DNA重組技術(shù)的基本工具精華學習教案

1、會計學1DNA重組技術(shù)的基本工具精華重組技術(shù)的基本工具精華第1頁/共46頁問題探討問題探討手術(shù)刀手術(shù)刀縫合針縫合針運輸工具運輸工具培育抗蟲棉培育抗蟲棉需需要哪些基本工要哪些基本工具具? ?第2頁/共46頁第3頁/共46頁蘇云金芽孢桿菌蘇云金芽孢桿菌普通棉花抗蟲棉普通棉花抗蟲棉第4頁/共46頁普通棉花普通棉花( (無抗蟲特性無抗蟲特性) )蘇云金芽孢桿菌蘇云金芽孢桿菌提取提取抗蟲基因抗蟲基因棉花細胞棉花細胞( (含抗蟲基因含抗蟲基因) )棉花植株棉花植株( (有抗蟲特性有抗蟲特性) )上述培育抗蟲棉的關(guān)鍵步驟是什么？上述培育抗蟲棉的關(guān)鍵步驟是什么？重組重組DNADNA導(dǎo)入導(dǎo)入形成形成基因工程培育

2、抗蟲棉的簡要過程基因工程培育抗蟲棉的簡要過程第5頁/共46頁基因工程培育抗蟲棉的關(guān)鍵步驟基因工程培育抗蟲棉的關(guān)鍵步驟關(guān)鍵步驟一：關(guān)鍵步驟一：抗蟲基因從蘇云金芽孢桿菌細抗蟲基因從蘇云金芽孢桿菌細胞內(nèi)提取出來胞內(nèi)提取出來關(guān)鍵步驟二：關(guān)鍵步驟二：形成重組形成重組DNADNA關(guān)鍵步驟三：關(guān)鍵步驟三： 重組重組DNADNA導(dǎo)入受體導(dǎo)入受體( (棉花棉花) )細胞細胞第6頁/共46頁1.1 DNA重組技術(shù)的基本工具重組技術(shù)的基本工具關(guān)鍵步驟一：關(guān)鍵步驟一：抗蟲基因從蘇云金芽孢桿菌細抗蟲基因從蘇云金芽孢桿菌細胞內(nèi)提取出來胞內(nèi)提取出來關(guān)鍵步驟二：關(guān)鍵步驟二： 形成重組形成重組DNADNA關(guān)鍵步驟三：關(guān)鍵步驟三

3、：重組重組DNADNA導(dǎo)入受體導(dǎo)入受體( (棉花棉花) )細胞細胞第7頁/共46頁主要來源：主要來源：2.種類與命名：種類與命名：3.作用：作用：4.作用結(jié)果：作用結(jié)果：主要是從主要是從原核生物原核生物中分離純化出來的一中分離純化出來的一類酶。類酶。約約4000種種識別特定的核苷酸序列，斷裂磷酸二酯鍵識別特定的核苷酸序列，斷裂磷酸二酯鍵。形成粘性末端或平末端形成粘性末端或平末端第8頁/共46頁來源來源種類種類特點特點作用作用結(jié)果結(jié)果閱讀課本閱讀課本4-5頁頁“限制性核酸內(nèi)切酶限制性核酸內(nèi)切酶分子手分子手術(shù)刀術(shù)刀”的相關(guān)內(nèi)容，填寫下表的相關(guān)內(nèi)容，填寫下表自主學習自主學習主要從原核生物中分離純化而

4、來主要從原核生物中分離純化而來已經(jīng)分離出大約已經(jīng)分離出大約4000種種1、識別雙鏈、識別雙鏈DNA分子的某種特定核苷酸分子的某種特定核苷酸序列序列2、使每一條鏈中使每一條鏈中特定部位特定部位的兩個核苷的兩個核苷酸之間的酸之間的磷酸二酯鍵磷酸二酯鍵斷開。斷開。第9頁/共46頁12345脫氧核苷酸的結(jié)構(gòu)脫氧核苷酸的結(jié)構(gòu)第10頁/共46頁 G1234512345 A3,5-磷磷酸二酯酸二酯鍵鍵3端5端3端5端磷酸二酯鍵磷酸二酯鍵第11頁/共46頁13仔細觀察各限制酶仔細觀察各限制酶 識別的特定序列有識別的特定序列有何何 特點？特點？限制酶的識別序列限制酶的識別序列限制酶所識別的序列的限制酶所識別的序

5、列的特點是：特點是：呈現(xiàn)堿基互補呈現(xiàn)堿基互補對稱，無論是對稱，無論是6個堿基個堿基還是還是4個堿基，都可以找個堿基，都可以找到一條中心軸線，中軸線到一條中心軸線，中軸線兩側(cè)的雙鏈兩側(cè)的雙鏈DNA上的堿上的堿基是基是反向?qū)ΨQ重復(fù)反向?qū)ΨQ重復(fù)排列排列的的 ，稱為，稱為回文序列回文序列第12頁/共46頁能被限制性內(nèi)切酶特能被限制性內(nèi)切酶特異性識別的切割部位異性識別的切割部位都具有都具有回文序列回文序列：在切割部位，一條鏈在切割部位，一條鏈正向正向讀的堿基順序與讀的堿基順序與另一條鏈另一條鏈反向反向讀的順序讀的順序完全完全一致一致。第13頁/共46頁中軸線在G與A之間切割大腸桿菌的一種限制酶(EcoR

6、)只能識別GAATTC序列，并在G和A之間切開。EcoRIEcoRI限制酶的作用限制酶的作用第14頁/共46頁黏性末端黏性末端黏性末端黏性末端EcoRIEcoRI限制酶的切割限制酶的切割 被限制酶切開的被限制酶切開的DNA兩條單兩條單鏈的切口，帶有幾個鏈的切口，帶有幾個伸出的核伸出的核苷酸苷酸，他們之間正好互補配對，他們之間正好互補配對，這樣的切口叫這樣的切口叫黏性末端黏性末端。第15頁/共46頁SmaISmaI只能識別CCCGGG序列，并在C和G之間切開。中軸線SmaISmaI限制酶的作用限制酶的作用在G與C之間切割第16頁/共46頁SmaISmaI限制酶的切割限制酶的切割當限制酶當限制酶從

7、識別序列的中心軸線處切開時，從識別序列的中心軸線處切開時，切開的切開的DNADNA兩條單鏈的切口，是平整的，這樣的切口叫兩條單鏈的切口，是平整的，這樣的切口叫平末端平末端。第17頁/共46頁以下是兩種限制酶切割后形成的以下是兩種限制酶切割后形成的DNA片段，試分析：片段，試分析：GC AATTC GC CTTAA CG G CG G (1)其中和其中和 是由一種限制酶切割形成的是由一種限制酶切割形成的 末末端，所用端，所用限制酶限制酶是是 。 （2） 和和 是由另一種限制酶切割形成的是由另一種限制酶切割形成的 末端，所用的末端，所用的限制酶限制酶可以是可以是 。反饋練習反饋練習SmaI限制酶限

8、制酶EcoRI限制酶限制酶第18頁/共46頁反饋練習反饋練習第19頁/共46頁你能推測限制酶存在于原核生物中的作用你能推測限制酶存在于原核生物中的作用是什么嗎？是什么嗎？原核生物易受自然界外源原核生物易受自然界外源DNA的入侵，的入侵，但生物但生物在長期的進化過程中形成了一套完善的防御機在長期的進化過程中形成了一套完善的防御機制，以防止外來病原物的侵害。制，以防止外來病原物的侵害。限制酶限制酶就是細就是細菌的一種菌的一種防御性工具，防御性工具，當外源當外源DNA侵入時，會侵入時，會利用限制酶利用限制酶將外源將外源DNA切割掉，切割掉，以保證自身的以保證自身的安全。所以，限制酶在原核生物中主要起

9、到切安全。所以，限制酶在原核生物中主要起到切割外源割外源DNA、使之失效，使之失效，從而達到從而達到保護自身保護自身的的目的。目的。尋根問底尋根問底第20頁/共46頁尋根問底尋根問底為什么限制酶不剪切細菌本身的為什么限制酶不剪切細菌本身的DNA？通過長期的進化，細菌中含有某種限制酶通過長期的進化，細菌中含有某種限制酶的細胞，其的細胞，其DNADNA分子中分子中不具備這種限制酶的不具備這種限制酶的識別切割序列識別切割序列，或者，或者通過甲基化酶將甲基轉(zhuǎn)通過甲基化酶將甲基轉(zhuǎn)移到所識別序列的堿基上，使限制酶不能將移到所識別序列的堿基上，使限制酶不能將其切開其切開。這樣，盡管細菌中含有某種限制酶。這樣

10、，盡管細菌中含有某種限制酶也不會使自身的也不會使自身的DNADNA被切斷，并且可以防被切斷，并且可以防止外源止外源DNADNA的入侵。的入侵。 第21頁/共46頁23類型來源功能相同點差別EcoliDNA連接酶T4DNA連接酶大腸桿菌T4噬菌體恢復(fù)磷酸二酯鍵只能連接黏性末端能連接黏性末端和平末端(效率較低)閱讀課本第閱讀課本第5頁頁“分子縫合針”DNA連接酶的的相關(guān)內(nèi)容，填寫下表相關(guān)內(nèi)容，填寫下表自主學習自主學習第22頁/共46頁把切下來的DNA片段拼接成新的DNA，即將脫氧核糖和磷酸連接起來催化形成磷酸二酯鍵DNADNA連接酶的作用連接酶的作用第23頁/共46頁兩兩DNADNA片段要具有片段

11、要具有互補的互補的黏性末端黏性末端才能拼起來才能拼起來DNADNA連接酶的縫合作用連接酶的縫合作用可把黏性末端之間的可把黏性末端之間的縫隙縫隙“縫合縫合”起來起來，注意：注意：DNADNA連接酶可連接雙鏈連接酶可連接雙鏈DNADNA中的兩條單鏈缺口，中的兩條單鏈缺口，但不能連接單鏈但不能連接單鏈DNADNA！第24頁/共46頁T4 DNA連接酶還可把平末端之間的縫隙“縫合”起來，但效率較低DNADNA連接酶的縫合作用連接酶的縫合作用第25頁/共46頁ATGCATGC DNA DNA聚合酶連接單鏈聚合酶連接單鏈DNADNA把單個脫氧核苷酸連接到把單個脫氧核苷酸連接到DNADNA片段上片段上DNA

12、聚聚合合酶酶DNA聚聚合合酶酶DNA聚聚合合酶酶第26頁/共46頁DNA連接酶連接酶DNA聚合酶聚合酶相相同同點點作用實質(zhì)作用實質(zhì)化學本質(zhì)化學本質(zhì)不不同同點點模板模板作用對象作用對象 作用結(jié)果作用結(jié)果用途用途都能催化形成都能催化形成磷酸二酯鍵磷酸二酯鍵都是蛋白質(zhì)都是蛋白質(zhì)不需要不需要需要需要DNA的一條的一條鏈作為模板鏈作為模板形成完整的重形成完整的重組組DNA分子分子形成形成DNA的一條的一條鏈鏈基因工程基因工程DNA復(fù)制復(fù)制DNA連接酶與連接酶與DNA聚合酶的比較聚合酶的比較只能將只能將單個核苷單個核苷酸酸連接到已有的連接到已有的DNADNA片段上，形片段上，形成磷酸二酯鍵成磷酸二酯鍵在兩

13、個DNA片段之間形成磷酸二酯鍵第27頁/共46頁小試身手小試身手 DNADNA連接酶催化的反應(yīng)是（連接酶催化的反應(yīng)是（ ）A A、DNADNA復(fù)制時母鏈與子鏈之間形成氫鍵復(fù)制時母鏈與子鏈之間形成氫鍵B B、黏性末端堿基之間形成氫鍵、黏性末端堿基之間形成氫鍵C C、兩個、兩個DNADNA片斷黏性末端之間的縫隙的片斷黏性末端之間的縫隙的連接連接D D、A A、B B、C C都不正確都不正確c c第28頁/共46頁以下是兩種限制酶切割后形成的以下是兩種限制酶切割后形成的DNA片段，試分析：片段，試分析：GC AATTC GC CTTAA CG G CG G (1)其中和其中和 是由一種限制酶切割形成

14、的是由一種限制酶切割形成的 末末端，兩者要重組成一個端，兩者要重組成一個DNA 分子，所用分子，所用DNA連接酶通常連接酶通常是是 。 （2） 和和 是由另一種限制酶切割形成的是由另一種限制酶切割形成的 末端，兩者要形成重組末端，兩者要形成重組DNA片段，所用的連接酶通常片段，所用的連接酶通常是是 。反饋練習反饋練習T4 DNA連接酶連接酶Ecoli DNA連接酶和連接酶和T4 DNA連接酶連接酶第29頁/共46頁限制酶與限制酶與DNADNA解旋酶、解旋酶、DNADNA水解酶的比較水解酶的比較第30頁/共46頁 比較比較第31頁/共46頁載體的載體的作用作用載體的必要載體的必要條件條件載體的載

15、體的種類種類閱讀課本第閱讀課本第6頁頁“分子運輸車分子運輸車”載體載體的相的相關(guān)內(nèi)容，填寫下表關(guān)內(nèi)容，填寫下表自主學習自主學習細菌的質(zhì)粒細菌的質(zhì)粒病毒：病毒：、動植物病毒等。、動植物病毒等。 第32頁/共46頁有標記基因的存在，有標記基因的存在，可用含青霉素的培可用含青霉素的培養(yǎng)基鑒別。養(yǎng)基鑒別。有切割位點有切割位點能復(fù)制并帶著能復(fù)制并帶著插入的目的基插入的目的基因一起復(fù)制因一起復(fù)制質(zhì)粒質(zhì)粒裸露的、結(jié)構(gòu)簡單的、獨立于細菌染色體（即擬裸露的、結(jié)構(gòu)簡單的、獨立于細菌染色體（即擬核核DNA）之外，并具有）之外，并具有自我復(fù)制能力自我復(fù)制能力的很小的雙鏈環(huán)狀的很小的雙鏈環(huán)狀DNA分子。對分子。對主要存

16、在于主要存在于其中最常用的是其中最常用的是最常用運載體最常用運載體質(zhì)粒質(zhì)粒 實際上實際上在基因在基因工程操作中，工程操作中，真正被用作載真正被用作載體的質(zhì)粒，都體的質(zhì)粒，都是在天然質(zhì)粒是在天然質(zhì)粒的基礎(chǔ)上進行的基礎(chǔ)上進行過人工改造的。過人工改造的。第33頁/共46頁ABAB反饋練習反饋練習第34頁/共46頁小結(jié)升華小結(jié)升華限制酶限制酶DNADNA連接酶連接酶載體載體來源來源特點特點結(jié)果結(jié)果作用作用種類種類特點特點種類種類條件條件作用作用DNA重組技術(shù)的基本工具重組技術(shù)的基本工具第35頁/共46頁基因拼接技術(shù)基因拼接技術(shù)DNA重組技術(shù)重組技術(shù)基因基因修飾改造修飾改造定向地定向地第36頁/共46頁DNA 重組技術(shù)的基本工具重組技術(shù)的基本工具“分子手術(shù)刀分子手術(shù)刀” “分子縫合針分子縫合針” “分子運輸車分子運輸車”限制限制（性核酸內(nèi)切）（性核酸內(nèi)切）酶酶DNA連接酶連接酶載體載體第37頁/共46頁原核生物中分離純化出來原核生物中分離純化出來特定的核苷酸序列特定的核苷酸序列磷酸二酯鍵磷酸二酯鍵粘性末端粘性末端平末端平末端第38頁/共46頁1、種類：、種類：2、作用部位：、作用部位：兩類兩類連接黏性末連接黏性末端端Ecoli DNA連接酶連接酶T4 DNA連接酶連接酶磷酸二酯鍵磷酸二酯鍵連接黏性末端和平末端連接黏性末端和平末端第39頁/共46頁質(zhì)粒質(zhì)粒噬菌體衍生物噬菌體衍生物動植