實(shí)驗(yàn)3-細(xì)菌的簡(jiǎn)單染色和革蘭氏染色復(fù)習(xí)進(jìn)程

1、實(shí)驗(yàn)3-細(xì)菌的簡(jiǎn)單染色和革蘭氏染色革蘭氏染色革蘭氏染色C.Gram（革蘭）于革蘭）于1884年發(fā)明的一種鑒別不同類年發(fā)明的一種鑒別不同類型細(xì)菌的染色方法。型細(xì)菌的染色方法。細(xì)菌的簡(jiǎn)單染色和革蘭氏染色細(xì)菌的簡(jiǎn)單染色和革蘭氏染色l 一 目的要求l 二 基本原理l 三 實(shí)驗(yàn)材料l 四 無菌操作過程l 五 操作步驟l 六 實(shí)驗(yàn)報(bào)告l 七 思考題一一 目的要求目的要求1 1 學(xué)習(xí)制染色片學(xué)習(xí)制染色片技術(shù)技術(shù)，學(xué)習(xí)簡(jiǎn)單染色，學(xué)習(xí)簡(jiǎn)單染色 革蘭氏染色原理，革蘭氏染色原理，理解理解著色機(jī)理著色機(jī)理。學(xué)習(xí)并掌握學(xué)習(xí)并掌握無菌操作的無菌操作的技術(shù)技術(shù)。3 3 掌握掌握簡(jiǎn)單染色簡(jiǎn)單染色 革蘭氏染色的方法，并能革蘭氏

2、染色的方法，并能正確染色正確染色4 鞏固顯微鏡油鏡的使用鞏固顯微鏡油鏡的使用方法。方法。（一）細(xì)菌的簡(jiǎn)單染色（一）細(xì)菌的簡(jiǎn)單染色原理原理（二）革蘭氏染色基本革蘭氏染色基本原理原理二二 基本原理基本原理l細(xì)菌細(xì)胞微小，且含水量較多，在普通光鏡下表現(xiàn)為無色透明，不易觀察，細(xì)菌細(xì)胞微小，且含水量較多，在普通光鏡下表現(xiàn)為無色透明，不易觀察，所以必須進(jìn)行染色處理，使所以必須進(jìn)行染色處理，使細(xì)胞著色細(xì)胞著色，便于觀察。，便于觀察。l簡(jiǎn)單染色是使用簡(jiǎn)單染色是使用單一染料單一染料染色，可用于觀察染色，可用于觀察細(xì)菌形態(tài)、大小、及排列方式細(xì)菌形態(tài)、大小、及排列方式. .l染色前一般要將細(xì)胞染色前一般要將細(xì)胞固定

3、固定，其目的是，其目的是殺死殺死菌體并菌體并使之粘附使之粘附于玻片上，還可于玻片上，還可以以增強(qiáng)菌體的著色能力增強(qiáng)菌體的著色能力。固定有。固定有加熱法加熱法和化學(xué)法兩種，無論采用何種方法均和化學(xué)法兩種，無論采用何種方法均應(yīng)維持細(xì)胞原有形態(tài)。應(yīng)維持細(xì)胞原有形態(tài)。 （一）細(xì)菌的簡(jiǎn)單染色原理（一）細(xì)菌的簡(jiǎn)單染色原理（二）革蘭氏染色基本原理（二）革蘭氏染色基本原理 革蘭氏染色是用于革蘭氏染色是用于細(xì)菌鑒別細(xì)菌鑒別的一種重要染色方法。它是的一種重要染色方法。它是根據(jù)革蘭氏陽性細(xì)菌、陰性細(xì)菌根據(jù)革蘭氏陽性細(xì)菌、陰性細(xì)菌細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)、組成的不同細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)、組成的不同而而使用一系列的染色處理使之使用一系列的染色

4、處理使之差別顯色差別顯色。其染色方法是先將細(xì)。其染色方法是先將細(xì)菌分別用結(jié)晶紫和碘液初染媒染后，乙醇脫色，再經(jīng)復(fù)染劑菌分別用結(jié)晶紫和碘液初染媒染后，乙醇脫色，再經(jīng)復(fù)染劑復(fù)染。最終被染成復(fù)染。最終被染成紅色紅色的是的是革蘭氏陰性細(xì)菌革蘭氏陰性細(xì)菌；被染成；被染成紫色紫色的的是是革蘭氏陽性細(xì)菌革蘭氏陽性細(xì)菌。占占細(xì)胞壁細(xì)胞壁的的10%占細(xì)胞壁的占細(xì)胞壁的90%1 1、細(xì)胞壁、細(xì)胞壁 革蘭氏陽性細(xì)菌的細(xì)胞壁革蘭氏陽性細(xì)菌的細(xì)胞壁革蘭氏染色與細(xì)胞壁革蘭氏染色與細(xì)胞壁：革蘭氏陽性革蘭氏陽性陰性細(xì)菌的細(xì)胞壁對(duì)比陰性細(xì)菌的細(xì)胞壁對(duì)比占占細(xì)細(xì)胞胞壁壁干干重重的的%成成分分革蘭氏陽性細(xì)菌革蘭氏陰性細(xì)菌肽聚糖含量

5、很高（5090）含量很低（10）磷壁酸含量較高（50）無類脂質(zhì)一般無（2）含量較高（20）蛋白質(zhì)無含量較高v革蘭氏染色原理：革蘭氏染色原理：第一步：第一步：結(jié)晶紫使菌體著上紫色結(jié)晶紫使菌體著上紫色第二步：第二步：碘和結(jié)晶紫形成大分子復(fù)合物，分子大，能被細(xì)胞壁阻碘和結(jié)晶紫形成大分子復(fù)合物，分子大，能被細(xì)胞壁阻留在細(xì)胞內(nèi)。留在細(xì)胞內(nèi)。第三步：第三步：酒精脫色，細(xì)胞壁成分和構(gòu)造不同，出現(xiàn)不同的反應(yīng)。酒精脫色，細(xì)胞壁成分和構(gòu)造不同，出現(xiàn)不同的反應(yīng)。G G+ + 菌：菌：細(xì)胞壁厚，肽聚糖含量高，交聯(lián)度大，當(dāng)乙醇脫色時(shí)，肽細(xì)胞壁厚，肽聚糖含量高，交聯(lián)度大，當(dāng)乙醇脫色時(shí)，肽聚糖因脫水而孔徑縮小，故結(jié)晶紫聚糖

6、因脫水而孔徑縮小，故結(jié)晶紫- -碘復(fù)合物被阻留在細(xì)胞內(nèi)，碘復(fù)合物被阻留在細(xì)胞內(nèi)，細(xì)胞不能被酒精脫色，仍呈紫色。細(xì)胞不能被酒精脫色，仍呈紫色。GG菌：菌：肽聚糖層薄，交聯(lián)松散，乙醇脫色不能使其結(jié)構(gòu)收縮，肽聚糖層薄，交聯(lián)松散，乙醇脫色不能使其結(jié)構(gòu)收縮，因其含脂量高因其含脂量高, ,乙醇將脂溶解，縫隙加大，結(jié)晶紫乙醇將脂溶解，縫隙加大，結(jié)晶紫- -碘復(fù)合物溶出碘復(fù)合物溶出細(xì)胞壁，酒精將細(xì)胞脫色，細(xì)胞無色，蕃紅復(fù)染后呈紅色。細(xì)胞壁，酒精將細(xì)胞脫色，細(xì)胞無色，蕃紅復(fù)染后呈紅色。1234？三三 實(shí)驗(yàn)材料實(shí)驗(yàn)材料大腸桿菌（大腸桿菌（24 24 h h 培養(yǎng)）斜面菌種培養(yǎng)）斜面菌種枯草桿菌（枯草桿菌（16 1

7、6 h h 培養(yǎng)）培養(yǎng)）斜面菌種斜面菌種四四 無菌操作過程無菌操作過程無菌操作：無菌操作：不讓不讓除我們接種的微生物以外除我們接種的微生物以外 其它微生物其它微生物侵入侵入的技術(shù)。的技術(shù)。（一）（一） 簡(jiǎn)單染色操作步驟簡(jiǎn)單染色操作步驟1 1涂片：載玻片、無菌水、斜面菌種、涂片：載玻片、無菌水、斜面菌種、無菌操作無菌操作、均勻的、均勻的薄層薄層2 2干燥：干燥：3 3固定：加熱固定固定：加熱固定4 4染色：染色：結(jié)晶紫染結(jié)晶紫染1 1minmin或或蕃紅染蕃紅染2-32-3minmin或或石炭酸復(fù)紅染石炭酸復(fù)紅染1 1minmin。5 5水洗：水洗：6 6 干燥：干燥：7 7鏡檢：鏡檢：低倍鏡低

8、倍鏡觀察以確定目標(biāo)和范圍，再換用觀察以確定目標(biāo)和范圍，再換用油鏡油鏡觀察繪圖。觀察繪圖。 五五 操作步驟操作步驟（二）（二）革蘭氏染色操作步驟革蘭氏染色操作步驟1 1涂片：方法同單染色，然后干燥、固定。涂片：方法同單染色，然后干燥、固定。2 2初染：滴加初染：滴加結(jié)晶紫結(jié)晶紫染色染色1 1minmin，后用水沖洗。后用水沖洗。3 3媒染：滴加媒染：滴加碘液碘液染色染色1-21-2minmin，后用水沖洗，后用水沖洗，甩盡殘余水甩盡殘余水4 4脫色：用脫色：用95%95%乙醇沖洗乙醇沖洗3030秒秒（需要嚴(yán)格控制時(shí)間和濃度需要嚴(yán)格控制時(shí)間和濃度），）， 然后立即用水沖洗。然后立即用水沖洗。5 5

9、復(fù)染：用蕃紅或石炭酸復(fù)紅覆蓋涂片進(jìn)行復(fù)染，復(fù)染：用蕃紅或石炭酸復(fù)紅覆蓋涂片進(jìn)行復(fù)染，蕃紅染蕃紅染 2-3 2-3minmin，如果如果石炭酸復(fù)紅染石炭酸復(fù)紅染1 1minmin。水洗，晾干。水洗，晾干。6 6鏡檢：先用低倍鏡觀察，后用鏡檢：先用低倍鏡觀察，后用油鏡油鏡觀察觀察陽性菌陽性菌陰性菌陰性菌1234六六 實(shí)驗(yàn)報(bào)告實(shí)驗(yàn)報(bào)告1 寫出實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶懗鰧?shí)驗(yàn)?zāi)康? 寫出簡(jiǎn)單染色、革蘭氏染色的基本原理寫出簡(jiǎn)單染色、革蘭氏染色的基本原理3 根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果繪出簡(jiǎn)單染色和革蘭氏染色的結(jié)果圖。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果繪出簡(jiǎn)單染色和革蘭氏染色的結(jié)果圖。菌名：放大倍數(shù)：細(xì)菌簡(jiǎn)單染色結(jié)果圖細(xì)菌簡(jiǎn)單染色結(jié)果圖細(xì)菌革蘭氏染色結(jié)果圖細(xì)菌革蘭氏染色結(jié)果圖 要求： 標(biāo)出菌名、顏色、陽性或陰性菌放大倍數(shù)： 七七 思考題思考題1 1 細(xì)菌簡(jiǎn)單染色操作過程中應(yīng)注意哪些事項(xiàng)？細(xì)菌簡(jiǎn)單染色操作過程中應(yīng)注意哪些事項(xiàng)？2 如果對(duì)一如果對(duì)一未知菌未知菌進(jìn)行革蘭氏染色，如何能確證染色