紫外可見分光光法實用教案

1、會計學1紫外可見紫外可見(kjin)分光光法分光光法第一頁，共106頁。 基于物質光化學性質而建立起來的分析方法稱之為光化學分析法。 分為:光譜分析法和非光譜分析法。 光譜分析法是指在光（或其它能量）的作用下，通過測量物質產生的發(fā)射(fsh)光、吸收光或散射光的波長和強度來進行分析的方法。 第1頁/共106頁第二頁，共106頁。 在光譜分析中，依據(jù)物質對光在光譜分析中，依據(jù)物質對光(du gung)(du gung)的選擇性吸收而建立起來的分析方法稱為吸光光度法的選擇性吸收而建立起來的分析方法稱為吸光光度法, ,主要有主要有: : 紅外吸收光譜：分子振動光譜，吸收光波長范圍紅外吸收光譜：分子振

2、動光譜，吸收光波長范圍2.52.51000 1000 m ,m ,主要用于有機化合物結構鑒定。主要用于有機化合物結構鑒定。 紫外吸收光譜：電子躍遷光譜，吸收光波長范圍紫外吸收光譜：電子躍遷光譜，吸收光波長范圍200200400 nm400 nm（近紫外區(qū)）（近紫外區(qū)） ，可用于結構鑒定和定量分析。，可用于結構鑒定和定量分析。 可見吸收光譜：電子躍遷光譜，吸收光波長范圍可見吸收光譜：電子躍遷光譜，吸收光波長范圍400400750 nm 750 nm ，主要用于有色物質的定量分析。，主要用于有色物質的定量分析。 本章主要講授紫外可見吸光光度法。本章主要講授紫外可見吸光光度法。第2頁/共106頁第三

3、頁，共106頁。1 1光的基本性質光的基本性質(xngzh)(xngzh) 光是一種電磁波，具有波粒二象性。光的波光是一種電磁波，具有波粒二象性。光的波動性可用波長動性可用波長、頻率、頻率、光速、光速c c、波數(shù)（、波數(shù)（cm-1cm-1）等參數(shù)來描述：）等參數(shù)來描述： = c = c ； 波數(shù)波數(shù) = 1/ = 1/ = = /c/c 光是由光子流組成，光子的能量：光是由光子流組成，光子的能量： E = h E = h = h c / = h c / （PlanckPlanck常數(shù)：常數(shù)：h=6.626 h=6.626 10 -34 J 10 -34 J S )S )第3頁/共106頁第四頁

4、，共106頁。第4頁/共106頁第五頁，共106頁。E = E2 - E1 = h ：量子化 ；選擇性吸收吸收曲線與最大吸收波長(bchng) max用不同波長(bchng)的單色光照射，測吸光度光的互補光的互補(h b)：藍：藍 黃黃M + 熱M + 熒光或磷光M + h M *基態(tài)基態(tài) 激發(fā)激發(fā)態(tài)態(tài)E1 （E） E2第5頁/共106頁第六頁，共106頁。同一種物質同一種物質(wzh)(wzh)對不同對不同波長光的吸光度不同。吸光度波長光的吸光度不同。吸光度最大處對應的波長稱為最大吸最大處對應的波長稱為最大吸收波長收波長maxmax不同濃度的同一種物質不同濃度的同一種物質(wzh)(wzh)

5、，其吸收曲線形狀相，其吸收曲線形狀相似似maxmax不變。而對于不同物不變。而對于不同物質質(wzh)(wzh)，它們的吸收曲線，它們的吸收曲線形狀和形狀和maxmax則不同。則不同。第6頁/共106頁第七頁，共106頁。第7頁/共106頁第八頁，共106頁。物質分子內部三種運動物質分子內部三種運動(yndng)(yndng)形式：形式： 1. 1.電子相對于原子核的運動電子相對于原子核的運動(yndng)(yndng)， 2. 2.原子核在其平衡位置附近的相對振動原子核在其平衡位置附近的相對振動 3. 3.分子本身繞其重心的轉動。分子本身繞其重心的轉動。第8頁/共106頁第九頁，共106頁。

6、 evr evr 第9頁/共106頁第十頁，共106頁。 電子能級間躍遷的同時，總伴電子能級間躍遷的同時，總伴隨有振動和轉動能級間的躍遷。即隨有振動和轉動能級間的躍遷。即電子光譜中總包含電子光譜中總包含(bohn)(bohn)有振動有振動能級和轉動能級間躍遷產生的若干能級和轉動能級間躍遷產生的若干譜線而呈現(xiàn)寬譜帶。譜線而呈現(xiàn)寬譜帶。第10頁/共106頁第十一頁，共106頁。1（1 1） 轉動能級間的能量差轉動能級間的能量差rr：0.0050.0050.050eV0.050eV，躍遷產生吸收光譜位于，躍遷產生吸收光譜位于(wiy)(wiy)遠紅外區(qū)。遠紅外光譜遠紅外區(qū)。遠紅外光譜或分子轉動光譜；

7、或分子轉動光譜；1（2 2）振動能級的能量差）振動能級的能量差vv約為：約為：0.050.05eVeV，躍，躍遷產生的吸收光譜位于遷產生的吸收光譜位于(wiy)(wiy)紅外區(qū)，紅外光譜或分子紅外區(qū)，紅外光譜或分子振動光譜；振動光譜；1（3 3）電子能級的能量差）電子能級的能量差ee較大較大1 120eV20eV。電子躍。電子躍遷產生的吸收光譜在紫外遷產生的吸收光譜在紫外可見光區(qū)，紫外可見光區(qū)，紫外可見光譜可見光譜或分子的電子光譜?；蚍肿拥碾娮庸庾V。第11頁/共106頁第十二頁，共106頁。1（4 4）吸收光譜的波長分布是由產生譜帶的躍遷能級間的）吸收光譜的波長分布是由產生譜帶的躍遷能級間的能

8、量差所決定，反映了分子內部能級分布狀況，是物質定性能量差所決定，反映了分子內部能級分布狀況，是物質定性的依據(jù)。的依據(jù)。1（5 5）吸收譜帶的強度與分子偶極矩變化、躍遷幾率有關）吸收譜帶的強度與分子偶極矩變化、躍遷幾率有關，也提供分子結構的信息。通常將在最大吸收波長處測得的，也提供分子結構的信息。通常將在最大吸收波長處測得的摩爾吸光系數(shù)摩爾吸光系數(shù)maxmax也作為定性的依據(jù)。不同也作為定性的依據(jù)。不同(b tn)(b tn)物質物質的的maxmax有時可能相同，但有時可能相同，但maxmax不一定相同；不一定相同；1（6 6）吸收譜帶強度與該物質分子吸收的光子數(shù)成正比，）吸收譜帶強度與該物質分

9、子吸收的光子數(shù)成正比，定量分析的依據(jù)。定量分析的依據(jù)。第12頁/共106頁第十三頁，共106頁。1 1紫外紫外可見吸收光譜可見吸收光譜 有機化合物的紫外有機化合物的紫外可見吸收光譜，是其分子可見吸收光譜，是其分子(fnz)(fnz)中外層價電子躍遷的結果（三種）：中外層價電子躍遷的結果（三種）：電子、電子、電子、電子、n n電子。電子。分子軌道理論：一個分子軌道理論：一個(y )(y )成鍵軌道必定有一個成鍵軌道必定有一個(y )(y )相應的反鍵軌道。通常外層電子均處于分子軌道的基態(tài)，即成鍵軌道或非鍵軌道上。相應的反鍵軌道。通常外層電子均處于分子軌道的基態(tài)，即成鍵軌道或非鍵軌道上。 當外層電

10、子吸收紫外或可見輻射后，就從基態(tài)向激發(fā)態(tài)當外層電子吸收紫外或可見輻射后，就從基態(tài)向激發(fā)態(tài)( (反鍵軌道反鍵軌道) )躍遷。主要有四種躍遷所需能量躍遷。主要有四種躍遷所需能量大小順序為：大小順序為：n n n n 第13頁/共106頁第十四頁，共106頁。 所需能量最大，電子只有(zhyu)吸收遠紫外光的能量才能發(fā)生躍遷。飽和烷烴的分子吸收光譜出現(xiàn)在遠紫外區(qū)(吸收波長105 105 ： 超高靈敏；超高靈敏； =(6 =(61010）104 104 ： 高靈敏；高靈敏； 2 2104 104 ： 不靈敏。不靈敏。在數(shù)值上等于濃度為在數(shù)值上等于濃度為1mol/L1mol/L、液層厚度為、液層厚度為1

11、cm1cm時該時該溶液在某一波長溶液在某一波長(bchng)(bchng)下的吸光度。下的吸光度。第47頁/共106頁第四十八頁，共106頁。 標準曲線(qxin)法測定未知溶液的濃度時，發(fā)現(xiàn)：標準曲線(qxin)常發(fā)生彎曲（尤其當溶液濃度較高時），這種現(xiàn)象稱為對朗伯比耳定律的偏離。 引起這種偏離的因素（兩大類）：一類是物理性因素，即儀器的非理想引起的；另一類是化學性因素。第48頁/共106頁第四十九頁，共106頁。非單色光、雜散光、非平行入射非單色光、雜散光、非平行入射光都會引起對朗伯光都會引起對朗伯比耳定律的比耳定律的偏離，最主要的是非單色光作為偏離，最主要的是非單色光作為入射光引起的偏離

12、。入射光引起的偏離。第49頁/共106頁第五十頁，共106頁。 假設由波長(bchng)為1和2的兩單色光組成的入射光通過濃度為c的溶液，則： 1lg（o1 /t1 ）1bc 2lg(o2 /t2 ）2bc故： t1 o1101bc ； t2 o2102bc式中o1、o2分別為1、2 的入射光強度； t1、t2分別為1、2 的透射光強度； 1、2分別為1、2的摩爾吸光系數(shù)；第50頁/共106頁第五十一頁，共106頁。第51頁/共106頁第五十二頁，共106頁。 A A總總 =A1 + lg2 - lg(1 =A1 + lg2 - lg(11010bc ) bc ) = 0 = 0； 即：即：1

13、=2 =1=2 = 則：則： A A總總 lglg（o/o/t t）bcbc 0 0 若若 0 0 ；即；即21 20,bc0, lg lg（10bc 10bc ）值隨）值隨c c值增大值增大(zn (zn d)d)而增大而增大(zn d)(zn d)，則標準曲線偏離直線向，則標準曲線偏離直線向c c軸彎曲，即負偏離；反之，則向軸彎曲，即負偏離；反之，則向A A軸彎曲，即正軸彎曲，即正偏離。偏離。 很小時，即很小時，即1212： 第52頁/共106頁第五十三頁，共106頁。待測物質的最大吸收波長且吸待測物質的最大吸收波長且吸收曲線較平坦處。收曲線較平坦處。第53頁/共106頁第五十四頁，共10

14、6頁。朗朗比耳定律的假定：所有的吸光質點之間不比耳定律的假定：所有的吸光質點之間不發(fā)生發(fā)生(fshng)(fshng)相互作用；假定只有在稀溶液相互作用；假定只有在稀溶液(c10-2mol/L)(c10 c 10 2 mol/L 2 mol/L 時，吸光質時，吸光質點間可能發(fā)生點間可能發(fā)生(fshng)(fshng)締合等相互作用，直締合等相互作用，直接影響了對光的吸收。接影響了對光的吸收。故：朗伯故：朗伯比耳定律只適用于稀溶液比耳定律只適用于稀溶液 第54頁/共106頁第五十五頁，共106頁。(xin tn)(xin tn)。故：此時溶液。故：此時溶液pH pH 對測定有重要影響。對測定有重

15、要影響。第55頁/共106頁第五十六頁，共106頁。第二節(jié)第二節(jié) 紫外紫外可見可見(kjin)(kjin)分分光光度計光光度計第56頁/共106頁第五十七頁，共106頁。儀器儀器(yq)(yq)第57頁/共106頁第五十八頁，共106頁。第58頁/共106頁第五十九頁，共106頁。光源光源(gungyun)單色器單色器樣品樣品(yngpn)室室檢測器檢測器顯示顯示1. 1. 光源光源 在整個紫外光區(qū)或可見光譜區(qū)可以發(fā)射連續(xù)光譜，具有足夠的輻射強度、較好的穩(wěn)定性、較長的使用壽命。在整個紫外光區(qū)或可見光譜區(qū)可以發(fā)射連續(xù)光譜，具有足夠的輻射強度、較好的穩(wěn)定性、較長的使用壽命。 可見光區(qū)：鎢燈作為光源

16、，其輻射波長范圍在可見光區(qū)：鎢燈作為光源，其輻射波長范圍在3203202500 2500 nmnm。 紫外區(qū)：氫、氘燈。發(fā)射紫外區(qū)：氫、氘燈。發(fā)射185185400 400 nmnm的連續(xù)光譜。的連續(xù)光譜。（動畫動畫）第59頁/共106頁第六十頁，共106頁。 將光源發(fā)射的復合光分解成單色光并可從中選出一任 波長單色光的光學系統(tǒng)。 入射狹縫：光源的光由此進入單色器； 準光裝置：透鏡(tujng)或返射鏡使入射光成為平行光束； 色散元件：將復合光分解成單色光；棱鏡或光柵；聚焦裝置：透鏡或凹面反射鏡，將分光聚焦裝置：透鏡或凹面反射鏡，將分光(fn un)(fn un)后所得單色光聚焦至出射狹縫；后

17、所得單色光聚焦至出射狹縫；出射狹縫。出射狹縫。第60頁/共106頁第六十一頁，共106頁。 樣品室放置各種類型的吸收池（比色皿）和相應的池架附件。吸收池主要有石英池和玻璃池兩種。在紫外區(qū)須采用石英池，可見區(qū)一般用玻璃池。4. 檢測器 利用光電效應(un din xio yng)將透過吸收池的光信號變成可測的電信號，常用的有光電池、光電管或光電倍增管。5. 5. 結果顯示記錄系統(tǒng)結果顯示記錄系統(tǒng) 檢流計、數(shù)字顯示、微檢流計、數(shù)字顯示、微機進行儀器機進行儀器(yq)(yq)自動控制自動控制和結果處理。和結果處理。第61頁/共106頁第六十二頁，共106頁。1.1.單光束：簡單，價廉，適于在給定波長

18、單光束：簡單，價廉，適于在給定波長處測量吸光度或透光度，一般不能作全波處測量吸光度或透光度，一般不能作全波段光譜掃描，要求光源和檢測器具有很高段光譜掃描，要求光源和檢測器具有很高的穩(wěn)定性。的穩(wěn)定性。2.2.雙光束：自動記錄，快速全波段掃描。雙光束：自動記錄，快速全波段掃描。可消除光源不穩(wěn)定、檢測器靈敏度變化等可消除光源不穩(wěn)定、檢測器靈敏度變化等因素的影響因素的影響(yngxing)(yngxing)，特別適合于結構，特別適合于結構分析。儀器復雜，價格較高。分析。儀器復雜，價格較高。第62頁/共106頁第六十三頁，共106頁。第63頁/共106頁第六十四頁，共106頁。第64頁/共106頁第六十

19、五頁，共106頁。第三節(jié)第三節(jié) 顯色顯色(xin s)與測量條件與測量條件的選擇的選擇第65頁/共106頁第六十六頁，共106頁。1.1.選擇顯色反應時，應考慮的因素：選擇顯色反應時，應考慮的因素： 靈敏度高、選擇性高、生成物穩(wěn)定、靈敏度高、選擇性高、生成物穩(wěn)定、顯色劑在測定波長處無明顯吸收顯色劑在測定波長處無明顯吸收(xshu)(xshu)，兩種有色物最大吸收，兩種有色物最大吸收(xshu)(xshu)波長之差：波長之差：“對比度對比度”，要求，要求 60nm 60nm。第66頁/共106頁第六十七頁，共106頁。第67頁/共106頁第六十八頁，共106頁。第68頁/共106頁第六十九頁，共

20、106頁。無機顯色劑：無機顯色劑： 硫氰酸鹽、鉬酸銨、過氧化氫等幾種。硫氰酸鹽、鉬酸銨、過氧化氫等幾種。有機顯色劑：種類繁多有機顯色劑：種類繁多 偶氮類顯色劑：本身是有色物質，生成偶氮類顯色劑：本身是有色物質，生成配合物后，顏色發(fā)生明顯變化；具有性質穩(wěn)配合物后，顏色發(fā)生明顯變化；具有性質穩(wěn)定、顯色反應靈敏度高、選擇性好、對比度定、顯色反應靈敏度高、選擇性好、對比度大等優(yōu)點，應用大等優(yōu)點，應用(yngyng)(yngyng)最廣泛。偶氮胂最廣泛。偶氮胂、PARPAR等。等。 第69頁/共106頁第七十頁，共106頁。第70頁/共106頁第七十一頁，共106頁。1.1.顯色劑用量顯色劑用量 吸光度

21、吸光度A A與顯色劑用量與顯色劑用量CRCR的關系的關系(gun x)(gun x)會會出現(xiàn)如圖所示的幾種情況。選擇曲線變化平坦處。出現(xiàn)如圖所示的幾種情況。選擇曲線變化平坦處。第71頁/共106頁第七十二頁，共106頁。一般盡量采用水相測定一般盡量采用水相測定第72頁/共106頁第七十三頁，共106頁。v1. 1.加入加入(jir)(jir)掩蔽劑：掩蔽劑：v選擇掩蔽劑的原則是：選擇掩蔽劑的原則是：v 掩蔽劑不與待測組分反應；掩蔽劑不與待測組分反應；v 掩蔽劑本身及掩蔽劑與干擾組分掩蔽劑本身及掩蔽劑與干擾組分的反應產物不干擾待測組分的測定。的反應產物不干擾待測組分的測定。 第73頁/共106頁

22、第七十四頁，共106頁。第74頁/共106頁第七十五頁，共106頁。第75頁/共106頁第七十六頁，共106頁。1.1.選擇適當?shù)娜肷洳ㄩL選擇適當?shù)娜肷洳ㄩL 一般應該選擇一般應該選擇maxmax為入射光波長。但如為入射光波長。但如果果maxmax處有共存組分干擾時，則應考慮處有共存組分干擾時，則應考慮(kol)(kol)選擇靈敏度稍低但能避免干擾的入射選擇靈敏度稍低但能避免干擾的入射光波長。光波長。第76頁/共106頁第七十七頁，共106頁。為什么需要使用參比溶液？為什么需要使用參比溶液？ 測得的的吸光度真正反映待測溶液吸光測得的的吸光度真正反映待測溶液吸光強度。強度。參比溶液的選擇一般參比溶

23、液的選擇一般(ybn)(ybn)遵循以下原則：遵循以下原則： 若僅待測組分與顯色劑反應產物在測定若僅待測組分與顯色劑反應產物在測定波長處有吸收，其它所加試劑均無吸收，用波長處有吸收，其它所加試劑均無吸收，用純溶劑（水純溶劑（水) )作參比溶液；作參比溶液； 第77頁/共106頁第七十八頁，共106頁。第78頁/共106頁第七十九頁，共106頁。 不同不同(b tn)(b tn)的透光度讀數(shù)，產生的誤差大小的透光度讀數(shù)，產生的誤差大小不同不同(b tn)(b tn)： lgT=bclgT=bc微分：微分：dlgTdlgT0.434dlnT= - 0.434T-1 dT=b 0.434dlnT=

24、- 0.434T-1 dT=b dcdc兩式相除得：兩式相除得： dc/c= dc/c= （ 0.434 / TlgT 0.434 / TlgT ）dT dT 以有限值表示可得：以有限值表示可得： c/c= c/c=（0.434/TlgT0.434/TlgT）T T 第79頁/共106頁第八十頁，共106頁。第80頁/共106頁第八十一頁，共106頁。設：設：T=1%T=1%，則可繪出溶液濃度相對誤差，則可繪出溶液濃度相對誤差(xin du w ch)c/c(xin du w ch)c/c與其透光度與其透光度T T 的的關系曲線。關系曲線。如圖所示：如圖所示：當：當：T =1%T =1%，T

25、T在在20%20%65%65%之間時，濃度之間時，濃度相對誤差相對誤差(xin du w ch)(xin du w ch)較小，最佳較小，最佳讀數(shù)范圍。讀數(shù)范圍。 第81頁/共106頁第八十二頁，共106頁。6565( (吸光吸光 可求出濃度可求出濃度(nngd)(nngd)相對誤差最小時的相對誤差最小時的透光度透光度TminTmin為：為： Tmin Tmin36.8%, Amin36.8%, Amin0.4340.434第82頁/共106頁第八十三頁，共106頁。1.1.合成新的高靈敏度有機合成新的高靈敏度有機(yuj)(yuj)顯色劑顯色劑2.2.采用分離富集和測定相結合采用分離富集和測

26、定相結合3.3.采用三元采用三元( (多元多元) )配合物顯色體系配合物顯色體系 由一個中心金屬離子與兩種由一個中心金屬離子與兩種( (或兩種以或兩種以上上) )不同配位體形成的配合物，稱為三元不同配位體形成的配合物，稱為三元( (多多元元) )配合物。配合物。 第83頁/共106頁第八十四頁，共106頁。第84頁/共106頁第八十五頁，共106頁。第85頁/共106頁第八十六頁，共106頁。第四節(jié)第四節(jié) 分光分光(fn un)(fn un)光度測定光度測定方法方法第86頁/共106頁第八十七頁，共106頁。1.1.單組分的測定單組分的測定 通常采用通常采用 A-C A-C 標準曲線法定標準曲

27、線法定量測定。量測定。2.2.多組分的同時測定多組分的同時測定 若各組分的吸收曲線互不若各組分的吸收曲線互不重疊重疊(chngdi)(chngdi)，則可在各自，則可在各自最大吸收波長處分別進行測定。最大吸收波長處分別進行測定。這本質上與單組分測定沒有區(qū)這本質上與單組分測定沒有區(qū)別。別。 第87頁/共106頁第八十八頁，共106頁。第88頁/共106頁第八十九頁，共106頁。 普通分光光度法一般只適于測定微量組分，當待測組分含量(hnling)較高時，將產生較大的誤差。需采用示差法。 即提高入射光強度，并采用濃度稍低于待測溶液濃度的標準溶液作參比溶液。第89頁/共106頁第九十頁，共106頁。

28、第90頁/共106頁第九十一頁，共106頁。 x x s =b(cx s =b(cx cs cs ）=bc=bc 測得的吸光度相當于普通法中待測溶液與標準溶液的吸光度之差測得的吸光度相當于普通法中待測溶液與標準溶液的吸光度之差。 示差法測得的吸光度與示差法測得的吸光度與cc呈直線呈直線(zhxin)(zhxin)關系。由標準曲線上查得相應的關系。由標準曲線上查得相應的cc值，則待測溶液濃度值，則待測溶液濃度cx cx ： cx = cs + c cx = cs + c 第91頁/共106頁第九十二頁，共106頁。普通法：普通法： cs cs的的T=10%T=10%；cxcx的的T=5%T=5%

29、示差法：示差法： cs cs 做參比，調做參比，調T=100%T=100%則：則： cx cx的的T=50% T=50% ；標尺；標尺(bioch)(bioch)擴展擴展1010倍倍第92頁/共106頁第九十三頁，共106頁。 不需空白(kngbi)溶液作參比；但需要兩個單色器獲得兩束單色光(1和2)；以參比波長1處的吸光度A1作為參比，來消除干擾。 在分析渾濁或背景吸收較大的復雜試樣時顯示出很大的優(yōu)越性。靈敏度、選擇性、測量精密度等方面都比單波長法有所提高。 第93頁/共106頁第九十四頁，共106頁。第94頁/共106頁第九十五頁，共106頁。 關鍵問題是測量波長關鍵問題是測量波長22和參

30、比波長和參比波長11的選的選擇擇(xunz)(xunz)與組合。與組合。 以兩組分以兩組分x x和和y y的雙波長法測定為例：的雙波長法測定為例： 設：設：x x為待測組分，為待測組分，y y為干擾組分，二者的吸為干擾組分，二者的吸光度差分別為光度差分別為 x x和和y y， 則該體系的總吸光度差則該體系的總吸光度差x+yx+y為：為： x+y = x+y = x + x + y y 如何選擇如何選擇(xunz)(xunz)波長波長1 1 、22有一定的要有一定的要求。求。第95頁/共106頁第九十六頁，共106頁。第96頁/共106頁第九十七頁，共106頁。 選定的波長1和2處干擾組分應具有相同吸光度， 即：Ay = y2 y1 = 0故： x+y = x=(x2x1)bcx 此時：測得的吸光度差只與待測組分x的濃度呈線性