Id1啟動子的熒光素酶報告基因載體的構(gòu)建及其在肝癌HepG2細(xì)胞中的活性檢測(1)

1、Id1啟動子的熒光素酶報告基因載體的構(gòu)建及其在肝癌HepG2細(xì)胞中的活性檢測丁睿，韓霜，雷婷，劉杰，竇科峰【摘要】目的：擴(kuò)增Id1啟動子基因，構(gòu)建Id1啟動子的報告基因載體.方法：通過PCR及雙酶切方法，從HepG2 細(xì)胞基因組DNA中獲得Id1基因編碼序列上游包含不同長度 堿基的兩段Id1啟動子序列；分別克隆到報告基因pGL3enhancer載體上，構(gòu)建包含兩段不同長度Id1啟動子的報告 基因載體；用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將兩報告基因載體分別轉(zhuǎn)染至肝 癌HepG2細(xì)胞系；采用雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)評估Id1啟動子活性.結(jié)果：經(jīng)PCR方法擴(kuò)增出大小分別為1096 bp和266 bp的兩段不同長度的Id1

2、啟動子片段，序列測定其編碼 序列及讀框正確，酶切鑒定亞克隆序列正確.瞬時轉(zhuǎn)染HepG2后經(jīng)報告基因檢測，兩段啟動子均具有轉(zhuǎn)錄活性.結(jié)論：成功構(gòu)建了 Id1啟動子的報告基因載體，為進(jìn)一步研究 Id1啟動子和肝癌的關(guān)系奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ).【關(guān)鍵詞】分化抑制因子0引言Id蛋白即分化抑制或 DNA吉合抑制蛋白是缺少 DNA吉合 結(jié)構(gòu)域的螺旋環(huán)螺旋蛋門，是HLH轉(zhuǎn)錄因子的顯性負(fù)性 調(diào)節(jié)分子.已知哺乳動物Id蛋白家族有Id1Id4等4位成員.它們可調(diào)節(jié)多種細(xì)胞進(jìn)程，包括細(xì)胞生長、衰老、分化、 凋亡和血管生成等1.研究2表明Id蛋白特別是Id1 , 可通過滅活腫瘤抑制因子和激活生長促進(jìn)通路而促進(jìn)哺乳 動物細(xì)胞的

3、增殖和細(xì)胞周期的進(jìn)行，其可能是腫瘤增殖所必 需的關(guān)鍵因子.Id1可能是預(yù)測慢性肝炎肝硬化患者的肝癌發(fā)生風(fēng)險的有用指標(biāo)，并且可作為治療肝癌的靶向分子.我們擬構(gòu)建兩段包含不同長度Id1啟動子片段的報告基因載體，轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞后檢測兩段Id1啟動子的活性.1材料和方法材料pGL3 enhancer載體，內(nèi)參照 pRL TK載體和 Dual luciferase reporter Kit ; LipofectaminTM Reagent 和T4 DNA連接酶；細(xì)胞基因組 DNA提取試劑盒；高保真 Taq DNA聚合酶；Plasmid Miniprep Kit 和 Gel Extration Kit

4、 ; DNA marker: GeneRulerTM 100 bp DNA ladder Plus 和 GeneRulerTM 1 Kb DNA ladder ; 胰蛋白胨及酵母提取物； 限制性內(nèi)切酶 Hind川，Kpnl；其余試劑均為國產(chǎn)分析純. TD20/20熒光照度計；HepG2細(xì)胞和JM109菌株均為本實(shí)驗(yàn) 室保存.方法啟動子報告基因載體的構(gòu)建引物設(shè)計自XX網(wǎng)站數(shù)據(jù)庫檢索獲得Id1啟動子序列的 -3000100部分序列，分別設(shè)計兩段啟動子引物序列，并在上游引物5端加入Kpn I的酶切位點(diǎn) GGTAC,在下游引 物5端加入Hind川的酶切位點(diǎn)AAGCTT.從轉(zhuǎn)錄起始零點(diǎn)開 始，兩段啟動子

5、片段長度分別為：1019+ 76和189 + 76. 上游弓丨物分別為Fw1： gggtaccgggagcacgggaactagc和 Fw2: gggtaccccacccttgctgttctga ; 下游 弓丨物 Rv: aagcttggagaatgggcaaagcgaaa.細(xì)胞培養(yǎng)及模板提取將 HepG2細(xì)胞用含100 mL/L胎牛 血清的RPMI 1640培養(yǎng)基在 37C, 50 mL/L CO2的孵箱中培 養(yǎng).收集對數(shù)生長期細(xì)胞約 1 X 107 ,以細(xì)胞基因組 DNA提取 試劑盒提取基因組 DNA.啟動子基因的克隆以 HepG2細(xì)胞基因組DNA為模板，用 Fw1為上游引物、Rv為下游引

6、物，經(jīng)預(yù)實(shí)驗(yàn)選擇94 C變性1min, 55C退火1 min , 72C延伸1 min, 共30個循環(huán)，獲 得一長度為1096 bp的片段，命名為Id1p1 ;選用Fw2為上 游引物、Rv為下游引物，經(jīng)預(yù)實(shí)驗(yàn)選擇94C變性30 s, 54C 退火30 s, 72C延伸45 s,共30個循環(huán)，獲得一長度為266 bp的片段，命名為Id1p2.用10 g/L瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳 獲得2條鑒定條帶，大小分別約為1100 bp和260 bp.參照試劑盒的操作說明回收并純化.啟動子載體的構(gòu)建與測序?qū)晒馑孛笀蟾婊騪GL3enhancer載體分別行 Kpn I和Hind川雙酶切，回收.同時將 之前回收的P

7、CR產(chǎn)物同樣經(jīng)KpnI和Hind川雙酶切及瓊脂糖凝膠電泳，分別回收約 1100 bp和260 bp條帶.使之分別 在T4連接酶的作下與 pGL3 enhancer載體以3 : 1和10 : 1的濃度比于16 C連接12 h，使Id1p1和Id1p2基因序列插 入無啟動子的pGL3 enhancer載體中.以低溫CaCI2法轉(zhuǎn) 化感受態(tài)細(xì)菌，涂布于含氨芐青霉素的固體LB培養(yǎng)皿上，12 h后挑取單克隆菌落，以質(zhì)粒小量提取試劑盒提取質(zhì)粒.行Kpnl和Hind川雙酶切并測序鑒定陽性克隆的重組質(zhì)粒.最終構(gòu)建成重組報告基因載體Id1p1/PGL3和Id1p2/PGL3.啟動子載體轉(zhuǎn)染肝癌 HepG2細(xì)胞系

8、將兩種重組質(zhì)粒、空 載體pGL3 enhancer和內(nèi)參照pRLTK載體轉(zhuǎn)化的陽性菌株，在LB培養(yǎng)基中37C搖床培養(yǎng)過夜，按質(zhì)粒提取說明 分別提取 ld1p1/pGL3 Jd1p2/pGL3、空載體 pGL3 enhancer 和pRL TK的DNA經(jīng)紫外分光光度儀測定A260 nm值.按照LipofectaminTM Reagent脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染系統(tǒng)說明，于轉(zhuǎn)染前1日將細(xì)胞接種于24空板，5X 104/孑L,第2日當(dāng)細(xì)胞約 90%融合時，每孔分別定量加入Id1p1/pGL3卩g, PRL TK內(nèi)參照載體 100 ng , LipofectaminTM 5 卩L和無血清培養(yǎng) 基 200 卩 L.

9、6 h 后換含 FBS 100 mL/L 的 RPMI 1640,培養(yǎng) 18 h.報告基因活性的檢測瞬時轉(zhuǎn)染24 h后收集、裂解細(xì)胞，離心取上清，用 Dual Luciferase Reporter Assay System 在TD20/20熒光照度計上測定裂解上清內(nèi)Luc活性，計算Firefly Luc / Renilla Luc的比值，并以空載體pGL3enhancer轉(zhuǎn)染細(xì)胞作對照，進(jìn)行比較以判斷Idlpl和Id1p2啟動子活性.2結(jié)果目的基因的克隆及測序以肝癌細(xì)胞 HepG2基因組DNA為 模板，分別克隆出兩段Id1啟動子，分別為1096 bp的Id1p1 和 266 bp 的 Id1

10、p2.圖1PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳略啟動子報告基因載體酶切及測序鑒定回收經(jīng)Kpn I和Hind川雙酶切得到的Id1p1和Id1p2兩重組質(zhì)粒和 pGL3 enhancer載體的相應(yīng)條帶，經(jīng) T4連接酶連接后轉(zhuǎn)化感受態(tài) 細(xì)菌.再經(jīng)Kpn I和Hind川酶切后，兩種重組質(zhì)粒分別釋放 出1096 bp和266 bp大小的片段.測序結(jié)果亦證實(shí)兩段均 包含Id1啟動子序列.表明包含不同長短的Id1啟動子報告 基因載體構(gòu)建成功.圖2雙酶切重組質(zhì)粒瓊脂糖電泳略轉(zhuǎn)錄活性的檢測兩段Luc報道基因載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞均表現(xiàn)有Id1啟動子活性，空載體pGL3 enhancer對照為,Id1p1 為，Id1p2為，二啟動子活

11、性分別較對照升高倍和倍 .對結(jié) 果分析表明，兩段均包含核心啟動子部分.而Id1p1顯示更 高的啟動子活性.3討論HLH轉(zhuǎn)錄因子具有調(diào)節(jié)細(xì)胞生長分化的重要作用，大多 數(shù)HLH蛋白屬于堿性的bHLH家族，具有高度保守的HLH結(jié)構(gòu)域和堿性 DNA結(jié)合區(qū).Id 蛋白是堿性 DNA結(jié)合區(qū)缺失的 bHL H蛋白，它與bHL H形成異源二聚體后即喪失結(jié)合DNA的能力，從而抑制了下游含有 Ebox DNA片段的基因的轉(zhuǎn)錄，因而在功能上Id是這類轉(zhuǎn)錄因子的顯性負(fù)性調(diào)節(jié)蛋白.能與Id蛋白結(jié)合的分子可以分為兩大類，包括組織普遍表達(dá) 的E47和組織特異性表達(dá)的 MyoD. Id與后一類分子結(jié)合能 力遠(yuǎn)遠(yuǎn)強(qiáng)于前者，但目

12、前發(fā)現(xiàn)的這類分子屈指可數(shù)研究表明，轉(zhuǎn)染外源性Id1的鼻咽癌細(xì)胞、前列腺癌細(xì) 胞和卵巢癌細(xì)胞的增殖率和S期細(xì)胞所占比例升高3.異常表達(dá)Id1的前列腺癌細(xì)胞中 p16INK4a水平降低，CDK和磷 酸化RB蛋白水平升高，提示Id1可能通過p16INK4a/pRB途 徑促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖4.另一實(shí)驗(yàn)則表明Id1也可能通 過激活MAPK途徑誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞增殖5 . Id1的異常過表 達(dá)還可誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞持續(xù)增殖，當(dāng)下調(diào) Id1表達(dá)時可導(dǎo)致 細(xì)胞周期素cyclinD1 和cyclinE 的表達(dá)下降和 cyclinE Cdk2活性降低，以及pRB的Ser780位點(diǎn)的磷酸化程度降低， 這與下調(diào)cmyc蛋白表達(dá)的

13、作用效果類似，提示Id1也可能參與cyclinD對cmyc蛋白表達(dá)依賴途徑從而促進(jìn)細(xì)胞周期進(jìn)程，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞增殖6.而當(dāng)阻斷Id1 , Id2和Id3蛋白表達(dá)時，人結(jié)腸腺癌S期細(xì)胞比率降低，且與阻斷量負(fù)相關(guān)7.此外，研究發(fā)現(xiàn)，Id1和Id2在高度侵襲性 前列腺癌細(xì)胞PC3中高表達(dá)，而在非侵襲性的LNCaP細(xì)胞中低表達(dá)，且阻斷Id2表達(dá)后，可使腫瘤細(xì)胞侵襲和增殖能力 降低8.在上皮性卵巢腫瘤中，Id1的表達(dá)程度與腫瘤低 分化和高侵襲特性相關(guān)，高表達(dá)的Id1可提示不良預(yù)后相關(guān):9.以上均提示Id蛋白與腫瘤增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移能力密 切相關(guān).目前Id蛋白與肝癌相關(guān)性的研究仍鮮有報道.初步發(fā)現(xiàn)高表達(dá)的Id1可能是預(yù)測慢性肝炎肝硬化患者的肝癌發(fā)生 風(fēng)險有價值的指標(biāo)10.通過組織微陣列研究表明Id1的表達(dá)與VEGF表達(dá)顯著相關(guān)，它可通過穩(wěn)定化處理HIF 1alpha蛋白而介導(dǎo) VEGF的轉(zhuǎn)錄活性.下調(diào)VEGF可抑制Id1 從而延緩腫瘤細(xì)胞侵襲11.我們成功構(gòu)建了 Id1兩段不 同長度的啟動子載體并順利轉(zhuǎn)染肝癌HepG2細(xì)胞系，使受控于Id1啟動子的Luc報道基因在HepG2細(xì)胞中得