紫花牡荊素對(duì)人肺腺癌A549細(xì)胞增殖和凋亡的影響.doc

1、南華大學(xué)學(xué)位論文原創(chuàng)性聲明本人聲明，所呈交的學(xué)位論文是本人在導(dǎo)師指導(dǎo)下進(jìn)行的研究工作及取得的研究成果。盡我所知，除了論文中特別加以標(biāo)注和致謝的地方外， 論文中不包含其他人已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的研究成果， 也不包含為獲得南華大學(xué)或其他單位的學(xué)位或證書而使用過的材料。與我共同工作的同志對(duì)本研究所作的貢獻(xiàn)均已在論文中作了明確的說明。 本人完全意識(shí)到本聲明的法律結(jié)果由本人承擔(dān)。作者簽名：年月日南華大學(xué)學(xué)位論文版權(quán)使用授權(quán)書本學(xué)位論文是本人在南華大學(xué)攻讀（博 / 碩）士學(xué)位期間在導(dǎo)師指導(dǎo)下完成的學(xué)位論文。本論文的研究成果歸南華大學(xué)所有， 本論文的研究?jī)?nèi)容不得以其它單位的名義發(fā)表。本人同意南華大學(xué)有關(guān)保留、使

2、用學(xué)位論文的規(guī)定，即：學(xué)校有權(quán)保留學(xué)位論文，允許學(xué)位論文被查閱和借閱； 學(xué)?？梢怨紝W(xué)位論文的全部或部分內(nèi)容， 可以采用復(fù)印、縮印或其它手段保留學(xué)位論文； 學(xué)?？筛鶕?jù)國家或湖南省有關(guān)部門規(guī)定送交學(xué)位論文。同意學(xué)校將論文加入中國優(yōu)秀博碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 ，并按中國優(yōu)秀博碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫出版章程 規(guī)定享受相關(guān)權(quán)益。 同意授權(quán)中國科學(xué)信息技術(shù)研究所將本學(xué)位論文收錄到中國學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 ，并通過網(wǎng)絡(luò)向社會(huì)公眾提供信息服務(wù)。對(duì)于涉密的學(xué)位論文，解密后適用該授權(quán)。作者簽名：年月日導(dǎo)師簽名：年月日目錄1 2 3().4() . 6 1. . . 6 2. . . . 72.1.72.2A549

3、.82.3A54992.4A549ROS.92.5A54992.6 Western Blotting.92.7.10(). 1 2(). 2 1(). 2 4() . 2 5 . 29 . .50 . 51主要縮略詞英文索引縮略詞英文全稱PIpropidium iodideROSreactive oxygen speciesNACN-acetylcysteineCAScasticinMTT3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoli-um bromidePBSphosphate buffered salineFCMflow cytomet

4、ryTAXtaxolDMSOdimethyl sulfoxideCyt-Ccytochrome-cFBSfetal bovine serumSDstandand deviationIC 5050% inhibitory concentrationSASstatistics analysis systemIRinhibition ratioH2DCF2,7-dichlorodihydrofluorescein diacetateH-DAAabsorbanceJC-15,5,6,6-tetrachloro-1,1 ,3,3-tetrethylbenzimidalyl carbocyanine io

5、dideSPSSstatistical package of social scienceannexin 中文全稱碘化丙啶活性氧N- 乙酰半胱氨酸紫花牡荊素溴化四甲基偶氮唑藍(lán)磷酸鹽緩沖液流式細(xì)胞術(shù)紫杉醇二甲基亞砜細(xì)胞色素 C小牛血清標(biāo)準(zhǔn)差半數(shù)抑制濃度統(tǒng)計(jì)學(xué)分析系統(tǒng)抑制率2',7'- 二氫二氯熒光素乙二脂吸光度四氯四乙基苯并咪唑基羰花青碘化物社會(huì)科學(xué)統(tǒng)計(jì)軟件膜聯(lián)蛋白- 1 -紫花牡荊素對(duì)人肺腺癌A549 細(xì)胞增殖及凋亡的影響摘要目的： 檢定紫花牡荊素 (casticin, CAS)是否抑制人肺腺癌A549 細(xì)胞增殖活性和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡作用；并探討其作用機(jī)制是否涉及活性氧(react

6、ive oxygen species, ROS)生成以及線粒體信號(hào)傳導(dǎo)途徑。方法： 用不同濃度CAS 處理的體外培養(yǎng)A549 細(xì)胞，溴化四甲基偶氮唑藍(lán)(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2, 5-diphenyltetrazoli-um bromide, MTT) 法測(cè)定增殖活性；膜聯(lián)蛋白 (annexin )/碘化丙啶 (propidium iodide, PI)雙染色以流式細(xì)胞術(shù) (flow cytometry, FCM) 分析細(xì)胞凋亡率； 2',7'-二氫二氯熒光素乙二脂 (2,7-dichlorodihydrofluoresceindiaceta

7、te, H2DCFH-DA) 探針以 FCM 分析細(xì)胞 ROS 生成；四氯四乙基苯并咪唑基羰花青碘化物 (5,5,6,6-tetrachloro-1,1 ,3,3-tetrethyl benzimidalyl carbocyanine iodide, JC-1) 探針以 FCM 分析線粒體跨膜電位； Western Blotting 分析 Bax 蛋白表達(dá)和細(xì)胞色素C(cytochrome-c, Cyt-C)釋放。結(jié)果：MTT 法測(cè)定結(jié)果表明： CAS 能抑制 A549 細(xì)胞增殖，呈濃度依賴性和時(shí)間依賴性。 Annexin /PI 雙染色 FCM 分析結(jié)果表明： CAS 能促進(jìn) A549 細(xì)胞

8、凋亡， N-乙酰半胱氨酸 (N-acetylcysteine, NAC)有抑制 CAS 誘導(dǎo) A549 細(xì)胞凋亡的作用。 H2DCFH-DA 探針 FCM 分析結(jié)果表明：CAS 能增加 A549 細(xì)胞 ROS 生成水平，NAC 具有有效對(duì)抗 CAS 增加 ROS 生成的作用。 JC-1 探針 FCM 分析結(jié)果表明： CAS 能降低 A549 細(xì)胞的線粒體跨膜電位， NAC 具有減弱 CAS 降低線粒體膜電位的作用。 Western Blotting 分析結(jié)果表明： CAS 能促進(jìn) A549 細(xì)胞 Bax 蛋白表達(dá)和 Cyt-C 釋放， NAC 具有拮抗 CAS 上調(diào)Bax 蛋白表達(dá)和促進(jìn)Cyt

9、-C 釋放的作用。結(jié)論： 1. CAS 具有抑制 A549 細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用。2. CAS 誘導(dǎo) A549 細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制可能與ROS 生成及線粒體信號(hào)傳導(dǎo)途徑有關(guān)。關(guān)鍵詞 ：肺癌；紫花牡荊素；增殖；凋亡；線粒體- 2 -Key words:Effects of Casticin on proliferation and apoptosis inhuman lung cancer A549 cellsAbstractObjective: To examine the inhibitory effect of casticin (CAS) proliferation and in

10、ducing apoptosis in human lung cancer A549 cells; and to investigate whether its mechanisms is involved in the generation of reactive oxygen species (ROS) and the mitochondrial signaling pathway.Methods: Human lung cancer A549 cell line was cultured in vitro. 3-(4, 5-dimethylthiazol-2-yl)-2, 5-diphe

11、nyltetrazoli-um bromide (MTT) assay measured the proliferative activity of the A549 cells. The apoptosis rates of the cells were observed by flow cytometry (FCM) with annexin /propidium iodide (PI) fluorescence staining. The generation of ROS of the cells was examined by FCM with 2 , 7-dichlorodihyd

12、rofluoresceindiacetate (H2DCFH-DA) fluorescence probe. The mitochondrial membrane potential was detected by FCM with 5, 5 , 6,-tetrachloro6-1, 1 , 3,-tetrethyl3 benzimidalyl carbocyanine iodide (JC-1) fluorescence probe. The release of cytochrome-c (Cyt-C) inmitochondrion and the expression of bax p

13、rotein were analyzed by Western Blotting.Results: MTT assay showed that CAS could inhibit the proliferation activity of the A549 cells in a concentration-dependent and time-dependent manner. The FCM with Annexin/PI indicated that CAS could promote the apoptosis of the cells and N-acetylcysteine (NAC

14、) could inhibit the apoptosis. The FCM with H 2DCFH-DA indicated that CAS could increase the generation level of ROS and NAC could inhibit such effect. The FCM with JC-1 indicated that CAS could reduce the mitochondrial membrane potential and NAC could inhibit such effect. Western Blotting indicated

15、 that CAS could promote the expression of bax and the release of Cyt-C and the function of CAS could be restrained by NAC. Conclusion: 1. CAS has the effect of inhibiting proliferation activity and inducing apoptosis in the A549 cells.2. One of the important mechanisms of the A549 cells apoptosis in

16、duced by CAS involves the generation of ROS and the mitochondrial signaling pathway.Lung cancer; Casticin; Proliferation; Apoptosis; Mitochondrion- 3 -前言肺癌是人類目前所面臨的惡性腫瘤中最常見的之一，其發(fā)生發(fā)展所表現(xiàn)出的病理學(xué)過程是由于多種基因的變異和多個(gè)內(nèi)在、 外在因素共同引起的， 貫穿著一系列分子事件變化，包括細(xì)胞周期素 D1 與抑癌基因 P16 的異常表達(dá) 1 、癌基因 Bcl-2 的過表達(dá)、 Ras 基因的突變以及 DNA 損傷修復(fù)的突

17、變 2 等，均構(gòu)成了多基因的發(fā)病模型。因此，研究抗腫瘤的各種作用機(jī)制，并開發(fā)出新型的抗腫瘤藥物的現(xiàn)實(shí)意義就不言而喻了，目前，抗腫瘤研究的熱點(diǎn)， 主要集中在挖掘新型的天然藥物上，致力于肺癌發(fā)生發(fā)展的各個(gè)階段的預(yù)防和治療。近幾年來，隨著現(xiàn)代醫(yī)學(xué)、生物學(xué)、藥物化學(xué)和藥學(xué)的不斷發(fā)展，雖然肺癌的治療方法已經(jīng)有手術(shù)、放療、化療、免疫治療以及分子靶向治療等多種方法，但是其預(yù)后仍不能令人滿意，其 5年生存率仍然不到 15%3 。在我國，肺癌的中醫(yī)藥治療所表現(xiàn)出的一重大特色，即多靶點(diǎn)治療，其特點(diǎn)主要是表現(xiàn)在對(duì)肺癌病灶的穩(wěn)定性有較高的治療率，較好的延長(zhǎng)生存期， 較顯著的提高生活質(zhì)量， 并且對(duì)因放療或化療所帶來的不

18、良反應(yīng)能夠有效的減輕 4,5 ，同時(shí)具有抑制轉(zhuǎn)移與復(fù)發(fā)的潛在優(yōu)勢(shì)。對(duì)于中草藥的抗腫瘤作用，目前，國內(nèi)外許多學(xué)者通過提取中草藥的有效活性成分處理腫瘤細(xì)胞或腫瘤動(dòng)物移植瘤來進(jìn)行研究，顯示出中藥或復(fù)方制劑對(duì)肺癌有很好的抑制作用，從而體現(xiàn)出在肺癌的綜合治療中，我國的中醫(yī)藥已經(jīng)成為了不可或缺的重要組成部分。因此，在抗腫瘤藥物的開發(fā)和研究時(shí)， 在眾多純天然植物提取的有效活性物中，找到對(duì)于腫瘤細(xì)胞能夠具有選擇性地抑制或殺滅作用，而有較小毒副作用的化合物，就顯得格外重要。紫花牡荊素 (casticin, CAS)是一種多甲氧基黃酮類化合物，可以在多種植物的果實(shí)或葉子中找到，如馬鞭草科植物蔓荊6、香茶菜 8 以

19、及穗花牡荊 7 等，其中以蔓荊中的含量居多，其具有抗炎 9,10 、抗性激素 11和抗腫瘤 12-15等作用，并且是蔓荊子抗腫瘤作用的主要活性成分。 2006 年 Haidara 等 14 發(fā)現(xiàn) CAS 對(duì)人乳腺上皮癌和人結(jié)腸癌細(xì)胞均有抑制作用； 2009 年 Shen 等12 報(bào)道了 CAS 對(duì)人白血病眾多細(xì)胞株有抑制作用，但對(duì)正常細(xì)胞的增殖無影響或影響很??；2010 年陳艷等 16研究發(fā)現(xiàn)， CAS 能夠促進(jìn)人宮頸癌 HeLa 細(xì)胞的凋亡，其途徑可能與刺激活性氧生成有關(guān)；此外，還有研究發(fā)現(xiàn)CAS對(duì)人肝癌 HepG2 細(xì)胞 17 、卵巢癌細(xì)胞 18等，均可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。細(xì)胞凋亡是在多種

20、基因調(diào)控下的嚴(yán)密完整的、主動(dòng)的、有序的死亡過程。 而腫瘤的產(chǎn)生，與其正常細(xì)胞凋亡的抑制或失效密切相關(guān)，一方面既能使延長(zhǎng)細(xì)胞的壽命，堆積- 4 -過多的異常細(xì)胞， 另一方面又使已經(jīng)突變的細(xì)胞不能得到清除。 近年來，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的研究越來越受到重視。 手術(shù)治療仍然是治療肺癌首選方法， 術(shù)后輔以化療已成為臨床常規(guī)方案 19 , 但這依然不能明顯改善患者生存期。 由于導(dǎo)致肺癌患者死亡的主要原因是腫瘤的侵襲與轉(zhuǎn)移， 因此，在術(shù)后的化療中尋找能殺傷腫瘤細(xì)胞、 抑制腫瘤的侵襲與轉(zhuǎn)移的化療藥物，在腫瘤的治療中相當(dāng)重要。有研究報(bào)道， 在細(xì)胞的生命活動(dòng)中， 可以看作是其控制中心的線粒體， 在細(xì)胞內(nèi)既行使著氧化

21、磷酸化與細(xì)胞呼吸鏈的作用， 也能夠調(diào)控細(xì)胞的凋亡。 在真核細(xì)胞內(nèi)， 線粒體可以產(chǎn)生腺苷三磷酸， 使細(xì)胞的能量代謝得以維持， 進(jìn)而能使細(xì)胞完成正常的功能活動(dòng)。線粒體內(nèi)也存在一些物質(zhì)，與細(xì)胞凋亡的關(guān)系很密切，比如有細(xì)胞色素 C(cytochrome-c, Cyt-C)、活性氧 (reactive oxygen species, ROS)、凋亡誘導(dǎo)因子和 Ca2+等。在凋亡信號(hào)的刺激下， 細(xì)胞內(nèi) Bcl 基因家族的凋亡蛋白得到表達(dá)， 使線粒體開放其膜上透性轉(zhuǎn)換孔， 其膜的通透性增加， 最終引發(fā)細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵性步驟， 即線粒體跨膜電位下降 21和 Cyt-C 釋放 20 。線粒體經(jīng)不同信號(hào)的刺激，再?zèng)Q

22、定這些事件的激活或是抑制，最終通過其下游的信號(hào)通路對(duì)細(xì)胞的凋亡進(jìn)行調(diào)控 22 。然而，腫瘤細(xì)胞大多數(shù)處于一個(gè)高代謝狀態(tài)，在細(xì)胞線粒體內(nèi)， 與正常細(xì)胞相比較， 呼吸鏈的轉(zhuǎn)運(yùn)活性有顯著的增高，但是，正是因?yàn)槟[瘤細(xì)胞的這種高代謝， 使得線粒體膜的完整的功能狀態(tài)受到破壞， 進(jìn)而，當(dāng)從線粒體凋亡途徑上著手誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡時(shí)，作用將更加敏感23。綜合以上研究成果，本課題擬綜合應(yīng)用現(xiàn)代實(shí)驗(yàn)技術(shù)，旨在研究CAS 抑制人肺癌A549 細(xì)胞的增殖和誘導(dǎo)其凋亡的作用， 并探討其作用機(jī)制是否涉及ROS 生成以及線粒體信號(hào)傳導(dǎo)途徑， 在找尋新型對(duì)抗肺癌并存在潛在開發(fā)前景的藥物的道路上，嘗試著提供一些有效的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。-

23、5 -材料和方法1材料1.1細(xì)胞株與細(xì)胞培養(yǎng)南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院腫瘤外科惠贈(zèng)得到人肺腺癌A549 細(xì)胞株；進(jìn)行培養(yǎng)的培養(yǎng)基是 RPMI-1640 培養(yǎng)基，并在其中添加10%的新生小牛血清 (fetal bovine serum, FBS)，放置于含 5%CO2 的飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，調(diào)整溫度至37。1.2藥品與試劑CAS 相對(duì)分子量為 374.3，淡黃色粉末， 純度 >98%，從成都普瑞法科技開發(fā)公司購得；PRMI-1640 培養(yǎng)基從 Gibco 公司（美國）購得； FBS 從杭州四季青生物工程材料有限 公 司 購 得； 二甲 基亞 砜 (dimethylsulfoxide,DMSO)

24、 和 溴 化 四 甲 基 偶氮 唑 藍(lán)(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromide, MTT) 從 Amresco 公司（美國）購得；紫杉醇 (taxol, TAX) 從山西振東泰盛制藥有限公司購得；抗 Bax 蛋白抗體與抗 Cyt-C 抗體均為兔抗人單克隆抗體， 從 Epitomics 公司購得；膜聯(lián)蛋白 (annexin )/ 碘化丙啶 (propidium iodide, PI)凋亡檢測(cè)試劑盒從南京凱基公司購得； 活性氧檢測(cè)試劑盒（ 2',7'-二氫二氯熒光素乙二脂 (2,7-dichlorodi

25、hydrofluorescein diacetate, H2DCFH-DA) 探針）與線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒（四氯四乙基苯并咪唑基羰花青碘化物(5,5 ,6,6-tetrachloro-1,1 ,3,3-tetrethyl benzimidalyl carbocyanine iodide, JC-1) 探針）均購自美國 Molecular Probes Inc 公司；電泳及染色試劑（丙烯酰胺、 Bis、 APS、甘氨酸、 Tris 堿、 SDS、TEMED 、考馬斯亮藍(lán) R-250、溴酚藍(lán)）購自上海生物工程公司； PVDF 膜購自 Minipore 公司；余為國產(chǎn)分析純?cè)噭?.3主要儀器CO

26、2 細(xì)胞培養(yǎng)箱：由 SHEL-LAB 公司（美國）生產(chǎn)高速低溫離心機(jī)：由SIGMA 公司（德國）生產(chǎn)，型號(hào)為4K15倒置顯微鏡：由OLYMPUS 公司（日本）生產(chǎn)皿式分析電子天平：由上海天平儀器廠生產(chǎn)，型號(hào)為HANGPINC JA1003超低溫冰箱：由SANYO 公司（日本）生產(chǎn)電子 PH 儀：由 Beckman 公司（美國）生產(chǎn)高速離心機(jī)：由Eppendorf 公司（德國）生產(chǎn)，型號(hào)為5804流式細(xì)胞儀：由Coulter 公司（美國）生產(chǎn)，型號(hào)為EPICS-XL ，Cell quest 軟件分析- 6 -各種培養(yǎng)器皿、培養(yǎng)瓶、96 孔培養(yǎng)板等：由Becton Dickinson 公司（美國）

27、生產(chǎn)穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀：由北京市六一儀器廠生產(chǎn)，型號(hào)為DYY-8BEppendorf 加樣器：由 Eppendorf 公司（德國）生產(chǎn)酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀：由上海富眾生物科學(xué)有限公司生產(chǎn)，型號(hào)為ELX-800去離子水純化儀：由USF E1GA 公司（德國）生產(chǎn)醫(yī)用超凈工作臺(tái)：由蘇州凈化設(shè)備公司生產(chǎn)，型號(hào)為YJ-875光學(xué)顯微鏡：由OLYMPUS 公司（日本）生產(chǎn)Heto-Holten 冷水循環(huán)儀：由Gyde Vomg17-19 3450 Allerod 公司（丹麥）生產(chǎn)2 方 法2.1 實(shí)驗(yàn)液的配制2.1.1 PBS ：用雙蒸去離子水溶解KCl 粉 0.2g、NaCl 粉 8.0g、KH 2PO4 粉

28、0.24g 和 Na2HPO4·12H2O粉 3.63g，PH 值調(diào)整至 7.4，再加雙蒸去離子水定容量于1000ml，接著在 121的高壓鍋內(nèi)滅菌 20min，最后保存于 4的冰箱內(nèi)。2.1.2受試物的配制稱取 CAS 粉末 10.22mg，在超凈工作臺(tái)下用無菌 DMSO 0.5ml 充分溶解后，加磷酸鹽緩沖液 (phosphate buffered saline, PBS)，即配成濃度為 3mmol/L 的 CAS 母液 10ml。取母液 100l，加 PBS 900l，即配成濃度為 300mol/L 的工作液；取濃度為 300mol/L 的工作液 333l，加 PBS 666l

29、，即配成濃度為 100mol/L 的工作液；取濃度為 100mol/L 的工作液 100l，加 PBS 900l，即配成濃度為 30mol/L 的工作液； 取濃度為 30mol/L 的工作液 100l，加 PBS 900l，即配成濃度為 10mol/L 的工作液； 取濃度為 10mol/L 的工作液 100l，加 PBS 900l，即配成濃度為 3mol/L 的工作液；取濃度為 3mol/L 的工作液 100l，加 PBS 900l，即配成濃度為 1mol/L 的工作液；將上述母液和工作液置于 4冰箱中保存。2.1.3對(duì)照藥品的配制：TAX 規(guī)格為 30mg/5ml/支，批號(hào)為 0604131

30、。在無菌操作臺(tái)內(nèi)，用 2242l 的 PBS 稀釋 TAX 原液 100l，配成 0.3mmol/L 的 TAX 液母液 2.342ml；取母液 100l，加 PBS 900l，即配成濃度為 30mol/L 的工作液，將上述母液和工作液保存于 4的冰箱內(nèi)。2.1.4 RPMI-1640 培養(yǎng)基：取 1000ml 蒸餾水溶解 RPMI-1640 培養(yǎng)基粉 10.4g，加入 NaHCO3 粉 2g，然后用適- 7 -量 HCl 調(diào)整 pH 值至 7.0，通過 0.22 m 微孔濾膜抽濾除菌，最后保存于4的冰箱內(nèi)，臨用時(shí)加 10%FBS。2.1.5 FBS ：FBS 在 56水浴中滅活 30min

31、后，分裝保存于 -20的冰箱內(nèi)。2.1.6胰蛋白酶：用 100ml PBS 溶解胰蛋白酶粉 0.25g，再通過 0.22 m 微孔濾膜進(jìn)行抽濾除菌，最后保存于 4的冰箱內(nèi)。2.1.7 MTT ：用 1ml PBS 溶解 MTT 粉 5mg，再通過 0.22 m 微孔濾膜進(jìn)行抽濾除菌，最后保存于 4的冰箱內(nèi)。使用期限為 2 周。2.2 MTT 比色法測(cè)定 CAS對(duì)人肺癌 A549細(xì)胞增殖活性的影響：參考文獻(xiàn)所述方法 24 ，用完全培養(yǎng)基調(diào)整處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549 細(xì)胞濃度至 6×4180l，經(jīng) 4-6h 的培10 /mL 后，在 96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中繼續(xù)培養(yǎng)，每孔含細(xì)胞的培養(yǎng)基養(yǎng)，當(dāng)

32、細(xì)胞貼壁以后，分5 組分別加入終濃度為 0.3、1.0、3.0、10.0、30.0mol/L 的CAS 液 20l，分別作用14A549 細(xì)胞 48h；陽性對(duì)照藥組，加入終濃度為 1.0 mol/L 的TAX ，作用 A549 細(xì)胞 48h；溶媒對(duì)照組，加入終濃度為0.1%的 DMSO ，作用 A549 細(xì)胞 48h，每組設(shè)置復(fù)孔 4 個(gè)，每孔加已配置好的濃度為5g/L 的 MTT 液 20l，繼續(xù)培養(yǎng)4h 于培養(yǎng)箱中，吸去培養(yǎng)基，在每孔內(nèi)加 DMSO 100 l，震蕩 10min，充分溶解紫藍(lán)色沉淀，經(jīng)酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀于 570nm 波長(zhǎng)測(cè)定吸光度 (absorbance, A)值，按公式 2

33、5 ：抑制率 (inhibition ratio, IR) (1實(shí)驗(yàn)組 A 均值 /對(duì)照組 A 均值 )×100%計(jì)算相對(duì)增殖抑制率，用統(tǒng)計(jì)學(xué)分析系統(tǒng) (statistics analysis system, SAS) 軟件計(jì)算出半數(shù)抑制濃度(50%inhibitory concentration, IC 50)值。以上實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。用完全培養(yǎng)基調(diào)整處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549 細(xì)胞濃度至 6× 104/mL 后，在 96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中繼續(xù)培養(yǎng)，每孔含細(xì)胞的培養(yǎng)基180l，經(jīng) 4-6h 的培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞貼壁以后加入 20l終濃度接近 IC50 值的 CAS 液，分別作用 A5

34、49 細(xì)胞 24h、48h、72h；溶媒對(duì)照組，加入終濃度為 0.1%的 DMSO ，作用 A549 細(xì)胞 48h；N-乙酰半胱氨酸 (N-acetylcysteine, NAC) 干預(yù)實(shí)驗(yàn)組，待細(xì)胞貼壁后用 10mmol/L 的 NAC 預(yù)孵育細(xì)胞 1h，加入 20l接近IC50 值濃度 CAS 液繼續(xù)作用 A549 細(xì)胞 48h，每組設(shè)置復(fù)孔 4 個(gè)，每孔加已配置好的濃度為 5g/L 的 MTT 液 20l，繼續(xù)培養(yǎng) 4h 于培養(yǎng)箱中，吸去培養(yǎng)基，在每孔內(nèi)加 DMSO 100l，震蕩 10min，充分溶解紫藍(lán)色沉淀， 經(jīng)酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀于 570nm 波長(zhǎng)測(cè)定 A 值。- 8 -以上實(shí)驗(yàn)重復(fù)

35、 3 次。2.3 Annexin/PI 雙染色 FMS分析 CAS對(duì)人肺癌 A549細(xì)胞凋亡的影響參考文獻(xiàn)所述方法26，用完全培養(yǎng)基調(diào)整處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549 細(xì)胞濃度至 6×410 /mL后，在250ml的培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng) 4-6h，當(dāng)細(xì)胞貼壁以后加入終濃度接近IC50值的14CAS液，分別作用 A549 細(xì)胞 12h、24h、 48h；陽性藥物組，加入終濃度為1.0 mol/L的 TAX ，作用 A549細(xì)胞 48h；溶媒對(duì)照組，加入終濃度為 0.1%的DMSO ，作用 A549細(xì)胞48h；NAC 干預(yù)實(shí)驗(yàn)組，待細(xì)胞貼壁后用10mmol/L 的 NAC 預(yù)孵育細(xì)胞 1h，加入終

36、濃度接近 IC50值的 CAS繼續(xù)作用 A549細(xì)胞 48h，收集 2.0×106個(gè)受試物處理后的 A549細(xì)胞，冷PBS洗2遍，經(jīng)annexin 和 PI雙染色 27，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率28 。以上實(shí)驗(yàn)重復(fù) 3次。2.4 H 2DCFH-DA探針 FCM分析 CAS對(duì)人肺癌 A549細(xì)胞 ROS生成的影響用完全培養(yǎng)基調(diào)整處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549 細(xì)胞濃度至 6×104/mL 后，在 250ml 的培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)4-6h，當(dāng)細(xì)胞貼壁以后加入終濃度接近IC50 值的 CAS 液，分別作用A549 細(xì)胞 12h、24h、48h；溶媒對(duì)照組，加入終濃度為0.1%的 DM

37、SO ，作用 A549 細(xì)胞 48h；NAC 干預(yù)實(shí)驗(yàn)組，待細(xì)胞貼壁后用10mmol/L 的 NAC 預(yù)孵育細(xì)胞 1h，加入終濃度接近 IC50 值的 CAS 液繼續(xù)作用 A549 細(xì)胞 48h，收集 2.0×106 個(gè)受試物處理后的A549 細(xì)胞，用無血清培養(yǎng)基清洗三次，重懸于1ml 的 H2DCFH-DA 探針中， 37暗室作用 30min，用流式細(xì)胞儀以488nm 為激發(fā)波長(zhǎng)， 525nm 為發(fā)射波長(zhǎng)測(cè)定細(xì)胞內(nèi)的熒光強(qiáng)度。以上實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。2.5 JC-1 探針 FCM分析 CAS對(duì)人肺癌 A549細(xì)胞線粒體跨膜電位的影響用完全培養(yǎng)基調(diào)整處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549 細(xì)胞濃度至

38、6×104/mL 后，在 250ml 的培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)4-6h，當(dāng)細(xì)胞貼壁以后加入終濃度接近IC50 值的 CAS 液，分別作用A549 細(xì)胞 12h、24h、48h；溶媒對(duì)照組，加入終濃度為0.1%的 DMSO ，作用 A549 細(xì)胞 48h；NAC干預(yù)實(shí)驗(yàn)組，待細(xì)胞貼壁后用 10mmol/L 的 NAC 預(yù)孵育細(xì)胞 1h，加入終濃度接近 IC50值的 CAS 液繼續(xù)作用 A549 細(xì)胞 48h，收集經(jīng)受試物作用的 2.0×106 個(gè)細(xì)胞，用 PBS 洗 2 遍，重懸于終濃度為 5g/mL的 JC-1 染色液中， 37避光作用 30 分鐘，再用 PBS 洗滌 2 遍，調(diào)

39、試流式細(xì)胞儀至 475nm 激發(fā)波長(zhǎng)和 525nm 發(fā)射波長(zhǎng)后，對(duì)線粒體中 JC-1 所表現(xiàn)的紅、綠色的熒光強(qiáng)度進(jìn)行檢測(cè)。以上實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。2.6 Western Blotting檢測(cè)分析2.6.1 CAS 對(duì)人肺癌 A549細(xì)胞線粒體 Cyt-C 釋放的影響- 9 -用完全培養(yǎng)基調(diào)整處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549 細(xì)胞濃度至 6×104/mL 后，在 250ml 的培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)4-6h，當(dāng)細(xì)胞貼壁以后加入終濃度接近IC50 值的 CAS 液，分別作用A549 細(xì)胞 12h、24h、48h；溶媒對(duì)照組，加入終濃度為0.1%的 DMSO ，作用 A549 細(xì)胞 48h；NAC 干預(yù)實(shí)驗(yàn)

40、組，待細(xì)胞貼壁后用10mmol/L 的 NAC 預(yù)孵育細(xì)胞 1h，加入終濃度接近 IC50 值的 CAS 液繼續(xù)作用 A549 細(xì)胞 48h，收集 2.0×106 個(gè)受試物處理后的A549 細(xì)胞，用 PBS 洗 3 遍，經(jīng)細(xì)胞裂解液裂解后，在 4下 13000rpm 離心 10min，再收集細(xì)胞的總蛋白，經(jīng) BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒處理后，在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上定量檢測(cè)每個(gè)樣本的蛋白量。把等體積的上樣緩沖液加入到總蛋白為40g/泳道的蛋白樣品中，置于 100沸水中 5min，經(jīng) 10%聚丙烯酰胺凝膠電泳 3h，待蛋白樣品轉(zhuǎn)移至 PVDF膜上。在室溫下，用含 5%脫脂牛奶的 TBST 液

41、對(duì) PVDF 膜封閉 2h，再在室溫下加入Cyt-C(1:500)孵育 2h 后，用 TBST 液洗 3 遍，每遍洗 10min，然后用相應(yīng)的二抗繼續(xù)孵育，用 TBST 液再次洗滌 PVDF 膜 3 遍，每遍洗 15 min 后，最后用化學(xué)發(fā)光劑 A、 B處理激發(fā)熒光，在暗室中壓片、顯影、定影29,30 。以上實(shí)驗(yàn)重復(fù) 3 次。2.6.2 CAS 對(duì)人肺癌 A549細(xì)胞 Bax 蛋白表達(dá)的影響用完全培養(yǎng)基調(diào)整處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549 細(xì)胞濃度至 6×104/mL 后，在 250ml 的培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)4-6h，當(dāng)細(xì)胞貼壁以后加入終濃度接近IC50 值的 CAS 液，分別作用A549

42、細(xì)胞 12h、24h、48h；溶媒對(duì)照組，加入終濃度為0.1%的 DMSO ，作用 A549 細(xì)胞 48h；NAC 干預(yù)實(shí)驗(yàn)組，待細(xì)胞貼壁后用10mmol/L 的 NAC 預(yù)孵育細(xì)胞 1h，加入終濃度接近 IC50 值的 CAS 液繼續(xù)作用 A549 細(xì)胞 48h，收集 2.0×106 個(gè)受試物處理后的 A549 細(xì)胞，用 PBS 洗 3 遍，經(jīng)細(xì)胞裂解液裂解后，在 4下 13000rpm 離心 10min，再收集細(xì)胞的總蛋白，經(jīng) BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒處理后，在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上定量檢測(cè)每個(gè)樣本的蛋白量。把等體積的上樣緩沖液加入到總蛋白為40g/泳道的蛋白樣品中，置于 100沸水

43、中 5min，經(jīng) 10%聚丙烯酰胺凝膠電泳 3h，待蛋白樣品轉(zhuǎn)移至 PVDF 膜上。在室溫下，用含 5%脫脂牛奶的 TBST 液對(duì) PVDF 膜封閉 2h，再在室溫下加入 Bax 蛋白 (1:500)孵育 2h 后，用 TBST 液洗 3 遍，每遍洗 10min，然后用相應(yīng)的二抗繼續(xù)孵育，用 TBST 液再次洗滌 PVDF 膜 3 遍，每遍洗 15 min 后，最后用化學(xué)發(fā)光劑 A 、B處理激發(fā)熒光，在暗室中壓片、顯影、定影29,30 。以上實(shí)驗(yàn)重復(fù) 3 次。2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)錄入社會(huì)科學(xué)統(tǒng)計(jì)軟件包(statistical package of social science, SPSS

44、)13.，0建立數(shù)據(jù)庫，采用均數(shù) ±標(biāo)準(zhǔn)差 ( x ±SD)表示各組的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，并用單因素方差統(tǒng)計(jì)分析。在-10-對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組均數(shù)間進(jìn)行比較時(shí)采用LSD 法，在各組均數(shù)之間進(jìn)行兩兩比較時(shí)采用SNK 法，定義 P<0.05 為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。-11-結(jié) 果1. MTT 比色法測(cè)定 CAS對(duì)人肺癌 A549 細(xì)胞增殖活性的影響MTT 比色法測(cè)定結(jié)果顯示， A549 細(xì)胞被 CAS（不同濃度）作用48h 后， CAS 能抑制細(xì)胞的增殖，并呈現(xiàn)濃度的依賴性，對(duì)比溶媒對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P<0.05)。在各 CAS（不同濃度）組之間行對(duì)比，各組間所表現(xiàn)的細(xì)胞增

45、殖抑制率差異也具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P<0.05)。經(jīng)實(shí)驗(yàn)后還發(fā)現(xiàn)， CAS(30.0mol/L)組與 TAX(1.0mol/L)組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P<0.05)，但相比其他濃度 CAS，與 TAX(1.0mol/L)組細(xì)胞增殖抑制作用相近的是 CAS(30.0mol/L)組。經(jīng)計(jì)算，得到 CAS 的 IC50 值為 10.32 mol/L。（見表 1，圖 1）表 1MTT 比色法測(cè)定不同濃度CAS 對(duì) A549 細(xì)胞增殖活性的影響藥物濃度 ( mol/L)A570( x±IRSD)DMSO0.11.455 ±0.224CAS0.31.337 ±

46、0.046 *8.691.01.157 ±0.070 *21.703.01.030 ±0.037 *30.8410.00.709 ±0.057 *54.0430.00.589 ±0.030 *#62.26TAX1.00.449 ±0.200 *73.08注：* ，示與溶媒組比較P<0.05；#，示與 TAX 組比較 P<0.05；數(shù)據(jù)為 3 次實(shí)驗(yàn)的x ±SD，n=3，t=48h-12-圖 1MTT 比色法測(cè)定不同濃度CAS 對(duì) A549 細(xì)胞增殖活性的影響注： * ，示與溶媒組比較P<0.05； #，示與 TAX

47、組比較 P<0.05；數(shù)據(jù)為3 次實(shí)驗(yàn)的x ±SD， n=3MTT 比色法測(cè)定結(jié)果顯示， 與溶媒對(duì)照組相比， 用 CAS(10 mol/L)處理 A549 細(xì)胞不同時(shí)間段，抑制 A549 細(xì)胞增殖的作用加強(qiáng)， 并呈現(xiàn)時(shí)間的依賴性， 對(duì)比溶媒對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P<0.05)；用 NAC(10mmol/L) 預(yù)孵育細(xì)胞 1h 后， CAS(10 mol/L) 處理 A549 細(xì)胞 48h，可以發(fā)現(xiàn) NAC 能減弱 CAS 抑制 A549 細(xì)胞的增殖作用，與 CAS 單純作用細(xì)胞 48h 比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P<0.05)。（見表 2，圖 2）表 2MT

48、T 比色法測(cè)定 CAS 作用 A549 細(xì)胞不同時(shí)間段對(duì)細(xì)胞增殖活性的影響藥物時(shí)間 (h)A 570x ±抑制率(SD)DMSO (0.1%)481.446 ±0.027CAS (10 mol/L)241.043 ±0.024 *27.87480.698 ±0.022 *51.73720.519 ±0.006 *64.11NAC+CAS480.829 ±0.009 #42.67注： NAC+CAS ：NAC(10mmol/L)預(yù)孵育細(xì)胞 1h后，加入 CAS(10 mol/L) 繼續(xù)作用A549 細(xì)胞 48h；* ，示與溶媒組比較P&

49、lt;0.05 ； #，示與 CAS(48h) 組比較 P<0.05 ；數(shù)據(jù)為3 次實(shí)驗(yàn)的x ±SD， n=3-13-圖 2MTT 比色法測(cè)定CAS 作用 A549 細(xì)胞不同時(shí)間段對(duì)細(xì)胞增殖活性的影響注： NAC+CAS ：NAC(10mmol/L) 預(yù)孵育細(xì)胞1h 后，加入 CAS(10 mol/L) 繼續(xù)作用A549 細(xì)胞 48h；* ，示與溶媒組比較 P<0.05 ； #，示與 CAS(48h) 組比較 P<0.05 ；數(shù)據(jù)為 3 次實(shí)驗(yàn)的 x ±SD， n=32. Annexin /PI 雙染色 FCM分析 CAS對(duì)人肺癌 A54 細(xì)胞凋亡的影響Annexin /PI雙染色 FCM 分析結(jié)果表明， 溶媒對(duì)照組、 CAS(10 mol/L)對(duì)A549細(xì)胞作用不同時(shí)間段 (12h、24h、48h)組；TAX(1.0