細(xì)胞凋亡學(xué)習(xí)教案

1、會(huì)計(jì)學(xué)1第一頁，共73頁。 概述概述(i sh)第1頁/共72頁第二頁，共73頁。壞死(hui s)凋亡第2頁/共72頁第三頁，共73頁。apoptosis第3頁/共72頁第四頁，共73頁。第4頁/共72頁第五頁，共73頁。細(xì)胞細(xì)胞(xbo)壞死與細(xì)胞壞死與細(xì)胞(xbo)凋亡的區(qū)別凋亡的區(qū)別第5頁/共72頁第六頁，共73頁。 細(xì)胞凋亡與細(xì)胞壞死的區(qū)別細(xì)胞凋亡與細(xì)胞壞死的區(qū)別(qbi)特征特征 細(xì)胞凋亡細(xì)胞凋亡 細(xì)胞壞死細(xì)胞壞死誘導(dǎo)因素誘導(dǎo)因素 生理及弱刺激生理及弱刺激 強(qiáng)烈刺激強(qiáng)烈刺激受累范圍受累范圍 單個(gè)細(xì)胞丟失單個(gè)細(xì)胞丟失 成群細(xì)胞死亡成群細(xì)胞死亡膜完整性膜完整性 保持到晚期保持到晚期 早

2、期即喪失早期即喪失細(xì)胞體積細(xì)胞體積 減小、固縮減小、固縮 增大腫脹增大腫脹染色質(zhì)染色質(zhì) 凝聚成半月形凝聚成半月形 稀疏成網(wǎng)狀稀疏成網(wǎng)狀細(xì)胞器細(xì)胞器 無明顯變化無明顯變化 腫張破壞腫張破壞溶酶體溶酶體 保持完整保持完整 破壞外溢破壞外溢細(xì)胞形狀細(xì)胞形狀 形成凋亡小體形成凋亡小體 破裂成碎片破裂成碎片基因組基因組DNA 有控降解有控降解 隨機(jī)降解隨機(jī)降解大分子合成大分子合成 一般需要一般需要 不需要不需要基因調(diào)控基因調(diào)控 有有 無無后果后果 不引起炎癥反應(yīng)不引起炎癥反應(yīng) 引起炎癥反應(yīng)引起炎癥反應(yīng)意義意義 生理死亡方式生理死亡方式 病理死亡方式病理死亡方式第6頁/共72頁第七頁，共73頁。第7頁/共

3、72頁第八頁，共73頁。 二二 、凋亡時(shí)細(xì)胞、凋亡時(shí)細(xì)胞(xbo)(xbo)的主要變化的主要變化第8頁/共72頁第九頁，共73頁。細(xì)細(xì) 胞胞 凋凋 亡亡第9頁/共72頁第十頁，共73頁。(掃描電鏡)正常(zhngchng)細(xì)胞(掃描電鏡) (透射電鏡) 凋亡(dio wn)細(xì)胞凋亡(dio wn)小體第10頁/共72頁第十一頁，共73頁。DNA片斷(pindun)化caspase激活(j hu)滅活凋亡(dio wn)抑制物水解活性蛋白水解結(jié)構(gòu)蛋白Ca 2+ /Mg 2+ Zn 2+ 核酸內(nèi)切酶激活核酸內(nèi)切酶激活2. 生化改變生化改變（The biochemical characteristi

4、cs of apoptosis）第11頁/共72頁第十二頁，共73頁。第12頁/共72頁第十三頁，共73頁。第13頁/共72頁第十四頁，共73頁。凋亡凋亡(dio wn)誘導(dǎo)因素誘導(dǎo)因素 死亡死亡(swng)信號信號凋亡相關(guān)基因激活凋亡相關(guān)基因激活 凋亡的執(zhí)行凋亡的執(zhí)行 凋亡細(xì)胞清除凋亡細(xì)胞清除 第14頁/共72頁第十五頁，共73頁。凋亡凋亡(dio wn)的機(jī)制的機(jī)制第15頁/共72頁第十六頁，共73頁。細(xì)胞細(xì)胞(xbo)凋亡的兩條通路：死亡受體途徑、線粒體途徑凋亡的兩條通路：死亡受體途徑、線粒體途徑第16頁/共72頁第十七頁，共73頁。第17頁/共72頁第十八頁，共73頁。第18頁/共72

5、頁第十九頁，共73頁。一系列caspase激活細(xì)胞凋亡第19頁/共72頁第二十頁，共73頁。FSALFas第20頁/共72頁第二十一頁，共73頁。第21頁/共72頁第二十二頁，共73頁。第22頁/共72頁第二十三頁，共73頁。第23頁/共72頁第二十四頁，共73頁。+caspase-independent apoptosisBid第24頁/共72頁第二十五頁，共73頁。第25頁/共72頁第二十六頁，共73頁。第26頁/共72頁第二十七頁，共73頁。大小亞基結(jié)合（二聚體） caspase活（四聚體） Pro-caspase： NH2末端結(jié)構(gòu)域 、20KD亞基、 10KD亞基 剪切第27頁/共72

6、頁第二十八頁，共73頁。第28頁/共72頁第二十九頁，共73頁。第29頁/共72頁第三十頁，共73頁。第30頁/共72頁第三十一頁，共73頁。第31頁/共72頁第三十二頁，共73頁。第32頁/共72頁第三十三頁，共73頁。細(xì)胞細(xì)胞(xbo)凋亡凋亡第33頁/共72頁第三十四頁，共73頁。第34頁/共72頁第三十五頁，共73頁。第35頁/共72頁第三十六頁，共73頁。多樣性：不同種類細(xì)胞有不同的信號多樣性：不同種類細(xì)胞有不同的信號(xnho)(xnho)轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)導(dǎo)系統(tǒng)偶聯(lián)性：死亡信號偶聯(lián)性：死亡信號(xnho)(xnho)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)與細(xì)胞增殖轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)與細(xì)胞增殖、分化過程、分化過程 中的信號中的信

7、號(xnho)(xnho)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)在一些環(huán)節(jié)上交叉轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)在一些環(huán)節(jié)上交叉、偶聯(lián)、偶聯(lián)同一性：不同凋亡誘導(dǎo)因素可通過同一信號同一性：不同凋亡誘導(dǎo)因素可通過同一信號(xnho)(xnho)轉(zhuǎn)導(dǎo)系轉(zhuǎn)導(dǎo)系 統(tǒng)引起細(xì)胞凋亡統(tǒng)引起細(xì)胞凋亡多途性：同一凋亡誘導(dǎo)因素可經(jīng)過多條信號多途性：同一凋亡誘導(dǎo)因素可經(jīng)過多條信號(xnho)(xnho)途徑觸途徑觸 發(fā)細(xì)胞凋亡發(fā)細(xì)胞凋亡第36頁/共72頁第三十七頁，共73頁。第37頁/共72頁第三十八頁，共73頁。第38頁/共72頁第三十九頁，共73頁。第39頁/共72頁第四十頁，共73頁。第40頁/共72頁第四十一頁，共73頁。GF第41頁/共72頁第四十二頁，共73

8、頁。 - 誘導(dǎo)死亡受體誘導(dǎo)死亡受體Fas表達(dá)表達(dá)第42頁/共72頁第四十三頁，共73頁。C-mycC-myc雙向調(diào)控雙向調(diào)控(dio kn(dio kn) )凋亡凋亡 調(diào)控調(diào)控(dio kn(dio kn) )細(xì)胞周期基因，編碼的蛋白細(xì)胞周期基因，編碼的蛋白是是DNADNA結(jié)合蛋白，調(diào)控結(jié)合蛋白，調(diào)控(dio kn(dio kn) )基因轉(zhuǎn)錄?；蜣D(zhuǎn)錄。 GF GF充足時(shí)主要激活介導(dǎo)細(xì)胞增殖的基因充足時(shí)主要激活介導(dǎo)細(xì)胞增殖的基因 GF GF不足時(shí)激活凋亡基因不足時(shí)激活凋亡基因 第43頁/共72頁第四十四頁，共73頁。第44頁/共72頁第四十五頁，共73頁。第45頁/共72頁第四十六頁，共73頁

9、。第46頁/共72頁第四十七頁，共73頁。第47頁/共72頁第四十八頁，共73頁。第48頁/共72頁第四十九頁，共73頁。第49頁/共72頁第五十頁，共73頁。細(xì)胞凋亡在疾病防治中的意義細(xì)胞凋亡在疾病防治中的意義 合理合理(hl)(hl)利用凋亡相關(guān)因素利用凋亡相關(guān)因素1.1.誘導(dǎo)靶細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)靶細(xì)胞凋亡 放療、化療放療、化療 高熱、高溫高熱、高溫2.2.減少細(xì)胞凋亡減少細(xì)胞凋亡 ： NGF NGF、促生長因子、抗氧化劑、促生長因子、抗氧化劑抑制抑制Bcl-2Bcl-2抗凋亡抗凋亡(dio wn(dio wn) )作用作用促進(jìn)促凋亡促進(jìn)促凋亡(dio wn(dio wn) )基因作用基因作用增

10、強(qiáng)增強(qiáng)P53P53促凋亡促凋亡(dio wn(dio wn) )作用作用第50頁/共72頁第五十一頁，共73頁。 干預(yù)凋亡干預(yù)凋亡(dio wn(dio wn) )信號轉(zhuǎn)導(dǎo)信號轉(zhuǎn)導(dǎo) 調(diào)節(jié)凋亡調(diào)節(jié)凋亡(dio wn(dio wn) )相關(guān)基因相關(guān)基因 控制凋亡控制凋亡(dio wn(dio wn) )相關(guān)酶學(xué)機(jī)制相關(guān)酶學(xué)機(jī)制 防止線粒體跨膜電位的下降防止線粒體跨膜電位的下降第51頁/共72頁第五十二頁，共73頁。 細(xì)胞凋亡細(xì)胞凋亡(dio wn(dio wn) )的檢的檢測測 1、細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)及流式細(xì)胞術(shù)檢測、細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)及流式細(xì)胞術(shù)檢測 2、磷脂、磷脂(ln zh)酰絲氨酸外翻分析（酰

11、絲氨酸外翻分析（Annexin V法）法） 3、線粒體膜勢能（、線粒體膜勢能（mt）的檢測）的檢測 4、DNA片斷化檢測片斷化檢測 5、TUNEL法法 6、Caspase-3活性的檢測活性的檢測 7、凋亡相關(guān)蛋白、凋亡相關(guān)蛋白TFAR19的表達(dá)和細(xì)胞定位分析的表達(dá)和細(xì)胞定位分析 第52頁/共72頁第五十三頁，共73頁。1、細(xì)胞、細(xì)胞(xbo)凋亡的形態(tài)學(xué)檢測凋亡的形態(tài)學(xué)檢測光學(xué)顯微鏡和倒置顯微鏡光學(xué)顯微鏡和倒置顯微鏡 未染色細(xì)胞：凋亡細(xì)胞未染色細(xì)胞：凋亡細(xì)胞V變小、變形，細(xì)胞膜完整但出變小、變形，細(xì)胞膜完整但出現(xiàn)發(fā)泡現(xiàn)象，晚期可見凋亡小體?，F(xiàn)發(fā)泡現(xiàn)象，晚期可見凋亡小體。染色細(xì)胞：常用姬姆薩染色

12、、瑞氏染色、蘇木精染色等染色細(xì)胞：常用姬姆薩染色、瑞氏染色、蘇木精染色等。凋亡細(xì)胞的染色質(zhì)濃縮、邊緣化，呈新月狀附在核膜。凋亡細(xì)胞的染色質(zhì)濃縮、邊緣化，呈新月狀附在核膜周圍。周圍。熒光顯微鏡和共聚焦激光掃描顯微鏡熒光顯微鏡和共聚焦激光掃描顯微鏡一般以細(xì)胞核染色質(zhì)的形態(tài)學(xué)改變來評判一般以細(xì)胞核染色質(zhì)的形態(tài)學(xué)改變來評判(pngpn)細(xì)細(xì)胞凋亡的進(jìn)展情況。常用的胞凋亡的進(jìn)展情況。常用的DNA特異性染料有：特異性染料有：HO ,Hoechst 33342;HO, Hoechst 33258; DAPI。 電子顯微鏡觀察電子顯微鏡觀察第53頁/共72頁第五十四頁，共73頁。Nuclear morphol

13、ogical changes of HeLa cells in apoptosis process （488nm 400）第54頁/共72頁第五十五頁，共73頁。電鏡觀察電鏡觀察(gunch) 凋亡細(xì)胞體積變小，胞質(zhì)濃縮。凋亡凋亡細(xì)胞體積變小，胞質(zhì)濃縮。凋亡期期的細(xì)胞核內(nèi)染色質(zhì)高度盤繞，出現(xiàn)許多空泡的細(xì)胞核內(nèi)染色質(zhì)高度盤繞，出現(xiàn)許多空泡結(jié)構(gòu)。結(jié)構(gòu)。IIa染色質(zhì)高度凝集、邊緣化。凋亡晚染色質(zhì)高度凝集、邊緣化。凋亡晚期，細(xì)胞核裂解為碎塊，產(chǎn)生凋亡小體。期，細(xì)胞核裂解為碎塊，產(chǎn)生凋亡小體。 第55頁/共72頁第五十六頁，共73頁。 流式細(xì)胞術(shù)檢測流式細(xì)胞術(shù)檢測(jin c)：第56頁/共72頁第五十

14、七頁，共73頁。2 2、磷脂、磷脂(ln zh)(ln zh)酰絲氨酸外翻分析（酰絲氨酸外翻分析（Annexin VAnnexin V法）法）Phosphatidylserine(PS) Phosphatidylserine(PS) 正常位于細(xì)胞正常位于細(xì)胞(xbo)(xbo)膜的內(nèi)側(cè)，在凋亡早期從細(xì)胞膜的內(nèi)側(cè)，在凋亡早期從細(xì)胞(xbo)(xbo)膜的內(nèi)側(cè)翻轉(zhuǎn)到膜表面膜的內(nèi)側(cè)翻轉(zhuǎn)到膜表面Annexin-VAnnexin-V： Ca2+ Ca2+依賴性磷脂結(jié)合蛋白，能與依賴性磷脂結(jié)合蛋白，能與PSPS高親和力特異性結(jié)高親和力特異性結(jié)合。將合。將Annexin-VAnnexin-V進(jìn)行熒光素（進(jìn)行

15、熒光素（FITCFITC、R-PER-PE）標(biāo)記后作為）標(biāo)記后作為探針，利用流式細(xì)胞探針，利用流式細(xì)胞(xbo)(xbo)儀、熒光顯微鏡以及共聚儀、熒光顯微鏡以及共聚焦激光掃描顯微鏡檢測細(xì)胞焦激光掃描顯微鏡檢測細(xì)胞(xbo)(xbo)凋亡的發(fā)生。凋亡的發(fā)生。第57頁/共72頁第五十八頁，共73頁。2、磷脂、磷脂(ln zh)酰絲氨酸外翻分析（酰絲氨酸外翻分析（Annexin V法）法）第58頁/共72頁第五十九頁，共73頁。第59頁/共72頁第六十頁，共73頁。第60頁/共72頁第六十一頁，共73頁。第61頁/共72頁第六十二頁，共73頁。Apoptotic HeLa cells were s

16、tained with FITC-AnnexinV + PI第62頁/共72頁第六十三頁，共73頁。3、線粒體膜勢能、線粒體膜勢能(shnng)（mt）的）的檢測檢測 線粒體熒光染料：線粒體熒光染料：Rhodamine 123、DiOC6（3）、）、JC-1、TMRM等對線粒體膜電位非常敏感，其熒光的增強(qiáng)或減弱等對線粒體膜電位非常敏感，其熒光的增強(qiáng)或減弱(jinru)說明線粒體內(nèi)膜電負(fù)性的增高或降低。說明線粒體內(nèi)膜電負(fù)性的增高或降低。第63頁/共72頁第六十四頁，共73頁。4 4、DNADNA片段片段(pin dun)(pin dun)化分析化分析 細(xì)胞凋亡時(shí)染色質(zhì)DNA在核小體單位之間的連接

17、處斷裂, 形成(xngchng)180200bp整數(shù)倍的寡核苷酸片段, 在凝膠電泳上表現(xiàn)為梯形電泳圖譜(DNA ladder)。第64頁/共72頁第六十五頁，共73頁。5、TUNEL法法第65頁/共72頁第六十六頁，共73頁。第66頁/共72頁第六十七頁，共73頁。第67頁/共72頁第六十八頁，共73頁。6 6、CaspaseCaspase活性檢測活性檢測(jin c)(jin c)第68頁/共72頁第六十九頁，共73頁。第69頁/共72頁第七十頁，共73頁。7 7、凋亡相關(guān)蛋白、凋亡相關(guān)蛋白TFAR19TFAR19蛋白的表達(dá)蛋白的表達(dá) 和細(xì)胞定位分析和細(xì)胞定位分析 凋亡早期凋亡早期TFAR19TFAR19表達(dá)表達(dá)并出現(xiàn)并出現(xiàn)快速核轉(zhuǎn)位快速核轉(zhuǎn)位(zhun wi)(zhun wi)現(xiàn)象，伴隨著現(xiàn)象，伴隨著細(xì)胞核形態(tài)學(xué)的變化，持續(xù)較長時(shí)間，在細(xì)胞核形態(tài)學(xué)的變化，持續(xù)較長時(shí)間，在凋亡小體中仍然可見。凋亡小體中仍然可見。 利用熒光素（利用熒光素（FITCFITC）標(biāo)記的）標(biāo)記的TFAR19TFAR19單單克隆抗體為探針進(jìn)行克隆抗體為探針進(jìn)行TFAR19TFAR19蛋白的細(xì)胞定蛋白的細(xì)胞定位分析位分析 第70頁/共72頁第七十一頁，共73頁。Double staining analysis of nuclear localization ofT