中黑盲蝽絲氨酸蛋白酶基因克隆與序列分析

1、    中黑盲蝽絲氨酸蛋白酶基因克隆與序列分析    劉巧英+李夢(mèng)歌+劉雪飛+余昊+王運(yùn)兵摘要：采用兼并引物和race的技術(shù)，在中黑盲蝽（adelphocoris suturalis jakovlev）中獲得絲氨酸蛋白酶的全長cdna序列，將該基因命名為asjsp，cdna全長為958 bp，開放閱讀框?yàn)?85 bp，推測(cè)編碼295個(gè)氨基酸，預(yù)計(jì)分子量為31.20 kda，等電點(diǎn)pi為9.38，預(yù)測(cè)分子式為c1 374h2 222n390o407s15，不穩(wěn)定系數(shù)為31.94，總親水性系數(shù)為0.114，為疏水性穩(wěn)定蛋白質(zhì)。序列分析表明asjsp與其他盲蝽

2、科昆蟲已知絲氨酸蛋白酶的核苷酸序列一致性為55.70%。關(guān)鍵詞：中黑盲蝽（adelphocoris suturalis jakovlev）；絲氨酸蛋白酶；rt-pcr；序列分析：s433.3 ：a ：0439-8114（2016）21-5659-05doi：10.14088/ki.issn0439-8114.2016.21.056cloning and sequence analysis of serine proteinase of adelphocoris suturalis jakovlevliu qiao-ying， li meng-ge， liu xue-fei， yu hao， w

3、ang yun-bing（school of resourse and environment science，henan institute of science and techology，xinxiang 453003，henan，china）abstract： rt-pcr with degenerate primers and race were used to amplify partial cdna fragments and full cdna，one serine protease gene from adelphocoris suturalis jakovlev was i

4、dentified， designated asjsp. the full-length cdnas of asjsp is 958 bp，this gene contains 885 bp open-reading frames（orf） which encodes a putative 295 amino acid protein，with a predicted molecular mass of 31.20 kda and isoeletric point（pi） of 9.38. its predicted molecular formula is c1 374h2 222n390o

5、407s15. bioinformatical analysis showed that it is a instability index is 31.94 and the gravy 0.114，suggesting that it is a stable hydrophobic protein. sequences analysis showed that asjsp had 55.70% identity with complete serine protease genes from other miridae insects.key words：adelphocoris sutur

6、alis jakovlev；serine proteinase；rt-pcr；sequence analysis絲氨酸蛋白酶主要消化昆蟲食物中的蛋白質(zhì)類營養(yǎng)物質(zhì)，并參與合成與降解昆蟲體內(nèi)的蛋白質(zhì)，是大多數(shù)昆蟲消化系統(tǒng)內(nèi)較為重要的消化酶，其主要包含彈性蛋白酶、胰蛋白酶及胰凝乳蛋白酶等1-5。目前，已有一些關(guān)于半翅目盲蝽科昆蟲的絲氨酸蛋白酶方面報(bào)道，研究發(fā)現(xiàn)lygus rugulipennis和creontiades dilutus等盲蝽科昆蟲唾液中富含胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶類6-9，豆莢盲蝽lygus hesperus唾液腺內(nèi)的總蛋白酶活性也以胰蛋白酶活性為主10-12。zhu等13發(fā)現(xiàn)美國牧草

7、盲蝽取食后，主要依靠其唾液腺內(nèi)的絲氨酸蛋白酶先進(jìn)行初步消化，之后其他腸道內(nèi)的蛋白酶進(jìn)一步消化，吸收蛋白質(zhì)類營養(yǎng)物質(zhì)，且絲氨酸蛋白酶的活性占其唾液腺內(nèi)總蛋白酶活性的80%。以上研究結(jié)果說明，在半翅目昆蟲消化系統(tǒng)內(nèi)絲氨酸蛋白酶是較重要的消化酶。中黑盲蝽（adelphocoris suturalis jakovlev）為半翅目盲蝽科昆蟲，是中國一種重要的盲蝽類害蟲，廣泛分布于長江流域和黃河流域14。中黑盲蝽的寄主植物種類眾多，已報(bào)道有100余種，包括棉花等多種作物15。20世紀(jì)90年代末，由于農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)調(diào)整以及bt棉花廣泛種植減少化學(xué)農(nóng)藥的使用等原因，中黑盲蝽種群數(shù)量上升、為害加重，成為中國棉花等

8、作物的主要害蟲16-19。由于其食性雜、天敵控制作用弱、寄主廣泛及行動(dòng)敏捷等特點(diǎn)，在作物大面積生產(chǎn)時(shí)增加了一定的防控測(cè)報(bào)難度。雖然，在一些半翅目盲蝽科植食性昆蟲種類上，針對(duì)絲氨酸蛋白酶類消化酶已進(jìn)行了分子生物學(xué)方面的研究，如豆莢盲蝽lygus hesperus及美國牧草盲蝽，但是目前關(guān)于中黑盲蝽的研究國內(nèi)鮮見報(bào)道。本研究采用rt-pcr和race技術(shù)，克隆中黑盲蝽絲氨酸蛋白酶基因的cdna序列asjsp，并對(duì)其進(jìn)行初步分析，以期為中黑盲蝽絲氨酸蛋白酶的分子消化機(jī)制奠定基礎(chǔ)。1 材料與方法1.1 試驗(yàn)材料供試蟲源：中黑盲蝽成蟲采自河南省新鄉(xiāng)縣，采回后在實(shí)驗(yàn)室用新鮮四季豆人工飼養(yǎng)，室內(nèi)溫度條件（2

9、6±0.5） ，相對(duì)濕度60%70%，光周期168 h（ld）。飼養(yǎng)密度為4060頭/盒，供試所用昆蟲為羽化后的中黑盲蝽成蟲。 1.2 試劑和儀器主要試劑：rna提取試劑盒（reeasy mini kit）購自qiagen公司。cdna第一鏈合成試劑盒（primerscript 1st strand cdna synthesis kit）購自寶生物工程有限公司。膠回收試劑盒（gel extraction kit）購自omega公司。marker 、marker 購自tiangen公司。depc購自上海索萊寶科技有限公司。50×tae緩沖液購自上海雙螺旋生物科技有限公司。其他

10、所用化學(xué)試劑為國產(chǎn)分析純。儀器：neofuge 13r型高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)；tgradient型梯度pcr儀；jy600c型君儀電泳儀和jy-sp-bt型電泳槽；tanon3500型tanon凝膠成像系統(tǒng)；skanit re for multiskan go 3.2型全波長酶標(biāo)儀；eppendorf移液槍；pyx-300q-a型智能光照培養(yǎng)箱；jj-cj-1fd型超凈工作臺(tái)。1.3 試驗(yàn)方法1.3.1 中黑盲蝽總rna的提取 將實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)的中黑盲蝽成蟲置于1.5 ml預(yù)冷的離心管中，加適量液氮研磨至粉末，按照rna提取試劑盒（reeasy mini kit）的具體方法提取中黑盲蝽總rna。1.

11、3.2 中間片段的獲取 cdna的第一鏈合成按試劑盒（primerscript 1st strand cdna synthesis kit）說明書進(jìn)行。pcr反應(yīng)體系包括depc-treat water 34.75 l，10×pcr buffer 5 l，10 mmol/l dntps 4 l，正向引物2 l，反向引物2 l，cdna 2 l，taq酶0.25 l。pcr反應(yīng)熱循環(huán)參數(shù)：預(yù)變性94 3 min；94 變性 30 s，54 退火40 s，72 延伸10 min，34個(gè)循環(huán)；72 延伸10 min。正向引物序列：5-tcgtccaagccgactcat-3。反向引物序列：

12、5-acgcagatagcagcaca-3。1.3.3 全長cdna的獲取 3端cdna擴(kuò)增：反應(yīng)采用3race system for rapid amplification of cdna ends（invitrogen）推薦的方法進(jìn)行， 以總rna為模板，反轉(zhuǎn)錄酶合成cdna。再以反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，用引物5-gcctcttccatcaacttcaac-3與通用引物uap配對(duì)擴(kuò)增3端。pcr產(chǎn)物稀釋100倍作為模板，用上游引物5-agaactctgactgtttgtccg-3與下游引物uap進(jìn)行第二次pcr，擴(kuò)增產(chǎn)物回收、測(cè)序。5端cdna 擴(kuò)增：按照5race system for rap

13、id amplification of cdna ends（version 2.0）推薦方法進(jìn)行，以總rna為模板，用引物5-caagggtgtatctgttg-3，在反轉(zhuǎn)錄酶催化下合成cdna。轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物經(jīng)s.n.a.p純化后進(jìn)行tdt 加尾。最后，以加尾產(chǎn)物為模板，用引物5-ggtggtgtcaagtttctttgg-3與通用引物aap進(jìn)行5端擴(kuò)增。1.3.4 pcr產(chǎn)物的回收與序列測(cè)定 pcr擴(kuò)增產(chǎn)物在1%的瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，在凝膠成像系統(tǒng)中觀察并保存結(jié)果，切割目的條帶按照凝膠回收試劑盒（gel extraction kit）的方法回收pcr產(chǎn)物，并于-20 保存回收目的產(chǎn)物。最后，將

14、純化后的pcr產(chǎn)物送生工生物工程有限公司進(jìn)行測(cè)序。1.4 數(shù)據(jù)分析采用blast獲得的全長cdna序列，使用clustalx1.8 軟件對(duì)這些序列進(jìn)行比對(duì)。采用軟件mega4.0進(jìn)行kimura雙參數(shù)遺傳距離分析，構(gòu)建nj進(jìn)化樹，bootstrap估算重復(fù)1 000次，檢驗(yàn)分子系統(tǒng)樹各處的置信度。利用tmpred軟件（http：//software/tmpred_form.html）預(yù)測(cè)跨膜結(jié)構(gòu)；采用expasy生物信息學(xué)資源網(wǎng)站的protparam工具（http：//protparam/）分析基本理化性質(zhì)及protscale工具（

15、http：//tools/protscale.html）分析疏水性；使用signalp工具（http：/www.cbs.dtu.dk/services/signalp/）預(yù)測(cè)信號(hào)肽。2 結(jié)果與分析2.1 總rna的提取及測(cè)序結(jié)果通過檢測(cè)，提取的中黑盲蝽成蟲rna的od260 nm/od280 nm值為1.926，當(dāng)od260 nm/od280 nm>1.8時(shí)，說明樣品純度較高，可以滿足后續(xù)試驗(yàn)的要求。經(jīng)測(cè)序，得到中黑盲蝽絲氨酸蛋白酶cdna基因，命名為asjsp，長度為958 bp，推測(cè)其開放閱讀框?yàn)?85 bp，編碼295個(gè)氨基酸，以atg為起始密碼子，以ta

16、g為終止密碼，結(jié)果如圖1所示。2.2 序列同源性分析由圖2可知，中黑盲蝽asjsp與其他盲蝽科昆蟲已知絲氨酸蛋白酶的蛋白序列的一致性為55.70%。asjsp與creontiades dilutus（登錄號(hào)：aal15154.1）的一致性為84.41%；與綠盲蝽apolygus lucorum（登錄號(hào)：afx73399.1）的一致性為32.93%；與其他盲蝽科的絲氨酸蛋白酶蛋白序列的一致性均大于31.64%。2.3 不同目絲氨酸蛋白酶的系統(tǒng)發(fā)育樹應(yīng)用mega4.0軟件neighbor joining（nj）法對(duì)包括asjsp在內(nèi)的10種不同種類昆蟲的絲氨酸蛋白酶進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹的構(gòu)建（圖3）

17、。結(jié)果顯示，膜翅目、鞘翅目、半翅目昆蟲絲氨酸蛋白酶較為分化，位于不同的分支上，可能與該目昆蟲食性的不同及繁多的種有一定關(guān)系。中黑盲蝽絲氨酸蛋白酶asjsp先與creontiades dilutus聚在一起，又跟綠盲蝽apolygus lucorum聚在一起，說明中黑盲蝽與creontiades dilutus（登錄號(hào)：aal15154.1）進(jìn)化關(guān)系最近，與綠盲蝽apolygus lucorum（登錄號(hào)：jq609682.1）進(jìn)化關(guān)系次之，與其他7種昆蟲的進(jìn)化關(guān)系較遠(yuǎn)。 2.4 中黑盲蝽絲氨酸蛋白酶基本理化性質(zhì)預(yù)測(cè)分析通過expasy生物信息學(xué)資源網(wǎng)站的protparam工具推測(cè)中黑盲蝽絲氨酸蛋

18、白酶的基本理化性質(zhì)，發(fā)現(xiàn)此蛋白質(zhì)共包含295個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)分子式為c1 374h2 222n390o407s15，理論分子量為31.20 kda，等電點(diǎn)pi為9.38，不穩(wěn)定系數(shù)為31.94，摩爾消光系數(shù)為33 055，總平均親水性系數(shù)為0.114，故推測(cè)此蛋白質(zhì)為穩(wěn)定的疏水性蛋白質(zhì)。使用tmpred軟件預(yù)測(cè)跨膜結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)其有3個(gè)跨膜區(qū)，分別位于第120，5976和198215位，故推測(cè)該蛋白質(zhì)為跨膜蛋白質(zhì)。使用signalp工具對(duì)信號(hào)肽進(jìn)行預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)中黑盲蝽絲氨酸蛋白酶基因asjsp所編碼的蛋白質(zhì)具有信號(hào)肽結(jié)構(gòu)，該信號(hào)肽位于120位氨基酸殘基處。3 討論通過rt-pcr和race技術(shù)獲得了絲

19、氨酸蛋白酶基因的全長cdna序列asjsp。通過對(duì)比氨基酸序列的同源性，asjsp與其他盲蝽科昆蟲已知絲氨酸蛋白酶的氨基酸序列的一致性為55.70%，與creontiades dilutus（登錄號(hào)：aal15154.1）的一致性最高，推測(cè)獲得的克隆蛋白序列是絲氨酸蛋白酶家族中的一員。經(jīng)過生物信息學(xué)分析，推測(cè)中黑盲蝽絲氨酸蛋白酶基因asjsp所編碼的蛋白質(zhì)是一個(gè)疏水蛋白質(zhì)，信號(hào)肽的切割位點(diǎn)可能是前20位氨基酸。研究表明，絲氨酸蛋白酶是昆蟲消化系統(tǒng)中較為重要的蛋白酶。如華北大黑鰓金龜（holotrichia oblita）的絲氨酸蛋白酶hosp1、棉鈴蟲（helicoverpa armigera

20、）的絲氨酸蛋白酶ha-tlp及桔小實(shí)蠅（bactroceran）的絲氨酸蛋白酶bdorser，這些酶在消化系統(tǒng)中均發(fā)揮重要作用20-22。綠盲蝽（apolygus lucorum）取食不同的寄主植物后，其絲氨酸蛋白酶基因alsp3和alsp4在不同性別成蟲的體內(nèi)表達(dá)量均有明顯差異23，24。為深入地探究中黑盲蝽的消化系統(tǒng)中絲氨酸蛋白酶的作用，本研究獲得中黑盲蝽的絲氨酸蛋白酶基因，同時(shí)為以后研究中黑盲蝽體內(nèi)的消化代謝提供理論基礎(chǔ)。參考文獻(xiàn)：1 ryan c a. protease inhibitors in plants：genes for improving defenses against

21、insects and pathogensj.annual review of phytopathology，1990，28（1）：425-449.2 wolfson j l，murdock l l.diversity in digestive proteinase activity among insectsj.journal of chemical ecology， 1990，16（4）：1089-1102.3 johnston k a，lee m j，gatehouse j a，et al. the partial purification and characterisation of

22、 serine protease activity in midgut of larval helicoverpa armigeraj.insect biochemistry，1991，21（4）：389-397.4 christeller j t，laing w a，markwick n p，et al. midgut protease activities in 12 phytophagous lepidopteran larvae：dietary and protease inhibitor interactionsj.insect biochemistry and molecular

23、biology，1992，22（7）：735-746.5 colebatch g，cooper p，east p.cdna cloning of a salivary chymotrypsin-like protease and the identification of six additional cdnas encoding putative digestive proteases from the green mirid，creontiades dilutus（hemiptera：miridae）j. insect biochemistry and molecular biology，

24、2002，32（9）：1065-1075.6 goodchild a j p.a study of the digestive system of the west african cacao capsid bugs （hemiptera， miridae）c.proc zool soc lond，1952，122：543-572.7 hori k. some variations in the activities of salivary amylase and protease of lygus disponsi linnavuori：hemiptera：miridaej.applied

25、entomology and zoology，1970，5（2）：51-61.8 cohen a c. organization of digestion and preliminary characterization of salivary trypsin-like enzymes in a predaceous heteropteran，zelus renardiij.journal of insect physiology，1993， 39（10）：823-829. 9 colebatch g，east p，cooper p.preliminary characterisation o

26、f digestive proteases of the green mirid，creontiades dilutus（hemiptera：miridae）j.insect biochemistry and molecular biology，2001，31（4）：415-423.10 agusti n，cohen a c. lygus hesperus and l. lineolaris （hemiptera：miridae），phytophages，zoophages，or omnivores：evidence of feeding adaptations suggested by th

27、e salivary and midgut digestive enzymesj.journal of entomological science， 2000，35（2）：176-186.11 zeng f，zhu y，cohen a.partial characterization of trypsin-like protease and molecular cloning of a trypsin-like precursor cdna in salivary glands of lygus lineolarisj.comparative biochemistry and physiolo

28、gy part b：biochemistry and molecular biology，2002，131（3）：453-463.12 zeng f，zhu y c，cohen a c.molecular cloning and partial characterization of a trypsin-like protein in salivary glands of lygus hesperus（hemiptera：miridae）j.insect biochemistry and molecular biology，2002，32（4）：455-464.13 zhu y c，zeng

29、f，oppert b. molecular cloning of trypsin-like cdnas and comparison of proteinase activities in the salivary glands and gut of the tarnished plant bug lygus lineolaris（heteroptera：miridae）j.insect biochemistry and molecular biology，2003，33（9）：889-899.14 lu y，wu k，jiang y，et al. mirid bug outbreaks in multiple crops correlated with wide-scale adoption of bt cotton in chinaj. science，2010，328（5982）：1151-1154.15 陸宴輝，吳孔明.棉花盲椿象及其防治m.北京：金盾出版社，2008.16 吳孔明.我國bt棉花商業(yè)化的環(huán)境影響與風(fēng)險(xiǎn)管理策略j.農(nóng)業(yè)