間充質干細胞在伊馬替尼耐藥中的作用研究

1、間充質干細胞在伊馬替尼耐藥中的作用研究摘 要背景：伊馬替尼治療無效的慢性粒細胞白血病已被歸因于靜默白血 病干細胞對伊馬替尼無效。通過保護惡性祖細胞增殖和自我更新的功 能，骨髓間充質干細胞可能導致了白血病的持續(xù)存在和進展。方法：從臨床缺鐵性貧血非口血病患者獲取骨髓，以密度梯度離心法結合 貼壁分離篩選法提取msc；從慢粒慢性期病人取骨髓，在ficoll淋 巴細胞分離液中離心獲得慢粒單個核細胞；用免疫磁珠法分離cd34+ 慢粒祖細胞；以流式細胞術對上述細胞進行特性鑒定。慢粒細胞和人 間充質干細胞共培養(yǎng)或慢粒細胞單獨培養(yǎng)，加入1pm或5mm伊馬替尼, 用碘化丙噪染色錨定蛋白v雙重染色定量(pi-ane

2、xin v)測定伊馬 替尼誘導的細胞死亡率。用western-blot法評價bcl-xl和bax蛋白 在伊馬替尼誘導凋亡中的保護作用。用定量遷移實驗評價msc對原代 慢粒細胞的趨化功能。結果:成功分離出msc及原代慢粒細胞，所獲取msc純度95%； cd34+細 胞純度95%。伊馬替尼誘導原代慢粒細胞凋亡具有劑量依賴性，與 間充質干細胞共培養(yǎng)，保護了慢粒細胞。與間充質干細胞共培養(yǎng)，在 伊馬替尼濃度為1m1時，慢粒細胞死亡率從43.4±4.5降至 26.9±61%,在伊馬替尼濃度為5pm時，慢粒細胞死亡率從 76. 8 + 6. 3降至56. 5 + 5. 0%o weste

3、rn-blot測定表明，間充質干細 胞升高了抗凋亡蛋白bel xl的表達約56倍。msc上清液對原代慢 粒細胞具有化學誘導活性，10.7 ±3.2%的原代慢粒細胞移向未稀釋 的上清液，遷移也是濃度依賴性的。結論：人間充質干細胞保護伊馬替尼誘導的慢粒細胞凋亡?？赡芘c升高了 抗凋亡蛋白bel xl的表達有關。msc上清液對原代慢粒細胞具有濃 度依賴性的化學誘導活性關鍵詞：間充質干細胞；伊馬替尼；耐藥慢性粒細胞白血病(chronic myelocytic 1 eukemia, cml)簡稱慢 粒，是起源于造血干細胞的惡性克隆增殖性疾病，冃前認為其發(fā)病是 9號和22號染色體間相互易位導致，9

4、號染色體的abl原癌基因片段 與22號染色體的bcr片段融合產生bcr / abl基因，編碼酪氨酸激酶 活性成分，干擾細胞信號傳導通路而導致腫瘤發(fā)生。以前的治療多以 輕基腺為主，甲磺酸伊馬替尼(imatinib)問世后成為了慢粒治療的 首選藥物。伊馬替尼能競爭性地抑制酪氨酸激酶與atp結合，阻止酪 氨酸激酶活化，起到了靶向治療的作用，使相當高比例的病人獲得了 持久的緩解，從而改變了慢性粒細胞白血病的治療1。然而，大多 數(shù)的患者最終還是會復發(fā)，其原因為低水平的殘余病變。其中慢粒慢 性期患者大約4%對伊馬替尼存在原發(fā)耐藥，而加速期及急變期耐藥 高達40%和90%左右2 o伊馬替尼對慢粒的治療作用點

5、并非腫瘤干 細胞。在原代lin-cd34+cd38 -慢粒細胞中處于靜止期的bcr/abl 陽性的白血病干細胞是可以被檢測到的3,在伊馬替尼治療后仍然 存活3-6 o綜述骨髓間充質干細胞的特性及臨床應用進展1867年，德國病理學家cohnheimt發(fā)現(xiàn)骨髓內存在非造血功能的干 細胞，1976年，friedenstein和petrakova成功分離、培養(yǎng)出骨髓 間充質干細胞，并證實其具有多向分化潛能lo 1991年caplan將 其定義為骨髓間充質干細胞2。間充質干細胞是中胚層發(fā)育的早期細胞，具有自我復制、自我更新 及多向分化能力，除骨髓外，廣泛分布于各種組織中。但因骨髓間充 質t纟田胞(bon

6、e marrow derived mesenchymal stem cells, bmscs) 最容易獲取,是目前研究的熱點。在特定的條件下，間充質干細胞可 被誘導分化為骨髓基質細胞、成骨細胞、脂肪細胞、成軟骨細胞、平 滑肌細胞、星形膠質細胞、神經細胞、肝細胞、血管內皮細胞和心肌 細胞等3, mscs的這種強大的分化潛能使得它在臨床上越來越受到 關注，目前mscs已成功應用于心血管疾病、神經系統(tǒng)疾病、骨及軟骨 疾病等領域4 o mscs對造血干細胞起空間位置的機械支持作用，同 時還分泌多種生長因子，對iiscs的自我更新及造血分化具有支持作 用，有助于維持hscs的未分化狀態(tài)，并在hscs的粘

7、附和歸巢中起重 要作用。此外，mscs對血液系統(tǒng)疾病的發(fā)生、發(fā)展起重要的作用。1 骨髓間充質干細胞的分離間充質干細胞存在于全身結締組織和器官間質，甚至在胎盤絨毛和 羊水中也有mscs,相對來說以骨髓組織含量最高。骨髓組織中mscs 的含量也很少，約占骨髓單個核細胞的1/1041/105,但其擴增能 力很強，pittenger等對mscs的分離、培養(yǎng)、擴增在1999的文章中 做了詳細報道3。成年人的骨髓間充質干細胞都是從骨盆骼骨中抽取，也可從脛骨、 股骨、脊椎中獲得。目前對骨髓骨髓間充質干細胞的分離、純化主要 有5種方法，包括貼壁分離篩選法、密度梯度離心法、免疫磁珠法, 特制培養(yǎng)板篩選法、流式細

8、胞儀分離法5。1）貼壁分離篩選法也稱 全骨髓貼壁培養(yǎng)法，是根據(jù)mscs貼壁生長而造血干細胞懸浮生長的 特性對兩者進行分離。抽取骨髓后直接加入培養(yǎng)液制成細胞懸液，以 合適的細胞濃度進行培養(yǎng)，早期造血細胞成分多，隨時間造血細胞壞 死，隨換液而不斷清除，培養(yǎng)皿表面包被細胞外基質成分如明膠等可 促進mscs貼壁，并得以純化。但所得細胞成分復雜，mscs的純度 不足。2）密度梯度離心法是根據(jù)骨髓間充質干細胞與其他細胞密度 不同而采用淋巴細胞分離液將骨髓間充質干細胞分離出來，再在培 養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，通過換培養(yǎng)基除去懸浮細胞，得到的細胞純度達95%。操作快速，對細胞的活性影響較小。3）免疫磁珠分離法即利用msc

9、s 的細胞表面抗原與連接有磁珠的特異性單抗相結合，在磁場作用下分 離細胞。4）特制培養(yǎng)板篩選法主要是根據(jù)細胞大小進行分離，r卩利用 一種有3um小孔的塑料培養(yǎng)皿從骨髓中篩選mscs,其均質性98%。5） 流式細胞儀分離法根據(jù)mscs的細胞表面標記,利用相應的熒光素標 記抗體進行篩選。純度高，但細胞活性損失較大。故采用貼壁與密度 梯度離心相結合，操作快速，對細胞的活性影響較小并每次傳代嚴格 掌握消化酶的量和消化時間，保證骨髓間充質干細胞在短暫的作用 時間內與培養(yǎng)瓶底分開，淋巴細胞、單核細胞則因貼壁性強仍貼附與 瓶底，從而使骨髓間充質干細胞得到純化。骨髓間充質干細胞體外培養(yǎng)呈成纖維樣集落形成單位，

10、貼壁生長。 采用全骨髓培養(yǎng)法，剛貼壁的細胞呈圓形、紡錘形或梭形，胞核居中， 有2個以上核。之后細胞增大，克隆形成并有突起，部分細胞呈三角 形或多角形。體外增殖迅速，生長狀態(tài)穩(wěn)定，而且隨著換液次數(shù)和傳 代次數(shù)的不斷增加，細胞純度不斷增加，均質性不斷提高，細胞呈均 勻有序的成纖維細胞樣。2.骨髓間充質干細胞的表而標志間充質干細胞表達很多表面標志，但并不是單一的，兼有間充質、 內皮和肌肉細胞的特征，包括粘附因子、生長因子、細胞因子、受體 和整合素。但還沒有發(fā)現(xiàn)mscs獨特的表面標志。目前mscs表面標記大體可分為以下幾類6-9: 1）粘附分子：整合 素- q v 0 3、整合素- q v0 5、整合

11、素鏈q 1 q 5、整合素b 1 b 5、 icam-l、icam-2、vcam-l、laf-3、alcam-1、l-選擇素、內皮素、cd44；2）細胞因子及生長因子 il-1 a、il-6、il-7、il-8、il-ik il-12、 il14、il15、lif、scf、flt-3 配體、gm-csf、g-csf、m-csf； 3） 細胞因子及生長因子受體：il-1r、il-7r、il-4r、il-6r、lifr、scfr、 g-csfr、ifnr、tnf-i r、tnf-iir、tgf-0 1r、tgf-b2r、bfgfr、 pdfgr、egfr； 4）相對特異性抗原：sh2、sh3、sh

12、4、stro-l、a- 平滑肌肌動蛋口、mab1740； 5）細胞外基質：膠原iiv型、蛋口聚 糖、纖維結合素、透明質酸聚糖。骨髓間充質干細胞與造血干細胞共同存在于骨髓中，不表達典型造 血細胞表面抗原cd34、cd38、cd45、cd14等10,而只表達cd29、 cd44、cd90、cd105、cd166等表面標志。部分研究檢測到成纖維細 胞和內皮細胞的抗原標志，可能與標本來源、細胞傳代次數(shù)及培養(yǎng)調 節(jié)不同有關。組織來源、分離培養(yǎng)方法及種屬的不同，間充質干細胞 的標志物也有所不同。且間充質干細胞所表達的這些抗原，在其他類 型的細胞中也有表達，并沒有特異性，這就使其研究、應用存在很大 障礙。我

13、們在實際培養(yǎng)出的細胞不一定純凈，有報道稱表達cd45和 cdllb的b細胞祖細胞、粒系和單核細胞祖細胞會一直存在于培養(yǎng)過 程中。3 間充質干細胞的鑒定由于mscs表面標志的非特異性，對于mscs的鑒定還沒有較好的辦 法，dominici m于2006年發(fā)表了關于人mscs鑒定的最低標準11, 包括三個方而的內容：1）在標準的培養(yǎng)條件下mscs能貼塑料瓶壁生 長;2) mscs 能表達 cd105、cd73、cd90,不表達 cd45、cd34、cd14 或 cdllb、cd79alpha 或 cd19、及 hla-dr 表面分子；3) mscs 在體外 能向骨細胞、脂肪細胞及軟骨細胞分化。4

14、間充質干細胞的分化潛能12-13骨髓間充質干細胞在一定誘導條件下具有向中胚層細胞分化的能 力，如分化為成骨細胞、成軟骨細胞、成肌細胞、脂肪細胞等，還具 有向外胚層的神經元細胞及內胚層的肝卵圓細胞分化的能力。1)向骨細胞分化用抗壞血酸、b-磷酸甘油、地塞米松孵育混合生長的單層間充質干 細胞2-3周，間充質干細胞形成集落，其堿性磷酸酶表達增高，隨時 間發(fā)生鈣蓄積。2)向脂肪細胞分化與地塞米松、胰島素、口引口朵美辛、異丁基-甲基黃卩票吟孵育，可誘 導間充質干細胞向脂肪細胞分化。細胞內脂肪泡蓄積，最終脂肪泡融 合并填滿細胞，形成脂肪細胞。3）向肌細胞分化5-azacytidine可誘導間充質干細胞向胚

15、胎和成年肌細胞分化。4）向神經樣細胞分化小鼠間充質干細胞來源的成骨細胞和間充質干細胞自身在神經生 長因子和5-氮胞莒的作用小，分化為神經細胞，表達成熟神經元的 特異標志，但這些神經樣細胞缺乏產牛動作電位的電壓門控通道。5）向軟骨細胞分化在三維培養(yǎng)模式下，在無血清營養(yǎng)培養(yǎng)基加入tgf-b成分，間充 質干細胞會向軟骨細胞分化。5 間充質干細胞的免疫性特性mscs表達低水平主要組織相容性復合物ii類分子和fas配體，不表 達與人類口細胞抗原識別有關的共刺激分子b7-1. b7-2及主要組織 相容性復合物i類分子，因而不能識別異體基因抗原，并且因缺乏免 疫激活信號傳導中兩條共刺激通道，而導致免疫耐受，

16、故mscs是一 種免疫缺陷細胞，研究表而異基因mscs移植不存在hla屏障14, 從而為mscs廣泛用于造血干細胞移植提供了分子基礎。骨髓mscs除 具有低免疫原性及可移植性外，還具有免疫調節(jié)特性15-16 o mscs 對t淋巴細胞增殖反應的抑制作用與mscs的數(shù)量有關。研究表明mscs 可通過多種途徑發(fā)揮其對機體免疫細胞牛物活性的調節(jié)作用,mscs 能抑制混合淋巴細胞反應中或植物血凝素刺激引起的t淋巴細胞的 增殖，且這種抑制效應是劑量依賴性大，mscs數(shù)量越大，其抑制作 用越強，但少量的mscs可增強t細胞的增殖能力，其表面抗原與 hla-dr抗原協(xié)同增強。agganwal等將人mscs和

17、無關供者來源的骨髓 單個核細胞共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)調節(jié)性t細胞比例增高，而treg細胞具有 潛在的免疫調節(jié)作用,可阻止gvhd的發(fā)生，故mscs可通過提高treg 細胞而誘導免疫耐受。6.骨髓間充質干細胞在血液病中的應用1）骨髓mscs在血液病的發(fā)生、發(fā)展中的作用mscs能分化成骨髓微環(huán)境中的各種細胞成分并分泌多種細胞因子, 與造血細胞之間相互作用，對血液疾病的發(fā)展起了重要的作用。近年 的研究發(fā)現(xiàn)，mscs在口血病細胞惡性克隆的增殖、分化利凋亡中發(fā) 揮重要作用，骨髓基質細胞能抑制化療藥物所致的白血病細胞凋亡 17,對白血病細胞起保護作用，可能是因為mscs使白血病細胞阻 滯于g0/g1期，抑制了白血病

18、細胞的自然增殖，從而使白血病細胞得到保護，與化療藥物耐藥有一定關系。傳統(tǒng)認為，慢性粒細胞性白血病是起源于造血干細胞的惡性克隆性 疾病，但有研究者18從cml源骨髓中分離出flk-1+mscs,其能在 單細胞水平分化為cml細胞，將其移植入小鼠體內后，小鼠體內可檢 測到bcr/abl基因，說明該群細胞可能作為cml腫瘤干細胞參與了疾 病的發(fā)生。再生障礙性貧血的發(fā)病也可能與mscs的異常相關19-20 o aa-mscs 與正常mscs在形態(tài)學和免疫表型上一致，但前者的生物學特性有所 不同。研究發(fā)現(xiàn)有以下特點：®aa-mscs體外增殖能力減弱；其抑 制mlr和植物血凝素誘導t細胞增殖的能力明顯降低；抑制t細胞 活化過程中ifn-丫的分泌能力也明顯減低；mscs下調t細胞對克 隆形成細胞的抑制效應的作用消失。從而造成患者體內細胞毒性t細 胞過度增殖，破壞再行干細胞，減少造血干細胞池，最終導致再障的 發(fā)生。2）骨髓mscs在造血干細胞移植中的應用研究表明，在放化療及移植前的預處理中，骨髓微環(huán)境受到破壞， mscs受損，減弱了其對造血的支持及調控作用21-22 o骨髓mscs 與hscs共移植可促進造血重建，并降低gvhd的發(fā)生率及程度，保留gvl效應