分子技術(shù)在流感病毒檢測(cè)中的應(yīng)用探討

1、    分子技術(shù)在流感病毒檢測(cè)中的應(yīng)用探討    陳小青【摘  要】流行性感冒是一種由流感病毒引起的急性呼吸道傳染病，流感病毒具有流行與不斷復(fù)制重組的能力，不但傳染性極大，傳播速度也非?？?，使得流感成為整個(gè)世界公共衛(wèi)生的重大威脅。近年來(lái)，全球范圍內(nèi)流感頻頻爆發(fā)，快速控制并治療流感的需求，要求對(duì)每一種流感病毒都能夠快速檢測(cè)的出來(lái)，而具有檢測(cè)速度快，檢測(cè)靈活敏感，并且特異性高的分子檢測(cè)技術(shù)對(duì)預(yù)防與控制流感的傳播和實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)工作而言，異常重要?！娟P(guān)鍵詞】分子技術(shù);流感病毒;檢測(cè);r372      a

2、      1672-3783（2019）01-0294-02流行性感冒主要由流感病毒感染引起，具有高傳染性，且可以通過(guò)空氣、污染物與人際接觸傳染，傳播速度極快。感染了流感病毒后，往往很快就出現(xiàn)發(fā)熱、高燒、全身乏力、疼痛等癥狀，并且呼吸道會(huì)出現(xiàn)病征，尤其是老年、嬰幼兒與存在心肺疾病的患者極易并發(fā)肺炎等重病，甚至導(dǎo)致死亡，具有巨大的破壞性。流感病毒由分節(jié)段的單負(fù)鏈rna組成基因組，根據(jù)其核蛋白（np）和膜蛋白（mp）的不同，可分為甲（a）、乙（b）、丙（c）三種類(lèi)型，尤其是甲型流感病毒易發(fā)生抗原變異，傳染性大，非常容易造成大規(guī)模流行性疾病1。甲型

3、流感病毒根據(jù)抗原的不同還分為9個(gè)na亞型與16個(gè)ha亞型，這兩種亞型抗原又可以通過(guò)轉(zhuǎn)換形成新的亞型，而亞型新病毒極可能出現(xiàn)并引發(fā)更大型的流行性流感。因此，能否快速、精準(zhǔn)的檢測(cè)出流感病毒對(duì)于治療與控制流感病毒的傳播與疫情十分重要。分子生物學(xué)的快速發(fā)展，使得分子技術(shù)的應(yīng)用日益廣泛，在流感病毒的檢測(cè)中也發(fā)揮這非常重要的作用。1 聚合酶鏈反應(yīng)聚合酶鏈反應(yīng)（pcr）對(duì)流感病毒的檢測(cè)主要是通過(guò)在非常短暫的時(shí)間里增加大量的特定dna片段來(lái)實(shí)現(xiàn)的分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)，聚合酶鏈反應(yīng)在進(jìn)行病毒檢測(cè)時(shí)僅僅需要少量的樣本就可以實(shí)現(xiàn)檢測(cè)，且其重復(fù)性好，檢測(cè)速度快、敏感高效，從收集樣本到最終檢測(cè)出結(jié)果最少需要2小時(shí)，最多需

4、要24小時(shí)即可。聚合酶鏈反應(yīng)法包括普通rt-pcr法、多重rt-pcr法與實(shí)時(shí)熒光定量法，其中，普通rt-pcr法主要是對(duì)na基因片段與ha基因片段進(jìn)行檢測(cè)，目前對(duì)未知流感病毒的基因片段進(jìn)行兼并引物來(lái)進(jìn)行擴(kuò)增，進(jìn)而達(dá)到分型的目的。多重rt-pcr法則可以一次只對(duì)一種病毒進(jìn)行檢測(cè)，也可以同時(shí)對(duì)多種病毒進(jìn)行檢測(cè)，但需要應(yīng)用多對(duì)引物組合進(jìn)行分型檢測(cè)。其同樣具有高度的靈敏度與特異性，檢測(cè)高效，同時(shí)檢測(cè)多種病毒成本更低，更適用于臨床檢測(cè)應(yīng)用中。實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)法指將熒光基因加入到聚合酶鏈反應(yīng)體系中，通過(guò)熒光信號(hào)在檢測(cè)過(guò)程中的實(shí)時(shí)積累來(lái)進(jìn)行檢測(cè)，并以此來(lái)展開(kāi)定量分析。該方法不但具有普通聚合酶鏈反應(yīng)方法的強(qiáng)

5、特異性、高度敏感、具有重復(fù)性等優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)由于熒光因子能夠更直觀的檢測(cè)到，大幅度降低了檢測(cè)到假陽(yáng)性的可能性1。2 依賴(lài)核酸序列的擴(kuò)增法（nasba）依賴(lài)核酸序列的擴(kuò)增法的檢測(cè)靈敏度與特異性都比聚合酶鏈反應(yīng)檢測(cè)的高，且其擴(kuò)增的效率更高，操作也相對(duì)簡(jiǎn)單，然而，該法在檢測(cè)前必須優(yōu)化引物，且在病毒檢測(cè)中還存在某些病毒出現(xiàn)假陽(yáng)性或靈敏度不足的現(xiàn)象。它主要由一對(duì)引物進(jìn)行引導(dǎo)，以及一種連續(xù)的均一的特異單鏈rna做恒溫的擴(kuò)增產(chǎn)生反應(yīng)的過(guò)程。依賴(lài)核酸序列的擴(kuò)增法應(yīng)用廣泛，多應(yīng)用于禽流感病毒檢測(cè)、呼吸道病毒檢測(cè)中，目前，醫(yī)學(xué)研究界已經(jīng)對(duì)nasba檢測(cè)技術(shù)進(jìn)行改進(jìn)，現(xiàn)在的nasba檢測(cè)技術(shù)已經(jīng)可以實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)檢測(cè)，能夠定

6、量檢測(cè)，使其檢測(cè)的特異性與靈敏性大大提高，目前已廣泛應(yīng)用于a、b兩型流感病毒、呼吸道病毒的檢測(cè)，能夠快速分離出乙型、h3n2、h1n1流感病毒。3 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法（lamp）環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法（lamp）簡(jiǎn)單的說(shuō)就是一種擴(kuò)增核酸的方法，通過(guò)應(yīng)用4種具有特異性的引物，聯(lián)合dna聚合酶置換作用，在恒溫狀態(tài)下，對(duì)靶基因的多個(gè)區(qū)域進(jìn)行核酸擴(kuò)張。該法的可操作性強(qiáng)、簡(jiǎn)單，也不需要特定的試劑與儀器，lamp只有兩種結(jié)果，一是擴(kuò)增，二是不擴(kuò)增，只需要查看反應(yīng)物染色后的顏色以及試劑的渾濁程度就能夠進(jìn)行結(jié)果判定。目前，lamp技術(shù)已非常成熟，以及研發(fā)出了多種針對(duì)性強(qiáng)的檢測(cè)技術(shù)，比如針對(duì)新甲型h1n1流感病毒檢測(cè)的

7、技術(shù)、針對(duì)季節(jié)性流感病毒的檢測(cè)技術(shù)以及針對(duì)h3n2病毒的檢測(cè)技術(shù)等。4 基因芯片基因芯片（genechip）（又稱(chēng)dna芯片、生物芯片），其測(cè)序原理是雜交測(cè)序方法，即通過(guò)與一組已知序列的核酸探針雜交進(jìn)行核酸序列測(cè)定的方法，在一塊基片表面固定了序列已知的靶核苷酸的探針2。通過(guò)探針與樣品進(jìn)行雜交，再通過(guò)對(duì)雜交信號(hào)進(jìn)行檢測(cè)來(lái)判斷生物樣品數(shù)量的多少?；蛐酒瑱z測(cè)的穩(wěn)定性高，具有良好的重復(fù)性與并行性，檢測(cè)速度快，效率高，唯一缺陷是其操作繁瑣，尤其對(duì)檢測(cè)設(shè)備等條件的要求很高，難以適用于一般實(shí)驗(yàn)室的病毒檢測(cè)，但用于調(diào)查流行病學(xué)與開(kāi)展醫(yī)學(xué)科學(xué)研究卻效果顯著。近年來(lái)，分子生物學(xué)的研究取得了長(zhǎng)足的進(jìn)步，對(duì)流行感冒

8、病毒的檢測(cè)技術(shù)也更加成熟與多樣了。本文主要介紹了聚合酶鏈反應(yīng)檢測(cè)法、依賴(lài)核酸序列的擴(kuò)增法、 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法與基因芯片檢測(cè)技術(shù)，此外還有納米技術(shù)、核酸探針技術(shù)、基因測(cè)序技術(shù)、原位雜交技術(shù)、質(zhì)譜技術(shù)等3。但目前我國(guó)在預(yù)防與監(jiān)控流感病毒上，應(yīng)用得最多的還是聚合酶鏈反應(yīng)檢測(cè)法，其他檢測(cè)方法較少使用，但隨著分子技術(shù)的研究更加深入，檢測(cè)技術(shù)與條件的更加完善，我國(guó)也將加大其他檢測(cè)技術(shù)在日常流感病毒的預(yù)防檢測(cè)工作中的應(yīng)用，同樣，這些技術(shù)也將在流感病毒防控工作中發(fā)揮重要作用。參考文獻(xiàn)1   劉鳳.分子技術(shù)在流感病毒檢測(cè)中的應(yīng)用j.現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué)，2014，41（12）：2249-2251.2   李勃，孫菲，李文悌，王曉春.分子技術(shù)在