滴，隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，液滴會(huì)逐漸增大甚至 融合7。研究發(fā)現(xiàn)，菌核滲出液含有脂肪酸、氨基酸、蛋白質(zhì)、酶，其中包括與黑色素形成相關(guān)的多酚氧化酶，以及 過(guò)氧化氫酶和過(guò)氧化物酶等抗氧化酶8。已有研究 表明，適宜的ph是菌核生長(zhǎng)及形成的必要條件。有學(xué)

17、者研 究發(fā)現(xiàn)9-10,在一般情況下，適于真菌菌絲生長(zhǎng)的最佳ph, 同時(shí)也是促使菌核形成的最佳pho中性及堿性ph對(duì)菌核病 菌sclerotinia sclerotiorum菌核的形成具有抑制作用， 而草酸的累積可以降低環(huán)境ph,使菌核更容易形成11。真 菌的菌核滲出物的ph被證明與其來(lái)源的菌核ph接近，如s. sclerotiorum成熟菌核分泌物的ph為5. 4；而其成熟菌核 的水提物ph為6. 3,同為酸性7。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果間接證明 酸性ph有利于菌核形成12 o本研究結(jié)果表明，在豬苓菌 核發(fā)育過(guò)程中，菌核滲出液的ph在豬苓菌核形成過(guò)程中一 直保持酸性狀態(tài)。可見(jiàn)，酸性ph有利于菌核形成2。隨

18、著 培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，豬苓菌核滲出液多糖含量呈現(xiàn)逐漸下降趨 勢(shì)，推測(cè)可能與豬苓菌核培養(yǎng)過(guò)程中糖類(lèi)物質(zhì)逐漸消耗有 關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，菌核滲出液中富含蛋白質(zhì)，糖，脂肪酸，氨, 抗氧化酶（如過(guò)氧化物酶和過(guò)氧化氫酶等）8。本研究結(jié) 果表明，豬苓菌核形成過(guò)程中，菌核滲出液的蛋白含量及cat 含量呈現(xiàn)逐漸升高趨勢(shì)，這可能與豬苓菌核滲出液隨著培養(yǎng) 時(shí)間的延長(zhǎng)，水分蒸發(fā)、濃縮及重新回歸菌核內(nèi)并被吸收有 關(guān)。培養(yǎng)基中添加維生素c以后，消除了活性氧，使cat活 力下降。這一實(shí)驗(yàn)結(jié)果間接反映出豬苓菌核形成過(guò)程中與高 水平的氧化應(yīng)激相關(guān)。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，豬苓菌核發(fā)育 成熟后，其滲出液明顯減少，這可能與滲出液中水分的蒸發(fā)

19、以及滲出物重新沉淀于菌核中有關(guān)13,從而引起滲出液 ph、蛋白含量及酶活力的變化。豬苓菌核滲出液化學(xué)成分及 其與菌核形成的關(guān)系值得在后續(xù)研究中深入探討。參考文獻(xiàn)1 guo w j, xing y m, chen j, et al. growthpromoting effects of water extract of armillaria mellea rhizomorph on mycelia of polyporus umbellatusj cryptogamie mycol, 2011,32 (2)：171.2 xing y m, chen j, lv y l, et a 1. dert

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26、042400, china)abstract this study was conducted to investi百ate the physicochemical proper ties of polyporus umbel latus sclerotial exudate. morphological characteristics of the sclerotia and its exudate were observed during differe nt st ages of scler otial format io n. the ph of the exudate was detected at different time during cultivation. a phenol-sulfuric acid method was employed to determine the polysaccharide content of