05動(dòng)物胚胎移植技術(shù)及體外受精

1、 第五章動(dòng)物胚胎工程技術(shù)及體外受精 現(xiàn)代生物技術(shù)家畜育種領(lǐng)域繁殖生物技術(shù)分子生物技術(shù)人工授精技術(shù)胚胎工程技術(shù) 超數(shù)排卵和胚胎移植胚胎性別鑒定體外受精胚胎分割克隆技術(shù)試管嬰兒o體外受精聯(lián)合胚胎移植技術(shù)（ivf）o1978年英國(guó)專家steptoe和edowrds定制了世界上第一個(gè)試管嬰兒o1978年7月25日世界第一例試管嬰兒louis brown在英國(guó)誕生。ivf的最早階段妊娠成功率只有2.94。o大陸首例試管嬰兒鄭萌珠于1988年3月10日上午8點(diǎn)56分在北京醫(yī)科大學(xué)第三醫(yī)院誕生 第一節(jié) 胚胎工程技術(shù)o胚胎移植o胚胎融合o胚胎分割o胚胎的冷凍保存o早期胚胎培養(yǎng)o胚細(xì)胞核移植受精過(guò)程 分解放射冠

2、的卵泡細(xì)胞 水解局部透明帶 精子細(xì)胞核和部分胞質(zhì)進(jìn)入卵母細(xì)胞卵裂及胚泡形成（第一周）卵裂(cleavage)受精卵由輸卵管向子宮方向運(yùn)行，并不斷進(jìn)行細(xì)胞分裂，受精卵早期的細(xì)胞分裂稱卵裂；卵裂產(chǎn)生的子細(xì)胞呈球形，稱卵裂球（blastomere）桑椹胚（morula）受精后第3天，形成了1216個(gè)卵裂球組成的實(shí)心胚，形似桑椹，稱桑椹胚胚泡形成 受精后第46天桑椹胚細(xì)胞繼續(xù)分裂，細(xì)胞間開(kāi)始出現(xiàn)小腔隙，并逐漸匯合成一個(gè)大腔，桑椹胚轉(zhuǎn)變?yōu)橹锌盏呐轄?，稱胚泡（blastocyst），胚泡由三部分組成： 胚泡滋養(yǎng)層胚泡腔內(nèi)細(xì)胞群極端滋養(yǎng)層一、胚胎移植o受精卵移植n把一頭雌性動(dòng)物的早期胚胎從輸卵管或子宮中沖洗

3、出來(lái)，移植到另一頭雌性動(dòng)物的輸卵管或子宮內(nèi)，使之繼續(xù)發(fā)育成新個(gè)體的技術(shù)o供體n提供胚胎的動(dòng)物o受體n接受和孕育胚胎的動(dòng)物o初始階段n1890-1900 w.heape將安哥拉兔和荷蘭兔的受精卵分別移植到比利時(shí)兔的輸卵管內(nèi)，分別獲得仔兔2只n1900-1950 主要由英美科學(xué)家在家兔、綿羊、山羊小家畜方面研究，成功率35%左右o發(fā)展階段n1950-1970 日本首次在牛胚胎移植上成功，之后日、美采用非手術(shù)法移植成功，胚胎移植成功率達(dá)70-80%胚胎移植的歷史胚胎移植的歷史o實(shí)用化初始階段n 1970-1980 加美開(kāi)始成立牛胚胎移植公司，1973年牛凍胚移植成功（英）o實(shí)用化研究階段n 1982

4、- 大規(guī)模胚胎移植、核移植、嵌合體、胚胎分割、性別鑒定、體外受精在英美日德廣泛開(kāi)展，克隆羊誕生胚胎移植的歷史胚胎移植的歷史1.胚胎移植的生理學(xué)基礎(chǔ)o成年母畜卵巢上存在數(shù)千到上萬(wàn)個(gè)卵泡，在外源激素作用下，每個(gè)發(fā)情期的卵泡發(fā)育和排卵數(shù)可達(dá)數(shù)十個(gè)o每個(gè)發(fā)情周期生殖器官都有一個(gè)孕向發(fā)育o早期胚胎處于游離狀態(tài)o胚胎發(fā)育不存在免疫問(wèn)題o胚胎發(fā)育到一定階段會(huì)與子宮發(fā)生生理和組織聯(lián)系o胚胎的遺傳性不受受體的影響2. 胚胎移植的基本原則o胚胎移植前后所處的環(huán)境的同一性n供體和受體在分類學(xué)上的相同屬性n動(dòng)物生理上的一致性：受體和供體在發(fā)情時(shí)間上的同期性n動(dòng)物解剖位置上的一致性：空間環(huán)境的一致性o胚胎的發(fā)育期限：必

5、須處于周期黃體期內(nèi)o胚胎的質(zhì)量：胚胎必須是正常的，并在處理過(guò)程中不受不良因素的影響3、胚胎移植o供受體的選擇與管理o供體的超數(shù)排卵處理和配種o受體的同期發(fā)情處理o胚胎回收o胚胎檢查o胚胎移植1）供受體的選擇與管理o供體的選擇n遺傳價(jià)值：生產(chǎn)性能優(yōu)秀的母畜n健康狀況:身體健康，營(yíng)養(yǎng)水平中等以上的未孕動(dòng)物n繁殖性能：達(dá)到配種年齡以上繁殖機(jī)能正常的母畜o受體的選擇n身體健康，身體狀況中上的適繁未孕個(gè)體，無(wú)生殖道疾病和難產(chǎn)病史n繁殖狀況正常，有正常的發(fā)情周期n母性良好：泌乳性能、護(hù)仔性能o供、受體的管理n防疫、記錄n飼養(yǎng)管理等 2）同期發(fā)情（synchronization of eatrus）o采用激

6、素或類激素的藥物處理，使這一群母畜在特定時(shí)間內(nèi)集中發(fā)情和排卵o即將母畜的黃體期延長(zhǎng)或縮短，使母畜擺脫內(nèi)、外孕激素對(duì)卵巢的控制，在同一時(shí)間內(nèi)引起全部母畜的卵泡發(fā)育，從而達(dá)到同期發(fā)情的目的o延長(zhǎng)黃體期：孕激素 控制卵泡的生長(zhǎng)發(fā)育和發(fā)情表現(xiàn)o縮短黃體期：前列腺素 加速黃體退化，使卵巢提前擺脫體內(nèi)孕激素的控制o促進(jìn)卵泡發(fā)育、排卵：促性腺激素 3）超數(shù)排卵o超排：以各種外源性促性腺激素誘發(fā)動(dòng)物卵巢的許多卵泡發(fā)育并排出具有受精能力的卵子o孕母馬促性腺激素、促卵泡素、前列腺素、促排卵類藥物、孕激素o超數(shù)排卵處理的時(shí)期應(yīng)選擇在發(fā)情周期的后期，即黃體消退時(shí)期o個(gè)體對(duì)超排處理的反應(yīng)效果難以預(yù)測(cè)o產(chǎn)生不良的后果：胚

7、胎死亡o卵母細(xì)胞蛋白質(zhì)合成過(guò)程發(fā)生改變o生殖道機(jī)能產(chǎn)生影響4）胚胎回收o利用沖胚液從供體的生殖道中沖洗出來(lái)，提供移植或其它胚胎工程用o手術(shù)法o非手術(shù)法胚胎質(zhì)量評(píng)價(jià)：o透明帶的形態(tài)和完整性o胚胎的發(fā)育與胚齡是否一致o胚胎的形態(tài)與勻稱性，胚內(nèi)細(xì)胞大小的變化o細(xì)胞質(zhì)的結(jié)構(gòu)及顏色，胚內(nèi)是否出現(xiàn)空泡，細(xì)胞碎片，有無(wú)游離細(xì)胞o如a級(jí)： 為優(yōu)良胚胎，形態(tài)典型，卵裂球輪廓清晰，緊密充實(shí)，大小均一，細(xì)胞質(zhì)致密，色調(diào)和分布均一6）胚胎的保存o胚胎的降溫：使胚胎停止發(fā)育，延長(zhǎng)其體外生存時(shí)間o體外培養(yǎng)：將胚胎置于體溫條件下，在培養(yǎng)液中，使其繼續(xù)發(fā)育o胚胎冷凍：通過(guò)一定的處理程序，將胚胎降溫冷凍后，保存于液氮中胚胎冷凍

8、的原理o胚胎冷凍實(shí)際是脫水的過(guò)程，冷凍保存的關(guān)鍵是設(shè)法減少細(xì)胞內(nèi)冰晶對(duì)胚胎的損傷o冷凍過(guò)程中，水分形成冰晶造成細(xì)胞機(jī)械損傷，同時(shí)，導(dǎo)致未結(jié)冰的細(xì)胞內(nèi)溶液滲透壓急劇升高，造成蛋白質(zhì)變性，導(dǎo)致死胎o常規(guī)慢速冷凍法、玻璃化冷凍保持o受精卵移植o一般供體為良種或優(yōu)良個(gè)體，而受體為生產(chǎn)性能較差的個(gè)體或品種。o“借劣質(zhì)動(dòng)物之腹懷優(yōu)秀個(gè)體之胎”7）胚胎移植選擇供體母牛受體母牛同期發(fā)情處理超數(shù)排卵供體公牛配種沖卵質(zhì)量檢查、培養(yǎng)胚胎移植妊娠檢查分娩（胚胎移植的犢牛）胚胎移植的基本程序 8)胚胎移植的應(yīng)用范圍o在家畜改良方面的應(yīng)用o在特定品種擴(kuò)繁上的應(yīng)用o在動(dòng)物生物多樣性上的應(yīng)用o其它方面應(yīng)用：轉(zhuǎn)基因動(dòng)物、性別控

9、制、體外受精在家畜改良方面的應(yīng)用o人工授精技術(shù)可成幾十到幾百倍地提高了優(yōu)秀種公畜的配種效能，但對(duì)優(yōu)秀母畜來(lái)說(shuō)，受其產(chǎn)仔數(shù)和世代間隔的限制，尤其是牛羊等繁殖力較低的畜種更是如此o通過(guò)超數(shù)排卵和胚胎移植技術(shù)（multiple ovulation and embryo transfer: moet)牛羊的生長(zhǎng)性狀年遺傳進(jìn)展可比正常繁殖提高80%和70%；產(chǎn)奶性狀提高33%在特定品種擴(kuò)繁上的應(yīng)用o牛羊等低繁殖力家畜，從引進(jìn)到形成一個(gè)純種群體需要7-8個(gè)世代，15-20年，而采用meot法，一次就可獲得一個(gè)純種群體o80年代初，美、澳、新從歐洲引進(jìn)的大型肉牛品種均采用胚胎移植技術(shù)擴(kuò)繁o2000年前后，我

10、國(guó)的波爾山羊也是采用胚胎移植進(jìn)行擴(kuò)繁的在動(dòng)物生物多樣性上的應(yīng)用o在保護(hù)動(dòng)物遺傳資源，提高家畜生產(chǎn)性能，挽救瀕臨滅絕的野生動(dòng)物方面，胚胎移植技術(shù)越來(lái)越發(fā)揮出重要作用o冷凍能夠很好地保存瀕臨滅絕動(dòng)物的胚胎或生殖細(xì)胞，但該種動(dòng)物雌性個(gè)體的減少，也是這種動(dòng)物的胚胎或生殖細(xì)胞無(wú)法得到移植，科學(xué)家開(kāi)始研究在該種動(dòng)物的亞種或親緣種中試驗(yàn)，并取得一些成功，如斑馬胚胎移植給馬，蒙古馬胚胎移植給驢，白肢野牛移植給荷斯坦牛其它方面應(yīng)用o胚胎移植是克隆技術(shù)的必須過(guò)程o體外受精必須借助胚胎移植實(shí)現(xiàn)“試管嬰兒的繼續(xù)發(fā)育”o轉(zhuǎn)基因及動(dòng)物生物反應(yīng)器的研究也必須借助胚胎移植二、胚胎分割技術(shù)1）概念 采用顯微手術(shù)（機(jī)械方法）的方

11、法將早期胚胎分割成2分胚，4分胚或8分胚，經(jīng)體內(nèi)或體外培養(yǎng)后植入受體，以得到同卵雙胎或同卵多胎的技術(shù) 胚胎分割以增加優(yōu)秀遺傳性狀的動(dòng)物數(shù)量為主要目的，可提高胚胎移植技術(shù)的效率和效益選擇良好的桑椹胚或囊胚移入培養(yǎng)皿中，用分割針或分割刀片將其切開(kāi)，吸出其中的半個(gè)胚胎注入透明帶中或直接移植給受體2)基本過(guò)程：3）胚胎分割的理論依據(jù)o大多數(shù)哺乳動(dòng)物早期胚胎屬調(diào)整發(fā)育類型，去掉早期胚胎的一半，剩余的部分仍發(fā)育成完整的胚胎，至少在8細(xì)胞前，每個(gè)分裂球都有相同的發(fā)育能力o到晚桑椹胚時(shí)，胚胎發(fā)生初步分化，這時(shí)進(jìn)行胚胎分割，可以重新發(fā)育到囊胚4）特點(diǎn): 后代具有相同的遺傳物質(zhì) 胚胎克隆5）使用的主要儀器： 實(shí)體

12、顯微鏡和顯微操作儀6）應(yīng)用: 為轉(zhuǎn)基因技術(shù)、性別控制技術(shù)提供活胚材料注意：對(duì)囊胚階段的胚胎進(jìn)行分割時(shí)，要將內(nèi)細(xì)胞團(tuán)均等分割原因：內(nèi)細(xì)胞團(tuán)一般到囊胚階段才出現(xiàn)，它是發(fā)育為胚胎本身的基礎(chǔ)細(xì)胞，其他細(xì)胞為滋養(yǎng)細(xì)胞，只為胚胎和胎兒發(fā)育提供營(yíng)養(yǎng)。若分割時(shí)不能將內(nèi)細(xì)胞團(tuán)均等分割，會(huì)出現(xiàn)含內(nèi)細(xì)胞團(tuán)多的部分正常發(fā)育的能力強(qiáng)，少的部分發(fā)育受阻或發(fā)育不良，甚至不能發(fā)育等問(wèn)題胚胎分割技術(shù)也是動(dòng)物克隆的方法之一 胚胎分割的份數(shù)越多，操作的難度會(huì)越大，移植的成功率也越低 早期胚胎的體積很小，只有在顯微鏡下才能看到 細(xì)胞數(shù)目是有限的：分割的份數(shù)越多，不但難以做到均等分割，每一份的細(xì)胞數(shù)會(huì)越少，作為囊胚期的胚胎內(nèi)細(xì)胞團(tuán)細(xì)胞

13、所受的影響會(huì)更大 分割的份數(shù)越多，技術(shù)的難度會(huì)越大，移植后的恢復(fù)和發(fā)育的難度會(huì)越大，移植成功率自然會(huì)降低透明帶對(duì)于分割胚體內(nèi)外發(fā)育的影響o透明帶作用：阻止異種動(dòng)物精子受精和同種動(dòng)物的多精子受精，保護(hù)受精卵在輸卵管和子宮內(nèi)正常運(yùn)行，防止輸卵管和子宮液的傷害及白細(xì)胞的吞噬，并使分裂階段的卵裂球相互靠近，不致分離o胚胎分割時(shí)所處的發(fā)育階段，對(duì)透明帶的依賴性越強(qiáng)冷凍胚胎的影響o分割過(guò)程引起的透明帶損傷和胚胎細(xì)胞數(shù)量減少，經(jīng)冷凍和解凍在體內(nèi)和體外的發(fā)育能力進(jìn)一步降低，其移植妊娠率低于完整的冷凍胚胎三、胚胎嵌合體o由兩個(gè)或兩個(gè)以上具有不同遺傳性狀的細(xì)胞或細(xì)胞系組成的聚合胚發(fā)育而成的個(gè)體o原發(fā)性嵌合體o次生

14、型嵌合體1、方法o囊胚注入法n在動(dòng)物胚胎發(fā)育到囊胚時(shí)，將目的細(xì)胞或細(xì)胞團(tuán)注入囊胚腔，使之與內(nèi)細(xì)胞團(tuán)結(jié)合并發(fā)育，最終得到嵌合體個(gè)體o聚合法n全胚聚合法p將發(fā)育到一定時(shí)期的胚胎，去掉透明帶后，將兩個(gè)或兩個(gè)以上的胚胎聚合在一起，形成一個(gè)胚胎后放入二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至囊胚，再植入受體動(dòng)物體子宮內(nèi)n卵裂球聚合法p去掉透明帶后將胚胎打散，從雙方胚胎卵裂球中各取出一部分細(xì)胞進(jìn)行聚合，培養(yǎng)后移植2、影響因素o胚胎的質(zhì)量與狀態(tài)na級(jí)和b級(jí)胚胎o胚胎的發(fā)育時(shí)期n多采用8細(xì)胞早期胚胎聚合 四、胚胎細(xì)胞核移植將未著床的早期胚胎分散成單個(gè)的細(xì)胞，用電融合方法，使單個(gè)細(xì)胞與去除細(xì)胞核的未受精的成熟的卵母細(xì)胞融合，體外培

15、養(yǎng)發(fā)育成胚胎后，移入受體妊娠產(chǎn)子已在小鼠、兔、山羊、牛、猴等動(dòng)物上成功五、性別控制與胚胎性別鑒定o動(dòng)物的性別控制(sex control)技術(shù)是通過(guò)對(duì)動(dòng)物的正常生殖過(guò)程進(jìn)行人為干預(yù)，使成年雌性動(dòng)物產(chǎn)出人們期望性別后代的一門(mén)生物技術(shù)ox、y精子分離技術(shù)：流式細(xì)胞儀o胚胎性別診斷 早期胚胎的性別鑒定1）核型分析：分析部分胚胎細(xì)胞的染色體的組成2）sry片段的pcr擴(kuò)增y染色體染色體上的特異上的特異片段片段3）h-y抗原：雄性特異性弱組織相容性y抗原o只有y 精子才能表達(dá)h-y抗原o利用h-y 抗體檢測(cè)精子質(zhì)膜上存在的h-y抗原，再通過(guò)一定的分離程序，就能將精子分離成h-y+(y精子)和h-y-(x

16、精子)兩類，將所需性別的精子進(jìn)行人工受精，即可獲得預(yù)期性別的后代o測(cè)定胚胎上h-y抗原的存在與否對(duì)胚胎的性別作出鑒定意義o通過(guò)控制后代的性別比例，可充分發(fā)揮受性別限制的生產(chǎn)性狀(如泌乳)和受性別影響的生產(chǎn)性狀(如生長(zhǎng)速度、肉質(zhì)等)的最大經(jīng)濟(jì)效益o控制后代的性別比例可增加選種強(qiáng)度，加快育種進(jìn)程o控制胚胎性別還可克服牛胚胎移植中出現(xiàn)的異性孿生不育現(xiàn)象，排除伴性有害基因的危害六、早期胚胎培養(yǎng)o發(fā)育阻斷：早期胚胎停頓在某個(gè)特定發(fā)育時(shí)期，不能繼續(xù)發(fā)育o時(shí)間隨動(dòng)物種不同而異o培養(yǎng)條件不完備o添加各種生長(zhǎng)因子可促進(jìn)胚胎發(fā)育o與某些體細(xì)胞共同培養(yǎng) 飼養(yǎng)性細(xì)胞，通過(guò)分泌某些有利于胚胎發(fā)育所需的營(yíng)養(yǎng)因子第二節(jié) 體

17、外受精o體外受精(in vitro fertilization)是指哺乳動(dòng)物的精子和卵子在體外人工控制的環(huán)境中完成受精過(guò)程的技術(shù)，英文簡(jiǎn)稱為ivfo在生物學(xué)中，把體外受精胚胎移植到母體后獲得的動(dòng)物稱試管動(dòng)物(test-tube animal) 人工授精人工授精(ai)一、基本原理：人工模擬體內(nèi)環(huán)境（包括營(yíng)養(yǎng)、溫度、ph等），使初級(jí)卵母細(xì)胞成熟，同時(shí)使精子獲能，最終完成受精作用，并有計(jì)劃地保存胚胎二、體外受精技術(shù)發(fā)展的歷史 體外受精研究有100多年歷史o1878年德國(guó)sehenk在家兔和豚鼠進(jìn)行了嘗試o1954年張民覺(jué)獲得首例體外受精兔o1963年金黃倉(cāng)鼠體外受精獲得成功，開(kāi)創(chuàng)了精子體外獲能成功

18、的先例o1990年我國(guó)錢菊芬獲得首例試管山羊o旭日干、范必勤等獲得試管牛犢三、意義o體外受精技術(shù)對(duì)動(dòng)物生殖機(jī)理研究、畜牧生產(chǎn)、醫(yī)學(xué)和瀕危動(dòng)物保護(hù)等具有重要意義o在家畜品種改良中，體外受精技術(shù)為胚胎生產(chǎn)提供了廉價(jià)而高效的手段，對(duì)充分利用優(yōu)良品種資源，縮短家畜繁殖周期，加快品種改良速度等有重要價(jià)值o哺乳動(dòng)物胚胎移植、克隆、轉(zhuǎn)基因和性別控制等現(xiàn)代生物技術(shù)不可缺少的組成部分四、體外受精技術(shù)環(huán)節(jié)o卵母細(xì)胞的獲得和體外成熟o精子的體外獲能o成熟卵母細(xì)胞與獲能精子的體外受精o受精卵的體外培養(yǎng)o受精卵的移植體外受精獲能次級(jí)卵母細(xì)胞減數(shù)第二次分裂中期1卵母細(xì)胞的獲得與體外成熟1）卵細(xì)胞的采集方法獲得足夠數(shù)量的卵

19、母細(xì)胞是生產(chǎn)試管動(dòng)物的前提（1）從屠宰場(chǎng)家畜卵巢中采集（2）從超數(shù)排卵的卵巢獲得卵泡,借助腹腔鏡，手術(shù)法取卵（3）陰道超聲波監(jiān)視穿刺法直接從牛卵巢收集卵母細(xì)胞和內(nèi)窺鏡借助套筒穿刺陰道穹隆獲得2）卵母細(xì)胞的成熟o未成熟的卵母細(xì)胞的核在細(xì)胞中央，成熟過(guò)程中遷移到動(dòng)物極質(zhì)膜下，核變得膨大，改稱發(fā)生泡，接著進(jìn)行第一次成熟分裂，減數(shù)分裂的完成標(biāo)志著卵母細(xì)胞核的成熟（1） 細(xì)胞核成熟（2） 細(xì)胞質(zhì)的成熟o顯著的蛋白質(zhì)合成發(fā)生在生發(fā)泡破裂前后，這些新合成的蛋白質(zhì)不僅與卵細(xì)胞自身成熟有關(guān)（激活成熟促進(jìn)因子），而且與卵母細(xì)胞輸精后的發(fā)育能力直接有關(guān)，所以細(xì)胞質(zhì)成熟的質(zhì)量如何直接影響到早期胚胎的發(fā)育能力o胞質(zhì)成熟主要表現(xiàn)為細(xì)胞器變化和紡錘體的形成o卵母細(xì)胞成熟后期細(xì)胞器完成重新組裝，如高爾基體消失，線粒體分布核的周圍，胞質(zhì)內(nèi)有pa