串聯(lián)重復(fù)核定位信號(hào)的綠色熒光蛋白融合載體的構(gòu)建與原核表達(dá)

1、串聯(lián)重復(fù)核定位信號(hào)的綠色熒光蛋白融合 載體的構(gòu)建與原核表達(dá)【關(guān)鍵詞】核定位信號(hào)載體蛋白質(zhì)類基因表達(dá)蛋白純化abstract objective: to construct the expression vector of his egfp 3xnls fusion protein and obtain its expression and purification in e. coli. methods： 3xnls and egfp sequence plified by pcr from pegfp cl 3xnls vector and cloned into pet 14b vecto

2、r folloe digestion, pcr and sequencing, the positive clones ed into bl21 (de3) petent cells, and the expression of his egfp 3xnls fusion protein atography. results: the constructed his egfp 3xnls fusion protein vector highly expressed in e. coli. iniprep kit 和 ni nta親和樹脂是qiagen公司產(chǎn)品，限制性內(nèi)切酶(nde i、 bam

3、h i)、t4 dna連接酶和pyrobest高保真dna聚合酶購自 takara 公司，100 bp 和 1 kb dna ladder 分別是 toyobo 公司和 stratagene公司產(chǎn)品，異丙基b硫代半乳糖(isopropyl0 dthiogalactoside, iptg)購自 sigma aldrich 公司，引物由英駿公 司合成。1.3 his egfp3xnls融合載體的構(gòu)建見圖1。從pegfp cl 3xnls載體中擴(kuò)增egfp和3xnls 所用的上游引物序列為 5 tacatatgatggtgagcaagggcgaggagct 3', 其中下劃線部分是egfp基

4、因編碼序列的第123位堿基；下游引 物序歹ll 為 5'taggatccttacgggcccgcggtaccgtcgactgca 3', 其中下劃線部分是添加的終止密碼子及pegfpcl載體上bamh i位點(diǎn)前的25位堿基的反向互補(bǔ)序列。用pyrobest高保真聚合酶進(jìn)行pcr 反應(yīng)(95 °c 30 s, 55 °c 30 s,72 °c 60 s,共 30 個(gè)循環(huán)),擴(kuò)增片 段大小為848 bpo將pcr產(chǎn)物用nde i和bamh i酶切，隨后與 nde i和bamh i雙酶切并電泳切膠回收的pet 14b連接，將連接 反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)化大腸桿菌株

5、dh5 q。挑取單菌落接種于amp+的lb 培養(yǎng)基中，37 °c振搖過夜。取5 ml菌液用qiaprep spin miniprep kit小量提取質(zhì)粒后，用nde i和bamh i酶切鑒定。另外使用上述 引物對(duì)重組體進(jìn)行pcr鑒定。酶切及pcr鑒定產(chǎn)物用1.2 %瓊脂糖 凝膠電泳，并在凝膠圖像分析儀上成像。重組體最終經(jīng)測(cè)序鑒定無 誤后，置20 °c保存?zhèn)溆谩?.4 his egfp3xnls融合蛋白的原核表達(dá)及純化將陽性重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌株bl21(de3)o挑取單菌落，置 于2 ml lb(amp+)培養(yǎng)基中，37 °c振搖培養(yǎng)至d600約為0.6時(shí)， 加入

6、終濃度為0.1 mmol/l的iptg誘導(dǎo)，繼續(xù)振搖3 h。利用12 % sds page來鑒定表達(dá)融合蛋白的菌落。對(duì)有his egfp 3xnls融合蛋白表達(dá)的菌落進(jìn)行大量(100 ml)菌液擴(kuò)增誘導(dǎo)，6 oooxg、4 °c離心10 min；將細(xì)菌沉淀重懸于4 ml結(jié)合緩沖液(300 mmol/l nacl, 50 mmol/l nah2po4, 10 mmol/l 咪呼，0 triton x 100, ph8.0)中，超聲破碎，15 000xg, 4 °c離心 15 mine將上清加入100 ul ni nta親和樹脂中4 °c孵育1 h,然 后用 1 ml

7、 的洗滌緩沖液(300 mmol/l nacl, 50 mmol/l nah2po4, 20 mmol/l咪墜ph8.0)洗ni nta親和樹脂3次；最后用洗脫緩沖 液(300 mmol/l nacl, 50 mmol/l nah2po4, 250 mmol/l 咪哇, ph8.0)洗脫蛋白后，12% sds page鑒定結(jié)果。2.2 his egfp 3xnls融合蛋白在大腸桿菌中的誘導(dǎo)表達(dá)和 純化經(jīng)tptg誘導(dǎo)后，細(xì)菌裂解液在約36 kd處形成一條濃密的蛋 白條帶，與預(yù)期的his egfp 3xnls融合蛋白大小一致。利用 ni nta親和層析法對(duì)細(xì)菌裂解液進(jìn)行純化后，在約36 kd處得

8、到一條唯一的蛋白條帶(圖3)。3討論許多信號(hào)通路激活的最終結(jié)果都可引起細(xì)胞的基因表達(dá)發(fā)生改 變，這通常需要在信號(hào)通路被激活時(shí)，該級(jí)聯(lián)中的某種蛋白從細(xì)胞 質(zhì)移位到細(xì)胞核中，通過作用于其下游底物引起特界性的基因轉(zhuǎn) 錄。真核細(xì)胞可以通過多種機(jī)制迅速誘導(dǎo)蛋口質(zhì)從胞質(zhì)移位入核5 o影響蛋白質(zhì)在胞質(zhì)和胞核中分布主要包括兩個(gè)因素，即與核轉(zhuǎn) 運(yùn)機(jī)器或錨定蛋白的相互作用6, 7o對(duì)于某種信號(hào)蛋白而言，如 果其分布于胞質(zhì)中，且核輸入速率低于核輸岀速率，那么當(dāng)其與輸 入受體輸入素的結(jié)合增加，與輸出受體輸出素的結(jié)合降低，或兩 者同時(shí)存在時(shí)將迅速移位入核8。蛋口進(jìn)出細(xì)胞核都必須通過npc,小于50 kd的分子能通過核

9、孔自由擴(kuò)散進(jìn)出核，而大一些的分子則需要一個(gè)nls4o nls -般 具有如下特征：(1)長(zhǎng)度一般小于20個(gè)氨基酸；(2)在蛋白入核 內(nèi)后不被移除；(3)通常富含帶正電的(堿性)氨基酸。除此之 外，nls之間不存在一致的序列9。核輸入過程可分為三個(gè)步驟。 首先，位于胞質(zhì)中的貨物(需要移位入核的蛋白質(zhì)，具有nls或與 具有nls的蛋白質(zhì)結(jié)合)與輸入素結(jié)合，形成的貨物輸入素復(fù)合 體，隨后被靶向到npc ±o移位過程需要小分子量gtp酶ran、 gtp的參與和生理溫度，目前該過程的具體機(jī)制尚未闡明。入核 后，貨物輸入素復(fù)合體在ran gtp與輸入素結(jié)合后解離。貨物 在核中被卸下，而輸入素返回

10、到胞質(zhì)中進(jìn)行下一輪的轉(zhuǎn)運(yùn)。因而， nls對(duì)于蛋白質(zhì)移位入核具有重要作用4。研究表明，p38調(diào)節(jié)/激 活蛋白激酶/mapk激活蛋白激酶5移位入核依賴于其c末端的 nls10oseternes等利用三個(gè)串聯(lián)重復(fù)nls序列與egfp融合的真核表 達(dá)載體證實(shí)了 p38通過與其下游底物mk5的結(jié)合和對(duì)其的激活來參 與其核胞質(zhì)分布的調(diào)控ho為了研究nls在介導(dǎo)蛋白質(zhì)入核中的 確切機(jī)制(例如通過某些抑制劑的使用)，實(shí)驗(yàn)中選取一個(gè)典型的 單個(gè)nls核心序列(rkrkll)構(gòu)建了 egfp融合的原核表達(dá)載 體，然而該載體表達(dá)的his egfp nls融合蛋白加入細(xì)胞后并 不能入核，說明融合蛋白內(nèi)的單個(gè)nls可能

11、在空間上被掩蓋。結(jié)合 seternes等的結(jié)果，使用三個(gè)申聯(lián)重復(fù)的nls來構(gòu)建與egfp融合 的原核表達(dá)載體，該載體經(jīng)鑒定正確后，在大腸桿菌中進(jìn)行了表 達(dá)，獲得了純化的his egfp 3xnls融合蛋白，這為進(jìn)一步研 究nls在介導(dǎo)蛋白質(zhì)入核中的作用機(jī)制奠定了基礎(chǔ)?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】l teruel mn, meyer t. translocation and reversible localization of signaling proteins: a dynamic future for signal transduction j. cell, 2000(2):181-184.2 cyer

12、ms. regulation of nuclear localization during signaling j. j biol chem, 2001(24):20805-20808.3 張琳，姜勇，張璐p38蛋白激酶不同亞型在raapk的細(xì)胞 內(nèi)定位與激活后移位機(jī)制j生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展，2003:509 513.5 seternes om, johansen b, hegge b, et al. both binding and activation of p38 mitogen activated protein kinase (mapk) play essential roles

13、in regulation of the nucleocytoplasmic distribution of mapk activated protein kinase 5 by cellular stress j. mol cell biol, 2002(20):6931-6945.6 rout mp, aitchison jd. the nuclear pore plex as a transport machine j. j biol chem, 2001(20):16593-16596.7 neann i, usiani d, jans da, et al. an importin a

14、lpha/beta recognized bipartite nuclear localization signal mediates targeting of the human herpes simplex virus type 1 dna polymerase catalytic subunit pul30 to the nucleus j. biochemistry, 2007(32):9155-9163.10fries t, betz c, sohn k, et al. a novel conserved nuclear localization signal is recognized by a group of y