實驗3-細菌的簡單染色和革蘭氏染色復習進程

1、實驗3-細菌的簡單染色和革蘭氏染色革蘭氏染色革蘭氏染色C.Gram（革蘭）于革蘭）于1884年發(fā)明的一種鑒別不同類年發(fā)明的一種鑒別不同類型細菌的染色方法。型細菌的染色方法。細菌的簡單染色和革蘭氏染色細菌的簡單染色和革蘭氏染色l 一 目的要求l 二 基本原理l 三 實驗材料l 四 無菌操作過程l 五 操作步驟l 六 實驗報告l 七 思考題一一 目的要求目的要求1 1 學習制染色片學習制染色片技術技術，學習簡單染色，學習簡單染色 革蘭氏染色原理，革蘭氏染色原理，理解理解著色機理著色機理。學習并掌握學習并掌握無菌操作的無菌操作的技術技術。3 3 掌握掌握簡單染色簡單染色 革蘭氏染色的方法，并能革蘭氏

2、染色的方法，并能正確染色正確染色4 鞏固顯微鏡油鏡的使用鞏固顯微鏡油鏡的使用方法。方法。（一）細菌的簡單染色（一）細菌的簡單染色原理原理（二）革蘭氏染色基本革蘭氏染色基本原理原理二二 基本原理基本原理l細菌細胞微小，且含水量較多，在普通光鏡下表現(xiàn)為無色透明，不易觀察，細菌細胞微小，且含水量較多，在普通光鏡下表現(xiàn)為無色透明，不易觀察，所以必須進行染色處理，使所以必須進行染色處理，使細胞著色細胞著色，便于觀察。，便于觀察。l簡單染色是使用簡單染色是使用單一染料單一染料染色，可用于觀察染色，可用于觀察細菌形態(tài)、大小、及排列方式細菌形態(tài)、大小、及排列方式. .l染色前一般要將細胞染色前一般要將細胞固定

3、固定，其目的是，其目的是殺死殺死菌體并菌體并使之粘附使之粘附于玻片上，還可于玻片上，還可以以增強菌體的著色能力增強菌體的著色能力。固定有。固定有加熱法加熱法和化學法兩種，無論采用何種方法均和化學法兩種，無論采用何種方法均應維持細胞原有形態(tài)。應維持細胞原有形態(tài)。 （一）細菌的簡單染色原理（一）細菌的簡單染色原理（二）革蘭氏染色基本原理（二）革蘭氏染色基本原理 革蘭氏染色是用于革蘭氏染色是用于細菌鑒別細菌鑒別的一種重要染色方法。它是的一種重要染色方法。它是根據(jù)革蘭氏陽性細菌、陰性細菌根據(jù)革蘭氏陽性細菌、陰性細菌細胞壁結構、組成的不同細胞壁結構、組成的不同而而使用一系列的染色處理使之使用一系列的染色

4、處理使之差別顯色差別顯色。其染色方法是先將細。其染色方法是先將細菌分別用結晶紫和碘液初染媒染后，乙醇脫色，再經復染劑菌分別用結晶紫和碘液初染媒染后，乙醇脫色，再經復染劑復染。最終被染成復染。最終被染成紅色紅色的是的是革蘭氏陰性細菌革蘭氏陰性細菌；被染成；被染成紫色紫色的的是是革蘭氏陽性細菌革蘭氏陽性細菌。占占細胞壁細胞壁的的10%占細胞壁的占細胞壁的90%1 1、細胞壁、細胞壁 革蘭氏陽性細菌的細胞壁革蘭氏陽性細菌的細胞壁革蘭氏染色與細胞壁革蘭氏染色與細胞壁：革蘭氏陽性革蘭氏陽性陰性細菌的細胞壁對比陰性細菌的細胞壁對比占占細細胞胞壁壁干干重重的的%成成分分革蘭氏陽性細菌革蘭氏陰性細菌肽聚糖含量

5、很高（5090）含量很低（10）磷壁酸含量較高（50）無類脂質一般無（2）含量較高（20）蛋白質無含量較高v革蘭氏染色原理：革蘭氏染色原理：第一步：第一步：結晶紫使菌體著上紫色結晶紫使菌體著上紫色第二步：第二步：碘和結晶紫形成大分子復合物，分子大，能被細胞壁阻碘和結晶紫形成大分子復合物，分子大，能被細胞壁阻留在細胞內。留在細胞內。第三步：第三步：酒精脫色，細胞壁成分和構造不同，出現(xiàn)不同的反應。酒精脫色，細胞壁成分和構造不同，出現(xiàn)不同的反應。G G+ + 菌：菌：細胞壁厚，肽聚糖含量高，交聯(lián)度大，當乙醇脫色時，肽細胞壁厚，肽聚糖含量高，交聯(lián)度大，當乙醇脫色時，肽聚糖因脫水而孔徑縮小，故結晶紫聚糖

6、因脫水而孔徑縮小，故結晶紫- -碘復合物被阻留在細胞內，碘復合物被阻留在細胞內，細胞不能被酒精脫色，仍呈紫色。細胞不能被酒精脫色，仍呈紫色。GG菌：菌：肽聚糖層薄，交聯(lián)松散，乙醇脫色不能使其結構收縮，肽聚糖層薄，交聯(lián)松散，乙醇脫色不能使其結構收縮，因其含脂量高因其含脂量高, ,乙醇將脂溶解，縫隙加大，結晶紫乙醇將脂溶解，縫隙加大，結晶紫- -碘復合物溶出碘復合物溶出細胞壁，酒精將細胞脫色，細胞無色，蕃紅復染后呈紅色。細胞壁，酒精將細胞脫色，細胞無色，蕃紅復染后呈紅色。1234？三三 實驗材料實驗材料大腸桿菌（大腸桿菌（24 24 h h 培養(yǎng)）斜面菌種培養(yǎng)）斜面菌種枯草桿菌（枯草桿菌（16 1

7、6 h h 培養(yǎng)）培養(yǎng)）斜面菌種斜面菌種四四 無菌操作過程無菌操作過程無菌操作：無菌操作：不讓不讓除我們接種的微生物以外除我們接種的微生物以外 其它微生物其它微生物侵入侵入的技術。的技術。（一）（一） 簡單染色操作步驟簡單染色操作步驟1 1涂片：載玻片、無菌水、斜面菌種、涂片：載玻片、無菌水、斜面菌種、無菌操作無菌操作、均勻的、均勻的薄層薄層2 2干燥：干燥：3 3固定：加熱固定固定：加熱固定4 4染色：染色：結晶紫染結晶紫染1 1minmin或或蕃紅染蕃紅染2-32-3minmin或或石炭酸復紅染石炭酸復紅染1 1minmin。5 5水洗：水洗：6 6 干燥：干燥：7 7鏡檢：鏡檢：低倍鏡低

8、倍鏡觀察以確定目標和范圍，再換用觀察以確定目標和范圍，再換用油鏡油鏡觀察繪圖。觀察繪圖。 五五 操作步驟操作步驟（二）（二）革蘭氏染色操作步驟革蘭氏染色操作步驟1 1涂片：方法同單染色，然后干燥、固定。涂片：方法同單染色，然后干燥、固定。2 2初染：滴加初染：滴加結晶紫結晶紫染色染色1 1minmin，后用水沖洗。后用水沖洗。3 3媒染：滴加媒染：滴加碘液碘液染色染色1-21-2minmin，后用水沖洗，后用水沖洗，甩盡殘余水甩盡殘余水4 4脫色：用脫色：用95%95%乙醇沖洗乙醇沖洗3030秒秒（需要嚴格控制時間和濃度需要嚴格控制時間和濃度），）， 然后立即用水沖洗。然后立即用水沖洗。5 5

9、復染：用蕃紅或石炭酸復紅覆蓋涂片進行復染，復染：用蕃紅或石炭酸復紅覆蓋涂片進行復染，蕃紅染蕃紅染 2-3 2-3minmin，如果如果石炭酸復紅染石炭酸復紅染1 1minmin。水洗，晾干。水洗，晾干。6 6鏡檢：先用低倍鏡觀察，后用鏡檢：先用低倍鏡觀察，后用油鏡油鏡觀察觀察陽性菌陽性菌陰性菌陰性菌1234六六 實驗報告實驗報告1 寫出實驗目的寫出實驗目的2 寫出簡單染色、革蘭氏染色的基本原理寫出簡單染色、革蘭氏染色的基本原理3 根據(jù)實驗結果繪出簡單染色和革蘭氏染色的結果圖。根據(jù)實驗結果繪出簡單染色和革蘭氏染色的結果圖。菌名：放大倍數(shù)：細菌簡單染色結果圖細菌簡單染色結果圖細菌革蘭氏染色結果圖細菌革蘭氏染色結果圖 要求： 標出菌名、顏色、陽性或陰性菌放大倍數(shù)： 七七 思考題思考題1 1 細菌簡單染色操作過程中應注意哪些事項？細菌簡單染色操作過程中應注意哪些事項？2 如果對一如果對一未知菌未知菌進行革蘭氏染色，如何能確證染色