Illumina平臺測序原理及常見測序文庫構(gòu)建-文檔資料

1、Illumina 平臺測序原理及常見幾平臺測序原理及常見幾 種測序文庫構(gòu)建流程簡介種測序文庫構(gòu)建流程簡介1目目錄錄2第一部分：測序測序原理與流第一部分：測序測序原理與流程程 簡介簡介3文庫構(gòu)建文庫構(gòu)建( 6 hrs)cBot HiSeq2500 MiSeqHiSeq2000 HiSeq2500 GA IIxMiSeqHCS/RTA ICS MSRCASAVABaseSpace1-8 samples1-8 samplesDNA4Illumina 測序流程測序流程文庫構(gòu)建文庫構(gòu)建( 6 hrs)cBotHiSeq25001-8 samplesMiSeqHiSeq2000 HiSeq25001-8

2、samplesGA IIxMiSeqHCS/RTA ICS MSRCASAVABaseSpaceDNA5文庫構(gòu)建流程文庫構(gòu)建流程片段片段化化 DNA末端補末端補平平3加加A接頭連接頭連接接PCR6高質(zhì)量DNA文庫結(jié)構(gòu)文庫構(gòu)建的目的是在目的DNA片段兩端都連接上想要 的接頭此單鏈部分與FlowCell表面上P7接頭相同此單鏈部分與FlowCell表面上P5接頭相同Index Sequencing Primer7文庫構(gòu)建文庫構(gòu)建( 6 hrs)cBot HiSeq2500 MiSeq1-8 samplesHiSeq2000HiSeq25001-8 samplesGA IIxMiSeqHCS/RTA

3、 ICS MSRCASAVABaseSpace8測序芯片 (Flow Cell)簡介flow cell是有2個或8個泳道(Lane)的 玻璃片，與一元硬幣的厚度相當每個泳道(Lane)內(nèi)的上下兩個表面 隨機的布滿了能夠與文庫兩端接頭 分別互補配對的寡核苷酸(oligos,P7 和P5接頭)在flow cell上進行cluster簇生成9儀器簡介儀器簡介單條單條DNA 模板模板約約1000條條DNA模板的模板的 拷貝拷貝cBotHiSeq Sequen ncceerr35個循環(huán)的橋式PCR10cBot 工作流程DNA文庫變性：使用NaOH將雙鏈DNA文庫變性為單鏈模板鏈雜交：將單鏈DNA模板雜交

4、到Flow Cell 上 第一鏈合成：以Flow Cell 表面上的oligos為引物，合成第一鏈橋式PCR：沖走單鏈DNA模板，以合成的第一鏈 為模板進行35循環(huán)的橋式PCR線性化：將與P5接頭連接的DNA鏈從Flow Cell 上去除阻斷3OH：防止在后續(xù)測序過程中繼續(xù)延伸DNA鏈雜交測序引物11DNA模板雜交和一鏈合成接頭序接頭序列列5-3 延延伸伸含有P7和P5兩種接頭 的FlowCell表面單鏈DNA分子與FlowCell 表面的對應(yīng)接頭雜交以雜交的單鏈DNA為模板， FlowCell上的接頭為引物， 合成第一鏈12新合成的鏈原始模板鏈雙鏈DNA變性丟棄原始模板鏈丟棄原始模板鏈模板鏈

5、被沖洗走新合成的鏈留在FlowCell 上13橋式PCR擴增單鏈DNA與FlowCell表面對應(yīng)接頭雜 交，形成“橋”以接頭為引物進行擴增14橋式PCR擴增15變性變性雙鏈的“橋”得到與FlowCell相連的兩條互補 的單鏈DNA分子16第二輪橋式PCR擴增17完成橋式PCR擴增完成28循環(huán)的橋式PCR18線性化雙鏈“橋”變性為單鏈紅色箭頭為P5接頭上的 切割位點19線性化切割并沖走與P5接頭相連的那 條DNA鏈20阻斷阻斷3 OH21雜交Read 1 引物Read1 測序引 物將測序引物雜交到文庫的接頭上22Illumina 測序流程測序流程HiSeq2000 HiSeq2500 GA II

6、xMiSeqHCS/RTAICS MSRCASAVABaseSpace文庫構(gòu)建文庫構(gòu)建( 6 hrs)cBot HiSeq25001-8 samplesMiSeq1-8 samples23進行Read1 測序雜交Index 測序引物，進行Index 測序 Paired End Turnround，合成Read1互補鏈 雜交Read 2 測序引物，進行Read 2 測序HiSeq SBS 測序流程24HiSeq SBS 測序流程123Paired End Turnaround25Sequencing By Synthesis，SBS測序原理4種種 Fl-NTPs +聚合酶聚合酶拍照，收集信號拍照

7、，收集信號去阻斷，切除熒光基去阻斷，切除熒光基團團X 36 - 15126可逆終止化學反應(yīng)一次加入4種修飾的dNTP(可逆終止子)準確度高可以得到同聚物序列 合成 照相，收集信號 去阻斷，切除熒 光基團下一個堿基合成27100 MicronsClusters28已完成測序合成的片段Blocked 3-ends變性掉已完成測序合成的 片段恢復被阻斷的3 OHPaired End Turnround29形成形成的的 橋橋5-3延延伸伸橋式PCR5-3延伸Paired End Turnround30形成的形成的雙雙 鏈的鏈的橋橋Paired End Turnround31模板模板鏈鏈Paired E

8、nd Turnround等溫變性，完成15輪橋式 PCR后，進行線性化，將模 板鏈切除，保留新合成的子 鏈32新合成新合成的的 鏈鏈3 -OH阻阻斷斷Read2測序測序引引 物物Paired End Turnround線性化，3 -OH阻斷雜交Read2測序引物33Sequencing By Synthesis 2nd ReadX 36 - 1514種種 Fl-NTPs + 聚聚 合酶合酶拍照，收集信號拍照，收集信號去阻斷，切除熒光基去阻斷，切除熒光基團團34Illumina 測序流程測序流程HCS/RTA ICS MSRCASAVABaseSpace文庫構(gòu)建文庫構(gòu)建( 6 hrs)cBot

9、HiSeq25001-8 samplesMiSeqHiSeq2000 HiSeq25001-8 samplesGA IIxMiSeq35第二部分：常見文庫構(gòu)建流程第二部分：常見文庫構(gòu)建流程簡簡 介介36文庫分類DNA類文庫類文庫 DNA小片段文庫 DNA大片段文庫 Exon文庫 PCR-Free文庫簡化基因組文庫、單細胞樣本 文庫等RNA類文庫類文庫 轉(zhuǎn)錄組文庫 表達譜（RNA-Seq） Small RNA37DNA小片段文庫小片段文庫 DNA小片段文庫 片段大小在1Kb以下的普通DNA文庫（200bp,350bp,500bp） DNA小片段文庫可用來進行人重測序，動植物、人重測序，動植物、

10、微生物的微生物的de novo和重測序，和重測序，16s rRNA測序，測序， 宏基因組測序宏基因組測序等項目類型的文庫構(gòu)建。38DNA小片段建庫流程39DNA小片段建庫流程40DNA小片段建庫流程41DNA小片段建庫流程42DNA大片段文庫大片段文庫 DNA大片段文庫，又名末端配對（mate-paired） 文庫 片段長度大于1K bp。 主要用于動植物，微生物的動植物，微生物的de novo 測序測序43DNA大片段文庫建庫流程44DNA大片段文庫建庫流程45為什么要建大片段文為什么要建大片段文庫庫46Exon文庫人類外顯子組總共約30Mb，占全 部人類基因組約1%。外顯子具有高度的保守型

11、，且大部 分疾病的致病位點位于外顯子區(qū)。外顯子測序是指利用序列捕獲技術(shù) 將外顯子區(qū)域DNA捕捉并富集后進行高通量測序的基因組分析方法。Exon文庫主要用于人全外顯子人全外顯子測測 序序和目標區(qū)域測序目標區(qū)域測序47Exon文庫流程48外顯子捕獲方式 液相雜液相雜交交 液相雜交是通過在溶液中， 利用鏈堿基配對的原理， 將DNA片段與探針雜交， 然后洗脫，富集目的片段。49Exon測序特測序特點點 優(yōu)點：1、 與全基因組測序相比，外 顯子測序具有測序覆蓋度更深、 數(shù)據(jù)準確性更高、花費成本更 低等優(yōu)勢，對研究已知基因的SNP、Indel等具有較大的優(yōu)勢。 不足：1、與全基因組測序相比，不能 檢測到基

12、因組內(nèi)較大的結(jié)構(gòu)性 變異。2、與轉(zhuǎn)錄組測序相比，不能檢 測到新的基因。50PCR-Free文庫文庫 PCR-Free文庫，顧名思義，就是在文庫構(gòu)建過 程中不需要進行PCR的文庫。 主要是針對一些特殊樣本，比如GC含量高，PCR擴增困難的樣本；PCR產(chǎn)物。 不足： 所需的樣本起始量較多。51PCR-Free文庫與普通文庫比較52簡化基因組簡化基因組(RAD-seq )文庫文庫 RAD-seq 即基于酶切的簡化基因組測序技術(shù)，是指利用 限制性內(nèi)切酶對基因組進行酶切，結(jié)合一定大小的插入片 段文庫，對其進行高通量測序，快速鑒定高準確性的變異 標記（SNPs）信息的技術(shù) 與傳統(tǒng)技術(shù)相比，該類技術(shù)操作簡單

13、、不受參考基因組限 制、可簡化復雜基因組；另外，基于SNPs 的分子標記技 術(shù)性價比高，穩(wěn)定性好，在基因組中分布更加廣泛，特別 是適合大樣本量的分析。53簡化基因組文庫建庫流簡化基因組文庫建庫流程程54轉(zhuǎn)錄組文轉(zhuǎn)錄組文庫庫真核生真核生物物原核生原核生物物總總RNA利用利用Oligo (dT)富富 集集mRNA去去除除 rRNA隨機引物六聚體反隨機引物六聚體反轉(zhuǎn)轉(zhuǎn) 錄合成錄合成cDNA末端修復，加末端修復，加A，加加 接頭后接頭后PCR擴擴增增Illumina 測測序序?qū)RNA 隨機打斷隨機打斷成成200 nt轉(zhuǎn)錄組測序的研究對 象為特定細胞在某一 功能狀態(tài)下所能轉(zhuǎn)錄 出來的所有mRNA。應(yīng)

14、用：轉(zhuǎn)錄本的種類和基因 定量基因的轉(zhuǎn)錄結(jié)構(gòu)可變剪切發(fā)現(xiàn)新的轉(zhuǎn)錄本55鏈特異性轉(zhuǎn)錄組建鏈特異性轉(zhuǎn)錄組建庫庫 使用ssRNA-seq可以確定轉(zhuǎn)錄本是來自正鏈還是負鏈。以 便更加準確的獲得基因的結(jié)構(gòu)以及基因表達信息，并且發(fā) 現(xiàn)新的基因。 很多基因組區(qū)域具有正負鏈的轉(zhuǎn)錄本，反義轉(zhuǎn)錄是真核基 因的一個特征，是一種重要的調(diào)控方式。56常規(guī)轉(zhuǎn)錄組建庫方法基礎(chǔ)上，在合成第二條cDNA鏈時，替換dTTP 為dUTP，加上接頭后降 解含dU的DNA單鏈。鏈特異性轉(zhuǎn)錄組建鏈特異性轉(zhuǎn)錄組建庫庫57均均一化一化（DSN）建庫建庫方法：方法：構(gòu)建常規(guī)轉(zhuǎn)錄組文庫，庫檢合格后取80-100ng文庫進行DSN處 理，然后PCR

15、再次出庫。目的：目的：減低高豐度表達基因，有效富集低豐度表達基因。DSN酶酶：雙鏈特異性核酸酶(Duplex-Specific Nuclease, DSN)，能夠選 擇性降解雙鏈DNA和DNA-RNA雜交體中的DNA,由于高豐度的基因形 成雙鏈的速度較快，所以降解也比較多。58RNA-Seq 是用來研究某一生 物對象在特定生物 過程中基因表達差 異的技術(shù)，具有定 量準、可重復性高、檢測范圍寬、成 本低等特點。真核生真核生物物原核生原核生物物總總RNA利用利用Oligo (dT)富富集集 mRNA去去除除 rRNA隨機引物六聚體反轉(zhuǎn)錄隨機引物六聚體反轉(zhuǎn)錄合合 成成cDNA末端修復，加末端修復，加A，加接頭加接頭后后PCR擴擴增增Illumina 測測序序?qū)RNA 隨機打斷隨機打斷成成200 nt59RNA-Seq 與常規(guī)轉(zhuǎn)錄組區(qū)別與常規(guī)轉(zhuǎn)錄組區(qū)別RNA-Se