木聚糖酶的原核表達與鑒定和真核表達

1、木聚糖酶的原核表達與鑒定和真核表達摘要:木實驗通過克隆木聚糖酶基因到pte28a表達載體上，轉(zhuǎn)化bl21表達菌株， 用iptg誘導重組菌，跑sds-page后，在目的條帶處冇0的蛋片的表達，用western blot鑒定該蛋白，確信目的條帶是目標蛋白。同時，把目的條帶克隆到ppic9k 載體上，轉(zhuǎn)化畢赤酵母表達菌株gs115,卬醇誘導重組酵母，測得木聚糖酶的活 性可以達到2.375u/mlo 關鍵字：木聚糖酶；原核表達；真核表達材料與方法菌種來源本實驗所用菌種來自于華中農(nóng)業(yè)人學農(nóng)業(yè)微生物國家重點實驗室。1.2培養(yǎng)基lb培養(yǎng)基：蛋白陳10g/l,酵母抽提物5g/l,氯化鈉10 g/l, ph7.

2、0 ypd培養(yǎng)基:蛋白b 20 g/l,酵母抽提物10 g/l,葡萄糖20 g/lbmmy培養(yǎng)基:蛋白月東20g,酵母抽提物:log, 100ml 13.4%ynb, 2ml 0.02%生物 素,5g甲醇，100ml 1m的磷酸鹽緩沖液(ph6.0),定容至1l1.3菌種的活化將甘油管保存的含空載和口的基因的重組大腸桿菌表達菌株在含有 50ug/ml的卡那霉索的固體lb培養(yǎng)基中劃線，過夜培養(yǎng)，挑取單菌落到含有 50ug/ml的卡那霉素的液體lb培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至對數(shù)期，這就是活化的菌株。 同時，將廿油管保存的含空載和目的基因的重組畢赤酵母gs115菌株在ypd固 體平板上劃線，培養(yǎng)至長出單菌落，

3、挑取單菌落到y(tǒng)pd液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對 數(shù)期，備用。1.4重組菌的誘導表達1.4.1重組大腸桿菌的誘導表達按1%的接種量把活化好的重組大腸桿菌接到50ml的含有50ug/ml的卡那 霉索的液體lb培養(yǎng)基中，37°c培養(yǎng)至0d600二0.6,添加終濃度為o.lmm的iptg, 25°c培養(yǎng)6-8h,離心收集菌體，加pbs溶液重懸破碎，再高速離心，取上清液 過ni柱，收集適當咪卩坐濃度洗脫的蛋白質(zhì)，跑sds-page,并做western blot驗證 目標蛋口。1.4.2重組酵母細胞的誘導表達按1%的接種量接種于20mlypd液體培養(yǎng)基中，30°c,250r/min搖

4、瓶16-18h, 待od6oo二26時，5000r/min離心5min收集菌體，將菌體轉(zhuǎn)入50mlbmmy培養(yǎng)基 中(用500ml三角瓶，4層紗布封口)，250r/min搖瓶培養(yǎng)，每隔12h補充甲醇 濃度至0.5-1.0% (w/v)進行蛋白的表達,并每隔12h取樣lml,測odeoo,離心 保留上清備用。誘導96h后收集菌體，終止誘導，離心取上清備用。測定全部樣 品中木聚糖酶的活性。15大腸桿菌表達的蛋白質(zhì)的ni柱純化(1) 固定鎳柱，滴完柱屮的乙醇，加35ml去離子水洗。(2) 至少加 5ml (般為 10ml) binding buffer 平衡。裂解液，即口標蛋口(預先用0.45um膜

5、過濾)，加入柱中。(4) 用 10-15ml binding buffer 洗。(5) 洗脫,用含20mm、300mm和500mm的咪瞠的elution buffer洗脫,收 集300mm濃度的洗脫液。(6) 用20%乙醇洗，再用其貯存?zhèn)S柱。1.6 sds-page鑒定大腸桿菌表達的蛋白質(zhì)及western blot鑒定1.6 1sds-page配制分離膠濃度為12%和濃縮膠濃度為5%的sds-page,配制方式:12%分離膠配制(5ml):水1.6ml30%聚丙烯酰胺2 ml1.5m tris-hci (ph8.8)1.3ml10% sds0.05ml10%過硫酸錢0.05mltemed0.0

6、02 ml按這個順序加入各種溶液，混勻后注入制膠板，加500ul水飽和的止丁醇封膠，待分離膠凝固后，倒掉止丁醇，配制濃縮膠。5%濃縮膠配制(2ml):水1.4ml30%聚丙烯酰胺0.33 ml0.5m tris-hci (ph6.8)0.25ml10% sds0.02ml10%過硫酸鞍0.02mltemed0.002 mln的蛋白洗脫液用兩倍的上樣緩沖液等體積混勻，沸水浴5min,上樣電泳。 80v電泳至分離膠，調(diào)節(jié)電壓為120v,至溟酚藍指示劑到膠最底部，停止電泳。 小心取下分離膠，放入到染色液中染色30-45min,脫色至無背景蛋白條帶清晰。162 western blot用gst蛋口做陰

7、性對照，xynb蛋白為陽性對照。將樣品和兩個對照點樣跑 sds-page,電泳完成后切除多余的膠，轉(zhuǎn)移到正點尼龍膜上，4°c下5%脫脂牛奶 封閉過夜后，用his標簽蛋白的抗體雜交，再用二抗與一抗雜交，dab顯色檢測。17酵母表達上清液木聚糖酶活性的測定1.7.1木聚糖酶活性標準曲線繪制a準確稱取烘干至恒重的無水木糖150 mg,用容量瓶定容至100 ml,配制 成10 pmol/ml的木糖母液。b、用容量瓶將木糖母液稀釋成1.010.0 |imol/ml的木糖標準液。c、分別取0.5 ml的不同濃度的標準液于試管中，以水作為空白對照，分別 加入lml dns試劑，沸水浴5 mined

8、、在540 nm處測定各樣品的吸光度，以吸光度為橫坐標，對應的標準木糖 溶液的濃度為縱坐標繪制標準曲線。1.7.2酵母發(fā)酵液木聚糖酶活性的測定收集重組酵母誘導發(fā)酵液，離心取上清液測定木聚糖酶的活性。測定方式為: 精確吸取上清酶液0.05 ml(每個樣品3個平行)，置于50°c水浴預熱2 min。加入 同樣經(jīng)預熱的用檸檬酸鈉緩沖液(ph 5.0)配制的1%木聚糖溶液0.45 ml,于 50°c水浴精確反應5 min,迅速加入dns液1 ml終止反應，置沸水浴中5 min。 在540 nm處測定各樣品的吸光度，根據(jù)標準曲線計算反應液中還原糖的濃度， 從而計算樣品酶活性。精確吸取

9、上清酶液0.05 ml,先加入1 midns液使酶失活， 加入1%木聚糖溶液0.45 ml,同樣置50 °c水浴精確反應5 min,取后在沸水浴 5 min,為陰性對照。記錄540 nm處各樣品的吸光度，根據(jù)標準曲線計算反應液 中還原糖的濃度，從而計算樣品酶活性。2結(jié)果與分析2.1 sds-page分析人腸桿菌表達的蛋白及western blot驗證結(jié)果m123m代表marker, 1.為gst蛋白,m 1232為xynb蛋白，3為目的蛋白。2.2重組酵母表達的木聚糖酶結(jié)果2.2.1木聚糖標準曲線2 5 15 11 o00. 20. 40. 60. 811. 2abs540酶活性標準

10、曲線的冋歸方程如下y=1.657x + 0.1141, r2=0.9814 （其中y代表 木糖濃度，x代表吸光度），相關系數(shù)達到98%。該標準曲線可以用于木聚糖酶 酶活性的測定。2.2.2酵母發(fā)酵液酶活性12345ck /abs54o0.1290.1180.1190.1150.118樣品 / abs54o0.1440.1640.2010.2530.288差值0.0150.0460.0820.1380.17酶活力單位（u/ml）0.8341.1421.5002.0572.375單位酶活性的定義為：50°c,ph 5.0條件下，每分鐘水解木聚糖生成相當于1 pmol木糖等還原糖所需的酶量

11、為一個酶活力單位（u）。3討論木聚糖酶可以應用在釀造、飼料工業(yè)屮。木聚糖酶可以分解釀造或飼 料工業(yè)中的原料細胞壁以及b葡聚糖，降低釀造中物料的粘度，促進有效 物質(zhì)的釋放，以及降低飼料用糧屮的非淀粉多糖，促進營養(yǎng)物質(zhì)的吸收利 用，并因而更易取可溶性脂類成分。本實驗采用犬腸桿菌和畢赤酵母表達 木聚糖酶，實驗檢測都有木聚糖酶蛋白的表達，從而為未來工業(yè)上應用的 木聚糖酶的來源捉供了一條簡單易行的方式。本實驗所用的木聚糖酶的基 因來自于真菌，絕大多數(shù)的基因工程產(chǎn)品均是在大腸桿菌中表達實現(xiàn)的，這與 其清楚的遺傳背景不無關系。然而許多蛋白質(zhì)在翻譯后，需經(jīng)過翻譯后的修飾加 工，如磷酸化，糖基化和甲基化等，大腸

12、桿菌確實這種加工機制使得很多復朵的 蛋白質(zhì)往往不能在這個系統(tǒng)屮得到正確的表達。與大腸桿菌相比，作為單細胞真 核牛物的酵母菌同時具有了原核牛物的細胞牛長快速和易于培養(yǎng)的優(yōu)點，同時乂 具有真核生物表達蛋白質(zhì)吋對蛋白質(zhì)進行正確的加工的能力。由于酵母具有比較 完備的基因表達調(diào)控機制和對表達產(chǎn)物的加工修飾能力，近年來在復雜蛋白的表 達方面越來越受到重視。pichia.pastoris表達系統(tǒng)經(jīng)過近十幾年發(fā)展，已基木成 為較完善的外源基因表達系統(tǒng)，由丁易丁高密度發(fā)酵，表達基因穩(wěn)定整合在宿主 基因組中，能使產(chǎn)物有效分泌并適當糖基化，培養(yǎng)方便經(jīng)濟等特點，同時利用強 效可調(diào)控的a0x1啟動子，已高效表達了 hbsag.tnf.egf.破傷風毒素c片 段、 基因工程抗體等多種外源蛋白，并應用于工業(yè)化應用。本實驗所用構(gòu)建的木聚糖 酶重組畢赤酵母菌株能成功的表達木聚糖酶，但酶的活性還比較低，在接下來的 實驗屮，我們會通過各種方法提高重組酵母表達的木聚糖酶的量，我們可以通過 篩選多拷貝，修改信號肽序列，修正目的基因序列使得更適合畢赤酵母密碼子的 偏愛性，改善發(fā)酵條件等一系列條件得到更好的重組酵母。4參考文獻1張桂敏，木聚糖酶基因的克隆、表達和酶學性質(zhì)研究。i専士學位畢業(yè)論文。 武漢：華屮農(nóng)業(yè)大學圖書館，2006美sambrookj等著；黃培堂等譯。分子克隆試驗指南，第三版。北京：科