致齲性菌斑提取技術探究進展

1、致精性菌斑提取技術探究進展摘要致頻性菌斑是頻病發(fā)生的始動因子，其形成并生長 于口腔這一特殊的生理環(huán)境中。因此，對其精密而準確的提 取技術是科學研究成功的關鍵。本文就致頻性菌斑的多種提 取技術作一綜述。關鍵詞致鵡性菌斑；提取技術；進展中圖分類號r 781 文獻標志 碼adoi10.3969/j.issn.1673-5749.2012.01.014research progress on the techniques of extracting cariogenic plaqueli jingwen, wang sheng, hu tao.( dept, of conservative den t

2、istry and en dod on tics, west china hospital of stomatology, sichuan university, chengdu 610041, china )abstractjcariogenic plaque is the key factor to the occurance of caries, which forms and develops in oral cavity, a special physiological enviroment. therefore, the precious and accurate techniqu

3、e of extraction is vital for successful research this article sums up the advantages and disadvantages of various techniques of extracting cariogenic plaque.key wordsjcariogenic plaque ; techniques ofextraction ; progress牙菌斑是一種典型的口腔生物膜，是齦病和牙周病的致 病因子?？茖W合理的提取技術能保證牙菌斑完整的生物學形 態(tài),能夠提高研究的真實性、可靠性。菌斑提取技術可分為

4、體內與體外培養(yǎng)提取2大類，本文將對其作一綜述。1體內提取技術 1.1染色刮取|=|采集牙菌斑前，令受檢者2 h以上不進食并除去口內食物殘渣，然后在無菌紗托或紗球吸濕及局部隔濕條件下，用 生理鹽水沖洗采樣部位，進行菌斑染色后用無菌探針刮取牙 齒唇頰面的菌斑樣本，置于還原液內口。這種方法主要應用 于即時評估牙菌斑的形成情況，例如：對人牙菌斑和唾液中 淀粉酶和蔗糖酶的活性測定2、評定各類漱口水的作用效 果、評估口腔衛(wèi)生狀況、藥物等對菌斑中菌群的影響及菌斑 中幽門螺桿菌的測定等。這種提取技術簡單、快速、易行，但易破壞菌斑的自然結構，而且不利于菌斑的動態(tài)觀察，不能研究其演化發(fā)展過 程。12黏附體取樣在清

5、潔處理后的牙面上放置內徑2mm的尼龍線圈，5 d后取下此裝置，收集結構完整的牙菌斑，應用熒光素處理,m2再用熒光顯微鏡對其進行觀察，鏡下可見：由熒光素充滿的 空隙將密集的細菌群體分開，生物膜底層有許多不規(guī)則的、 大小相近的圓形小凹，這是釉質表面的特征性結構。應用共 聚焦激光掃描顯微鏡(confocal laser scanning microscopy , clsm )觀察分析此方法獲得的菌斑可發(fā)現：牙菌斑是成層 樣堆積的，細菌的聚集從融質表面向上擴展形成蘑菇狀，由 液體充滿的通道隔開，布滿整個生物膜全層，通道在生物膜 內類似一個初級循環(huán)系統(tǒng)，對維持細菌自身穩(wěn)定有著重要的 意義3。此方法可以獲

6、取完整的自然菌斑，有利于保持牙菌斑的生物結構，并且能夠靈活掌握實驗時間，可以初步了解菌斑 的形成過程和結構的動態(tài)演變。但其也存在一定的局限性， 由于線圈細小，不易置入和取出，同時其在口腔中的穩(wěn)定性 較差。13夾板取樣將直徑為5 mm,厚度為1.5 mm的模擬釉質(輕磷灰石 片)和玻璃芯片插入丙烯酸夾板中，固定于受試者口腔內， 分別在1、2、3d后取出平板，在平板表面即可獲取自然生 長的菌斑。可用此方法評估自然生長牙菌斑的生命力及形 態(tài)，如探索牙菌斑生物膜中活菌和死菌空間分布4,研究牙 齒修復材料對生物膜的影響等。1.4支架取樣利用人類未萌出的第三磨牙制成長2 mm、寬2 mm、厚1 mm的融質

7、薄片，將其放入超聲池中清潔20 min后，用乙烯氧化物消毒，然后利用紅色牙蠟將其固定于特制的丙烯酸 支架上。制備2個雙邊下頜支架（橫跨第一前磨牙到第一磨 牙的頰側面），每個支架上放置3個薄片。在插入支架前， 去除受試者牙表面的可見菌斑并拋光牙表面。最后，將支架 置入受試者口中，分別于4 h和8 h后取下觀察6。此方法 成功建立了體內菌斑生物膜的生長模型。由于本實驗是應用 未萌出的第三磨牙制取釉質磨片，與夾板取樣中制作釉質磨 片的材料相比更為優(yōu)越，因為其采用的是無牙菌斑附著的天 然駙質，更能反映出細菌在鈾質上初步定植的情況。繼而又有研究者對這一方法進行了改進。研究者改造了口內的丙烯酸支架，在拋光

8、直徑為3 mm.厚度為2 mm的 玻璃薄片后，將其用黏性蠟固定入支架的凹陷區(qū)域，隨后將 支架放入受試者口中48 h。要求受試者在實驗過程，除了日 常刷牙（僅用自來水）時可取下外，其他時間始終佩帶實驗 裝置進行日常飲食。最后，取下覆蓋了菌斑的玻璃薄片，經 熒光染色后在clsm下觀察。改進后的方法與之前相比其優(yōu)越性有以下2點：1 ）裝置m2中特殊的凹陷設計可以使菌斑沿著舌或頰部自然生長，其受 到口腔軟組織剪切力的影響很小；2）裝置中的玻璃薄片與 牙面之間有大約2mm的空隙，這樣的特殊設計可以保證在取下和置換裝置時不會干擾菌斑的重新生長7。此方法可應用于分析不同部位牙菌斑的生長情況，區(qū)分初始菌斑中鏈

9、球和其他細菌8,分析牙菌斑生物膜中細菌的動態(tài)變化9夾板與支架取樣都避免不了需要設計支撐結構，這樣不 僅增加了實驗的繁瑣性與材料的耗費，而且夾板與支架的介 入可能會破壞受試者原本的口腔微環(huán)境，降低了研究結果的 可信度。1.5可摘義齒取樣選擇安裝有局部可摘義齒的志愿者，在其基托的表面選擇同一位置黏貼3片塑料片，分別戴用仁4、24 h后將塑料片完整取下，這樣可獲得完整的原位牙菌斑生物膜10o 這種方法不僅可以獲得結構完整的牙菌斑生物膜，而且 簡便、穩(wěn)定、重復性好，并且受試者幾乎無不適感，是一種 很好的獲取原位、完整牙菌斑生物膜的方法。并且利用這一 方法獲得的原位牙菌斑生物膜，可用于研究膜內部的物質轉

10、 運以及耐藥性。2體外提取技術 2.1細胞培養(yǎng)板24個凹槽樣的聚苯乙烯細胞培養(yǎng)板置于燒結的軽磷灰石盤上，用內氏放線菌、白假絲酵母菌、口腔鏈球菌、表兄鏈 球菌、韋榮球菌、具核梭桿菌作為接種體，在其上培養(yǎng)菌斑生物膜。實驗所用的軽磷灰石盤需要先在加工過的非刺激性 唾液中鍍一層薄膜包衣再浸潤于1.6 ml含有體積分數70% 唾液和30%ph=7.2的胰蛋白月東發(fā)酵肉湯的底物中。取每種 細菌等體積、等濃度的培養(yǎng)液，混合形成懸濁液(200pl ), 注入凹槽中，分別在培養(yǎng)16.5, 20.5、24.5、40.5、44.5、m248.5、64.5 h時，將生物膜連續(xù)3次置于2 ml消毒過的生 理鹽水中沖洗(

11、室溫條件下每次浸潤1 min ),最后用多聚甲 醛固定。然后，將盤上的生物膜取下，在適宜的瓊脂培養(yǎng)基 上培養(yǎng)，以便觀察研究。這種方法成功利用了雜交技術，在 體外培養(yǎng)出含有多種細菌的混合菌斑，并利用革蘭染色區(qū)分 出不同的菌群笛,主要應用于分析菌斑中特定菌群的特點 及相互作用情況，還可用于研究化學物質等對含特定菌群菌 斑的作用，如人粘蛋白7多肽對含有突變鏈球菌的菌斑生物 膜的影響12,蔓越橘中的大分子物質對牙菌斑組成的影響 口3等。2.2改良恒化器研究者將分組的菌液接種于含2.5g-l-1600ml豬胃黏蛋 白的改良bm培養(yǎng)液的恒化器中,用氧化鋁耐水砂紙磨去輕 磷灰石圓片表面20pm ,再經自來水

12、沖洗以及高壓滅菌后備 用。輕磷灰石圓片由耐熱塑料圈和不銹鋼絲固定后置于液面 下11.5 cm處，工作條件為：稀釋率0.05-h-1 ,攪拌速度 為50次min-1 ,混合氣體為80%氮氣、10%氫氣、10%-氧化碳,37°c , ph 值為 7.0±0.114o由于口腔環(huán)境不易控制斑異質多變，生態(tài)環(huán)境復雜,使體內研究存在許多困難，這種方法中應用的改良恒化器能 模擬口腔各項參數，可方便地固定、移動和復位幾十片耗磷 灰石，并可長時間連續(xù)培養(yǎng)及維持細菌生長的對數期，同時 可控制接種細菌的種類、數量和次序15o因此，可利用改 良恒化器研究菌斑生物膜及懸浮液的結構組成、細菌代謝和 相

13、互關系，檢測抗菌藥物的作用效果16等。2.3恒定深度薄膜發(fā)酵槽恒定深度薄膜發(fā)酵槽(constant-depth film fermenter , cdff )可以產生穩(wěn)定狀態(tài)的口腔生物膜,這種生物膜比在 恒化器系統(tǒng)中產生的生物膜更具有代表性，其控制條件更接 近口腔真實微環(huán)境。cdff的基本裝置是一個帶有凹陷腔洞bid的轉盤，可將輕磷灰石放入腔洞中，多余的生物膜和液體基 質可被裝置中的刀片除去，從而使生物膜保持在一定深度 中。研究者將支持生物膜的輕磷灰石盤置于深200pm的腔 洞之中，培養(yǎng)物通過0.2pm的過濾器與大氣相通，從而成功 獲取實驗所需的菌斑生物膜17o此方法還被應用于研究與 疾病相關

14、的微生物菌群模型的改變18,不同營養(yǎng)條件下牙 菌斑結構的變化19,牙菌斑光學治療中潛在的光敏材料20,抗生素對菌斑的影響及抗菌譜21等。3結束語牙菌斑口內提取技術有利于觀察斑的自然形態(tài)，研究 其內部的多種細菌組成及相互作用關系，但是受多種客觀因 素的影響，實驗條件多變，不易控制，同時取出后的菌斑不 易長時間暴露于體外環(huán)境，以免干擾其自然形態(tài)，于是不利 于長期的動態(tài)觀察與研究。除此，一些藥物及不良刺激的研 究會對人體造成一定傷害。體外培養(yǎng)方法成功克服了這些弊 端，使得以往在口腔內無法進行的實驗可以進行，實驗者可 以靈活模擬各種所需的實驗條件，最大程度的減少客觀因素 的干擾，如個體口腔衛(wèi)生、食物、

15、疾病等，從而保證菌斑在 恒定的條件中生長。此外，還可以選擇性的培養(yǎng)菌斑中的微 生物。但是，由于口腔環(huán)境是復雜多變的，人為控制的體外 提取技術不能真實再現口腔環(huán)境，除此，牙菌斑內有細菌種 類約200-400種，僅有1%10%是可培養(yǎng)的，僅幾種細菌 的組合是無論如何也代表不了這樣一個微生態(tài)牙菌斑環(huán)境 的1。所以，體外提取技術培養(yǎng)的菌斑與自然菌斑存在著差 異，其實驗價值也存在一定的局限性。隨著實驗技術的不斷提高，菌斑提取技術可嘗試將口內提取與口外培養(yǎng)合理結合，保證菌斑自然形態(tài)的同時，在模 擬體內的體外培養(yǎng)環(huán)境中動態(tài)觀察菌斑生物學特征，進行定 性及定量研究分析?？谇蛔匀谎谰叩墨@取還可以與臨床治 療方

16、法相結合，如正畸治療中使用的托槽、分牙環(huán)、矯治器 上均可以用來培養(yǎng)菌斑，而且這樣獲取的菌斑與口腔內自然形成的菌斑非常類似，受客觀因素的影響很小。除此之外, 菌斑還可以形成于口腔修復醫(yī)學中所使用的烤瓷牙冠的表 面，從而獲取不同牙面的自然菌斑，擴展自然菌斑的研究方 向。4參考文獻口王萍,李曉智，唐明氟對正畸兒童牙面菌斑變形鏈球甘 的影響j.中國微生態(tài)學雜,2004, 16 ( 1 ): 31,33.2周學東，岳松齡人牙菌斑和唾液中淀粉酶、蔗糖酶活性 測定j牙體牙髓牙周病學雜志,1992, 2 ( 3 ): 129-131.3 netuschil l, reich e, unteregger g,

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