表面等離子共振-(SPR)-技術(shù)與Biacore原理PPT

1、CompanyLOGO表面等離子共振表面等離子共振 (SPR) 技術(shù)與技術(shù)與Biacore原理原理 戴璐戴璐22021/8/25表面等離子共振表面等離子共振 (SPR)原理原理 v 表面等離子共振(Surface Plasmon Resonance, SPR) v 消逝波：當(dāng)光從光密介質(zhì)射入光疏介質(zhì)，入射角增大到某一角度，使折射角達(dá)到90時(shí)，折射光將完全消失，而只剩下反射光，這種現(xiàn)象叫做全反射。v 當(dāng)以波動(dòng)光學(xué)的角度 來研究全反射時(shí)，人們發(fā)現(xiàn)當(dāng)入射光到達(dá)界面時(shí)并不是直接產(chǎn)生反射光，而是先透過光疏介質(zhì)約一個(gè)波長(zhǎng)的深度，再沿界面流動(dòng)約半個(gè)波長(zhǎng)再返回光密介質(zhì)。則透過光疏介質(zhì)的波被稱為消逝波。 320

2、21/8/25表面等離子共振表面等離子共振 (SPR)原理原理 v 等離子波：把金屬表面的價(jià)電子看成是均勻正電荷背景下運(yùn)動(dòng)的電子氣體，其中正、負(fù)帶電粒子數(shù)目幾乎相等，這實(shí)際上也是一種等離子體。當(dāng)金屬受電磁干擾時(shí)，金屬內(nèi)部的電子密度分布會(huì)變得不均勻。因?yàn)閹?kù)侖力的存在，會(huì)將部分電子吸引到正電荷過剩的區(qū)域，被吸引的電子由于獲得動(dòng)量，故不會(huì)在引力與斥力的平衡位置停下而向前運(yùn)動(dòng)一段距離，之后電子間存在的斥力會(huì)迫使已經(jīng)聚集起來的電子再次離開該區(qū)域。由此會(huì)形成一種整個(gè)電子系統(tǒng)的集體震蕩，而庫(kù)侖力的存在使得這種集體震蕩反復(fù)進(jìn)行，進(jìn)而形成的震蕩稱等離子震蕩，并以波的形式表現(xiàn)，稱為等離子波。42021/8/25表

3、面等離子共振表面等離子共振 (SPR)原理原理 v SPR光學(xué)原理：光在棱鏡與金屬膜表面上發(fā)生全反射現(xiàn)象時(shí)，會(huì)形成消逝波進(jìn)入到光疏介質(zhì)中，而在介質(zhì) 中又存在一定的等離子波。當(dāng)兩波相遇時(shí)可能會(huì)發(fā)生共振。當(dāng)消逝波與表面等離子波發(fā)生共振時(shí)，檢測(cè)到的反射光強(qiáng)會(huì)大幅度地減弱。能量從光子轉(zhuǎn)移到表面等離子，入射光的大部分能量被表面等離子波吸收，使反射光的能量急劇減少。v 可以從反射光強(qiáng)響應(yīng)曲線看到一個(gè)最小的尖峰，此時(shí)對(duì)應(yīng)的入射光波長(zhǎng)為共振波長(zhǎng)，使反射光完全消失的入射角就是SPR角。SPR角隨金膜表面折射率變化而變化，而折射率的變化又與金膜表面結(jié)合的分子質(zhì)量成正比。因此可以通過對(duì)生物反應(yīng)過程中SPR角的動(dòng)態(tài)變

4、化獲取分子之間相互作用的特異信號(hào)。52021/8/25SPR生物傳感器生物傳感器v SPR生物傳感器的光源為偏振光(polarized light),傳感芯片(sensor chip)表面鍍有一層金膜,實(shí)驗(yàn)時(shí),先將一種生物分子(ligand)固定在金膜表面,然后將與之相互作用的分子(analyte)溶于溶液(或混合液)流過芯片表面。SPR檢測(cè)器能跟蹤溶液中的分子與芯片表面的分子結(jié)合、解離整個(gè)過程的變化,不同角度的反射光的光強(qiáng)被記錄后得到角度-光強(qiáng)曲線圖,每條曲線的波谷即為該曲線的共振角,共振角對(duì)應(yīng)的角度為共振信號(hào)(resonance signal),時(shí)間與對(duì)應(yīng)共振信號(hào)的曲線即為SPR傳感圖(s

5、ensorgram)。62021/8/25SPR生物傳感器生物傳感器v以免疫學(xué)分析為例,在金膜表面固定某種受體(如抗體),然后流過含相應(yīng)配體(如抗原)的樣品,配體與受體的結(jié)合將使金膜與溶液界面的折射率上升,從而導(dǎo)致共振角發(fā)生變化。為了表述的方便,共振角(或共振信號(hào))可以用共振單位(resonance units,RU)來表示。對(duì)大多數(shù)生物分子而言,1000RU大約等于1mm2的面積上有1ng的質(zhì)量變化，相當(dāng)于溶液中蛋白濃度為6mg/ml。SPR生物傳感器通過檢測(cè)獲得共振角的改變程度,便可以對(duì)配體濃度進(jìn)行定量。72021/8/25SPR 生物傳感技術(shù)的應(yīng)用領(lǐng)域生物傳感技術(shù)的應(yīng)用領(lǐng)域v生物大分子的

6、相互作用：v腫瘤研究v免疫學(xué)和傳染病v神經(jīng)科學(xué)v生物制藥v蛋白質(zhì)組學(xué)82021/8/25Biacore可研究的生物分子范圍可研究的生物分子范圍v蛋白質(zhì) vDNA/RNA v脂類 /脂質(zhì)體/ 生物膜 v多糖 v多肽 v小分子 v全細(xì)胞/病毒/微生物 92021/8/25可分析的對(duì)象可分析的對(duì)象102021/8/25Biacore核心組件核心組件 112021/8/25Biacore提供的生物分子相互作用信息：提供的生物分子相互作用信息：v有無結(jié)合 (Yes or No) v結(jié)合的特異性和選擇性 (Specificity) v兩種分子的結(jié)合強(qiáng)度 -親和力 (Affinity) v結(jié)合和解離的快慢和

7、復(fù)合體的穩(wěn)定性 -動(dòng)力學(xué) (Kinetics) v功能復(fù)合體形成的參與者、協(xié)同者和組裝順序 (Mechanism) v分子結(jié)合的溫度與熱力學(xué)特征 (Thermodynamics) v目標(biāo)分子活性含量的檢測(cè) (Concentration) 122021/8/25SPR光學(xué)組件光學(xué)組件132021/8/25微流控系統(tǒng)微流控系統(tǒng)(IFC) v集成化、自動(dòng)化的微流路控制系統(tǒng) v樣品消耗量低 v為互相作用分析而設(shè)計(jì)優(yōu)化 142021/8/25微流控系統(tǒng)微流控系統(tǒng) (IFC)流動(dòng)池流動(dòng)池 vIFC上有4個(gè)流動(dòng)池v可選擇單獨(dú)、配對(duì)、串聯(lián)使用。 v流動(dòng)池為配對(duì)使用進(jìn)行了優(yōu)化(Fc1-Fc2, Fc3-Fc4)

8、 152021/8/25傳感芯片傳感芯片162021/8/25傳感芯片傳感芯片172021/8/25葡聚糖表面葡聚糖表面v親水性v溫和型: 和2%濃度的葡聚糖水溶液環(huán)境相似v非特異性結(jié)合量低v高結(jié)合容量v易于進(jìn)行共價(jià)結(jié)合v出色的化學(xué)穩(wěn)定性182021/8/25傳感芯片的選擇傳感芯片的選擇 v 11種不同的芯片種類v CM5, CM4, CM3：芯片 蛋白、肽段、小分子等 v CM7：小分子化合物研究v SA芯片：生物素標(biāo)記的分子，如核酸、糖類等 v Biotin CAP芯片：可逆性生物素捕獲芯片 v NTA芯片：His重組蛋白v L1 芯片：模擬脂質(zhì)雙分子層環(huán)境v HPA芯片：實(shí)現(xiàn)膜系統(tǒng)相關(guān)的

9、互作分析v C1芯片：研究細(xì)胞、病毒等大顆粒分子v Au裸金芯片：客戶定制表面（材料、高分子等） v 30余種不同的試劑盒及緩沖液產(chǎn)品 ：v 氨基偶聯(lián)試劑盒、巰基偶聯(lián)試劑盒； GST捕獲試劑盒 GST重組蛋白分析； NTA捕獲試劑盒 His 重組蛋白分析； 192021/8/25最常用的傳感芯片：最常用的傳感芯片：CM5傳感芯片傳感芯片 202021/8/25Biacore實(shí)驗(yàn)的基本流程實(shí)驗(yàn)的基本流程 212021/8/25分析物和配體的定義分析物和配體的定義 固定配體固定配體 (Immobilization)： 222021/8/25樣品進(jìn)樣樣品進(jìn)樣 (Injection)v分析物 (Analyte)進(jìn)樣后，以恒定的流速和濃度流過芯片表面 v樣品中的待分析物與固定在芯片表面上的配體發(fā)生結(jié)合，芯片表面物質(zhì)的質(zhì)量發(fā)生改 變 ， 儀 器 記 錄 下 對(duì) 應(yīng) 的 響 應(yīng) 值 (response) 的改變 v進(jìn)樣結(jié)束后，切換緩沖液流過芯片表面，分析物由配體上自發(fā)解離，解離的進(jìn)程由響應(yīng)值實(shí)時(shí)監(jiān)控。 232021/8/25芯片再生芯片再生 (Regeneration)v將自發(fā)解離后仍然結(jié)合于配體的分析物徹底洗掉。 v配體的結(jié)合活性必須保留 。