槲皮素對(duì)兔骨關(guān)節(jié)炎模型關(guān)節(jié)液中IL-1β、TNFα水平的影響

1、    槲皮素對(duì)兔骨關(guān)節(jié)炎模型關(guān)節(jié)液中il1、tnf水平的影響    劉俊胡軍祖陳蕾孫巖樊顏偉摘要：目的：觀察中藥槲皮素對(duì)骨關(guān)節(jié)炎動(dòng)物模型關(guān)節(jié)液中細(xì)胞因子il-1、tnf水平的影響。方法：按照hulth法建立兔膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎模型，20只實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)等分成4組：槲皮素組。塞來(lái)昔布組。生理鹽水組。模型組。各治療組分別給予藥物治療4周，然后抽取關(guān)節(jié)液。elisa法檢測(cè)關(guān)節(jié)液中il-1、tnf 的含量。結(jié)果：槲皮素組、塞來(lái)昔布組關(guān)節(jié)液中.il-1、tnf水平均顯著低于模型組（p<0.01）。結(jié)論：槲皮素、塞來(lái)昔布能夠抑制oa模型關(guān)節(jié)滑液中il-1b、tnf

2、的水平。、關(guān)鍵詞：骨關(guān)節(jié)炎；槲皮素；塞來(lái)昔布中圖分類號(hào)：q959.836；r684.3 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：a 文章編號(hào)：10082409（2015）04000504骨關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis，oa）是一種隨著年齡增長(zhǎng)而發(fā)病率也逐漸增加的進(jìn)行性關(guān)節(jié)疾病，發(fā)病機(jī)理至今尚未十分明確，故也沒(méi)什么特效的治療藥物。近年的研究表明炎性細(xì)胞因子il-1、tnf在oa的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起到了非常重要的作用，oa動(dòng)物模型及oa的關(guān)節(jié)中均檢測(cè)出較高水平破的il-1與tnf，il-1和tnf是主要炎性細(xì)胞因子參與骨關(guān)節(jié)炎（oa）。這些細(xì)胞因子干擾軟骨細(xì)胞代謝，抑制細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的合成，促進(jìn)分解代謝的蛋白酶的釋放，

3、壞了軟骨細(xì)胞，從而形成骨關(guān)節(jié)炎，被認(rèn)為是在關(guān)節(jié)炎發(fā)病機(jī)制中起關(guān)鍵作用的促炎癥性細(xì)胞因子。il-1是重要的炎癥介質(zhì)，參與關(guān)節(jié)軟骨破壞的起始和進(jìn)展。在正常人關(guān)節(jié)液中il-1含量極少，il-1b占主要成分。然而在oa患者關(guān)節(jié)液中il-1b含量明顯升高，且與oa的病理表現(xiàn)呈正相關(guān)。tnf可刺激滑膜細(xì)胞產(chǎn)生pge2，增加軟骨下骨的吸收，引起關(guān)節(jié)軟骨型膠原的破壞，并且與oa的疼痛有著密切的關(guān)系，此外oa發(fā)生時(shí)滑膜細(xì)胞和軟骨組織大量分泌tnf，促使滑膜組織的增生，并誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞增生，形成大量的血管翳，致關(guān)節(jié)軟骨破壞，最終可以導(dǎo)致關(guān)節(jié)功能障礙。中醫(yī)藥治療是我國(guó)防治骨關(guān)節(jié)炎的一大特色，中藥不僅可以調(diào)節(jié)機(jī)體免疫

4、功能、減少?gòu)?fù)發(fā)及改善特應(yīng)性體質(zhì)，許多中藥還可減少蛋白酶和細(xì)胞因子的形成，對(duì)于骨關(guān)節(jié)炎疼痛的緩解，關(guān)節(jié)功能的改善有明顯的療效，且不良反應(yīng)小，槲皮素又稱櫟精、槲皮黃素等，是一種植物源性五羥基黃酮類化合物，具有較高的營(yíng)養(yǎng)與藥用價(jià)值。槲皮素多以苷的形式存在于一些水果、蔬菜和草本植物中。槲皮苷等在經(jīng)過(guò)酶或酸作用后，水解成槲皮素。日前已在上百種中草藥中發(fā)現(xiàn)槲皮素的存在，且已有研究證實(shí)槲皮素具有抗腫瘤、抗氧化、抗炎、免疫調(diào)節(jié)等多種生物活性，榭皮素對(duì)硝化應(yīng)激誘導(dǎo)損傷的細(xì)胞具有保護(hù)作用，其機(jī)制可能與榭皮素可提高細(xì)胞內(nèi)erk通路有關(guān)。實(shí)驗(yàn)探討槲皮素對(duì)兔骨關(guān)節(jié)炎模型關(guān)節(jié)液中il-1、tnfot水平的影響作用機(jī)制，為

5、臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。1材料與方法1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物健康成年雄性新西蘭白兔22只，體重2.02.5 kg，由桂林醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。1.2實(shí)驗(yàn)藥品與試劑槲皮素：由北京友誼醫(yī)院中藥房煎制；塞來(lái)昔布：200 mg/粒，由美西爾大藥廠生產(chǎn)；家兔細(xì)胞因子il-1b、tnfot elisa檢測(cè)試劑盒，由解放軍301醫(yī)院放免所提供。1.3實(shí)驗(yàn)儀器-20低溫冰箱；恒溫箱；離心機(jī)；sn-695b型放免測(cè)量?jī)x；普通病理設(shè)備。1.4動(dòng)物模型與實(shí)驗(yàn)分組22只新西蘭兔2只留做檢測(cè)模型是否成功用，其余22只隨機(jī)分為4組；每組5只。于動(dòng)物手術(shù)室切斷前交叉韌帶，參照文獻(xiàn)方法建立hulth模型：將動(dòng)物從耳緣靜脈麻醉后仰臥于手

6、術(shù)臺(tái)上，無(wú)菌條件下取膝關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)縱切口長(zhǎng)約2 cm，顯露膝關(guān)節(jié)，然后切斷前交叉韌帶及內(nèi)側(cè)副韌帶，完整切除內(nèi)側(cè)半月板，保留關(guān)節(jié)軟骨面，手術(shù)后不固定傷肢，給予自由活動(dòng)，給予青霉素20×104/d肌肉注射3 d，預(yù)防感染，手術(shù)后7 d驅(qū)趕動(dòng)物在小動(dòng)物跑臺(tái)上奔跑，30min/d，分2次驅(qū)趕，驅(qū)趕動(dòng)物4周后即得明顯的模型。4周后處死檢測(cè)兔，解剖膝關(guān)節(jié)并行大體觀察及取股骨內(nèi)髁關(guān)節(jié)軟骨標(biāo)本送普通病理檢查，結(jié)果證實(shí)兔膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎模型制作成功（圖1、2）。1.5實(shí)驗(yàn)方法1.5.1模型成功后即給予藥物治療槲皮素組：榭皮素每日藥汁灌胃10.31 mg·kg-1d-1。塞來(lái)昔布組：塞來(lái)昔布每日灌胃

7、1次，20 mg/次。鹽水組：每日灌胃生理鹽水10.31 mg·kg-1·d-1?？瞻捉M：無(wú)藥物治療。全部動(dòng)物治療飼養(yǎng)4周，然后抽取關(guān)節(jié)液。1.5.2抽取關(guān)節(jié)液：施行膝關(guān)節(jié)穿刺抽取關(guān)節(jié)液，用2.5 ml一次性無(wú)菌注射器加入生理鹽水1 ml對(duì)膝關(guān)節(jié)反復(fù)抽吸使沖洗液混勻，最后抽干膝關(guān)節(jié)腔液體。將抽吸的關(guān)節(jié)液以3 000 r/min離心20min，收集上清液，最后獲得關(guān)節(jié)液0.5 my膝，將其注入試管內(nèi)-20低溫冰箱保存。1.6檢測(cè)方法雙抗體elisa法il-1、tnf測(cè)定：采用elisa雙抗體夾心法（按試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作），取上述獲得的關(guān)節(jié)液200l，確定所需的已包被兔il-

8、1/tnf抗體的酶標(biāo)板孔數(shù)目，依次加入倍比稀釋的兔il-1b/tnf標(biāo)準(zhǔn)品和標(biāo)本液，反應(yīng)90min，自動(dòng)洗板機(jī)洗滌2次，加入物素化兔il-1/tnf抗體工作液，反應(yīng)60min，洗滌3次，加入abc工作液，反應(yīng)30 min，洗滌5次，加人3，4，5-三甲氧基苯甲醛顯色工作液，避光反應(yīng)，顯色后加入3，4，5-三甲氧基苯甲醛終止液。酶標(biāo)儀在450 nm測(cè)定吸光度值，根據(jù)吸光度值計(jì)算樣品il-1/tnf的濃度。1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 數(shù)據(jù)處理應(yīng)用spss 10.0軟件。治療組與對(duì)照組的比較應(yīng)用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，p<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，多組間兩兩比較應(yīng)用q檢驗(yàn)。2結(jié)果各組il-i、tnf測(cè)定結(jié)果見(jiàn)

9、表1。槲皮素組、塞來(lái)昔布組關(guān)節(jié)液中il-1、tnf水平均較空白對(duì)照組低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.01）；生理鹽水組關(guān)節(jié)液中的il-1p、tnfa水平均與空白對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p>0.05）；槲皮素組模型關(guān)節(jié)液中il-1、tnf水平均顯著高于塞來(lái)昔布組（p<0.05）。3討論筆者利用動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的方法觀察了2種治療o(wú)a的藥物對(duì)oa模型關(guān)節(jié)液中細(xì)胞因子il-1、tnf的影響。il-1與tnf是非常重要的炎性細(xì)胞因子，多項(xiàng)研究表明oa關(guān)節(jié)中il-1 與tnf水平明顯升高，il-1與tnf 是oa病理過(guò)程中重要的一環(huán)。santangelo等研究發(fā)現(xiàn)oa時(shí)軟骨細(xì)胞和滑膜細(xì)胞分泌i

10、l-1明顯增加，并且對(duì)il-1的敏感性也顯著增加，同時(shí)增加的il-1可使軟骨細(xì)胞和滑膜細(xì)胞上調(diào)mmps的表達(dá)，加劇炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致軟骨基質(zhì)降解，并加速關(guān)節(jié)軟骨的破壞。il-1可使滑膜細(xì)胞合成和分泌膠原酶和pge2，刺激滑膜組織產(chǎn)生炎癥反應(yīng)，加速軟骨基質(zhì)的降解，最后導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨的破壞。在oa患者滑液、滑膜組織、軟骨中il-1和tnf呈高表達(dá)狀態(tài)。il-1和tnf同時(shí)可促進(jìn)大量的炎性和分解性因子分泌并產(chǎn)生放大級(jí)聯(lián)反應(yīng)，促進(jìn)關(guān)節(jié)軟骨的破壞，加速oa病情的發(fā)展。實(shí)驗(yàn)復(fù)制的大鼠膝骨關(guān)節(jié)炎模型，hulth法建立兔oa模型具有創(chuàng)傷小，模型可重復(fù)性好，病理改變接近人類oa軟骨的病理改變的特點(diǎn)，造模4周時(shí)軟骨退變

11、以粗糙糜爛等oa早中期改變?yōu)橹鳌Ｄ壳盀閷W(xué)者廣泛從大體以及光鏡下觀察到關(guān)節(jié)充血、水腫、肥厚，關(guān)節(jié)液量增多，滑膜細(xì)胞增生活躍，且有明顯的炎細(xì)胞浸潤(rùn)，軟骨表面有不同程度的糜爛、缺損，軟骨細(xì)胞排列紊亂，細(xì)胞減少。這些表現(xiàn)與骨關(guān)節(jié)炎的病理形態(tài)學(xué)變化相一致，說(shuō)明模型復(fù)制成功。實(shí)驗(yàn)中槲皮素組、塞來(lái)昔布組關(guān)節(jié)液中il-1b、tnf水平均較空白對(duì)照組低于模型對(duì)照組，表明槲皮素、塞來(lái)昔布能夠阻止關(guān)節(jié)液中il-1、tnf的產(chǎn)生，對(duì)il-1、tnf的產(chǎn)生起到一定的抑制作用。塞來(lái)昔布是cox-2特異性抑制劑，屬于nsaid類藥物，nsaid藥物因能快速緩解骨關(guān)節(jié)炎癥狀而被大范圍使用，塞來(lái)昔布因具有較小的胃腸道不良反應(yīng)被認(rèn)為是治療o(wú)a的理想藥物，但是塞來(lái)昔布因?yàn)槠湮改c道和心血管危險(xiǎn)性，使其不能作為骨性關(guān)節(jié)炎的長(zhǎng)期維持治療，所以臨床醫(yī)生一直尋找一種療效顯著，不良反應(yīng)小、經(jīng)濟(jì)的治療藥物，中醫(yī)藥正是具有以上優(yōu)點(diǎn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明oa動(dòng)物模型經(jīng)槲皮素與nsaid類藥物一樣也具有抑制患者關(guān)節(jié)炎癥的潛在作用。黃熹等認(rèn)為槲皮素在這個(gè)體系中，具有顯著的抗氧化作用，能提高細(xì)胞的抗氧化能力，降低細(xì)胞的凋亡。槲皮素能明顯減少gs-no損傷后的內(nèi)皮細(xì)胞ldh的釋放，減少mda的產(chǎn)生，提高sod，gsh-px的活性，抑制ros的產(chǎn)生，抑制caspase-3的激活，從而具有保護(hù)gs-no誘導(dǎo)損傷的內(nèi)皮細(xì)