幾種菌種的保存及復蘇方法之歐陽主創(chuàng)編

1、歐陽主創(chuàng)編2021.02.17幾種菌種的保管及蘇醒辦 法（含擴增辦法）按期移植法，亦稱傳代培養(yǎng) 收藏法，包含斜面培養(yǎng)、穿 刺培養(yǎng)、液體培養(yǎng)等。是指 將菌種接種于適宜的培養(yǎng) 基中，最適條件下培養(yǎng)，待 生長充分后，于斗6°C進 行保管并間隔一按時間進 行移植培養(yǎng)的菌種收藏辦 法。操縱步調(diào)如下：I培養(yǎng)基制備1.1器皿準備培養(yǎng)基制備過程中所 用的一些玻璃器皿，如三角 瓶、試管、培養(yǎng)皿、燒杯、 吸管等，經(jīng)洗滌、干燥、包 裝、滅菌后使用。12溶解培養(yǎng)基配料先在燒杯中放適量水,按培養(yǎng)基配方稱取各項資 料，依次將緩沖化合物、主 要元素、微量元素、維生素 等資料加入水中溶解，最后 加足水量，攪拌均勻。

2、1.1 調(diào) plK配料溶解后將培養(yǎng)基冷卻至室溫,根據(jù)要求加稀 酸（O.lmol/l鹽酸）或稀堿 （10%氫氧化鈉）調(diào)pH值。加酸或堿液時要緩慢、少 量、屢次攪拌，避免局部過 堿或過酸而招致丈量禁絕 確和營養(yǎng)成分被破壞。1/加凝固劑配制固體培養(yǎng)基時需 加凝固劑,如瓊脂、明膠等。 將凝固劑加入液體培養(yǎng)基中，加熱其實不竭攪拌至融 解，再補足所蒸發(fā)水分。1.5過濾分裝在二層紗布中間夾入 脫脂棉，將配好的培養(yǎng)基趁 熱過濾并分裝。斜面培養(yǎng)基 分裝量約為試管高度的四 分之一"5ml),穿刺培養(yǎng) 基分裝量以試管高度的二 分之一為宜。分裝過程中勿 使培養(yǎng)基沾污管口，以免弄 濕棉塞造成污染。1.6包扎標

3、識表記標幟將試管加棉塞，外面包 扎一層牛皮紙或鋁箔并注 明培養(yǎng)基名稱及配制日期。1.7滅菌根據(jù)要求將培養(yǎng)基滅 菌，通常蒸汽滅菌為121 °C, 15aOmino1.8斜面擺放滅菌后及時擺放斜面, 斜面長度不超出試管管長 的二分之一為宜。1.9無菌檢查將滅菌的培養(yǎng)基放入 培養(yǎng)箱中作無菌檢驗，通常 $0°C培養(yǎng)I$天。無菌檢 查合格后將其保管于C 下備用。2接種2-1斜面接種2-I-I點接把菌種點接在斜面中 部偏下方處。適用于擴散型 生長及絨毛狀氣生菌絲類 霉菌（如毛霉、根霉等）。212中央劃線從斜面中央自下而上 劃一直線。適用于細菌和酵 母菌等。幾|.$稀波狀蜿蜒劃線法 從斜

4、面底部自下而上 劃之字形線。適用于易 擴散的細菌，也適用于部分 真菌。2.1/密波狀蜿蜒劃線法 從斜面底部自下而上 劃密之字形線。能充分 利用斜面獲得年夜量菌體 細胞,適用于細菌和酵母菌等。2-1-5挖塊接種法挖取菌絲體連同少量培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)接到新鮮斜面 上。適用靈芝等擔子菌類真 菌。2.2穿刺接種用接種針從原菌種斜 面上挑取少量菌體，從柱狀 培養(yǎng)基中心自上而下刺入, 直到接近管底（勿穿到管 底），然后沿原穿刺途徑慢 慢抽出接種針。適用于細菌 和酵母菌等。a.j液體接種挑取少量固體斜面菌 種或用無菌滴管等吸取原 菌液接種于新鮮液體培養(yǎng) 基中。5培養(yǎng)將接種后的培養(yǎng)基放 入培養(yǎng)箱中，在適宜的條件 下培

5、養(yǎng)至細胞穩(wěn)按期或獲 得成熟抱子。細菌培養(yǎng)溫度 一般為5O-57 C,真菌培 養(yǎng)溫度一般為2528°C。培養(yǎng)好的菌種于列 6°C保管，根據(jù)要求每$6 個月移植一次。某些菌種, 如芽裂酵母，阿舒假囊酵 母，棉病囊霉等，須I$ 個月移植一次。收藏濕度用相對濕度 暗示，通常為50%70%。斜面菌種應收藏相繼 三代培養(yǎng)物以便對比，避免 因意外和污染造成損失。 液體石蠟收藏法亦稱礦物油收藏法按 期移植收藏法的幫助辦法。 是指將菌種接種在適宜的 斜面培養(yǎng)基上，最適條件下 培養(yǎng)至菌種長出健壯菌落 后注入滅菌的液體石蠟，使 其籠蓋整個斜面，再直立放 置于高溫（嗎6°C）干燥 處進行

6、保管的一種菌種收 藏辦法。操縱步調(diào)如下：I液體石蠟的準備選用優(yōu)質(zhì)化學純液體 石蠟，將液體石蠟分裝加 塞，用牛皮紙包好，采取以下兩種方法進行滅菌：121 C濕熱滅菌 50min,置斗0°C恒溫箱中 蒸發(fā)水分，經(jīng)無菌檢查后備 用。I60C干熱滅菌2個小 時，冷卻后，經(jīng)無菌檢查后 備用。2斜面培養(yǎng)物的制備 參照按期移植法。5灌注石蠟將無菌的液體石蠟在 無菌條件下注入培養(yǎng)好的 新鮮斜面培養(yǎng)物上,液面高 出斜面頂部Icm左右，使 菌體與空氣隔絕。沖收藏幾I注入液體石蠟的菌種 斜面以直立狀態(tài)置高溫（沖6°C）干燥處收藏， 收藏時間210年。幾2 收藏期間應按期檢 查，如培養(yǎng)基露出液面，

7、應 及時彌補無菌的液體石蠟。5恢復培養(yǎng)恢復培養(yǎng)時，挑取少量 菌體轉(zhuǎn)接在適宜的新鮮培 養(yǎng)基上，生長繁衍后，再重 新轉(zhuǎn)接一次。$標準菌的蘇醒、復壯及 標準蘊藏菌株的制備 $1物品及試劑：接種針、 酒精燈、移液管、75%酒 精及75%酒精棉球$2培養(yǎng)基改進馬丁瓊脂培養(yǎng)基$用于 黑曲霉蘇醒、復壯用于白 色念珠菌蘇醒、復壯.液體硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基$用 于生孑包梭菌蘇醒、復壯.營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基$用于金黃 色葡萄球菌、枯草芽孑包桿 菌、年夜腸埃希菌、乙型副 傷寒沙門菌、短小芽孑包桿 菌、銅綠假單胞菌蘇醒、復 壯。操縱步調(diào)：<1掀開潔凈工作臺。b在安甑的外概略用75% 的酒精擦拭并讓其自然風 干。6用一小砂

8、輪在安甑的上 部劃一條線,用手輕輕將安 甑掰開（開啟安甑時必須小 心，因為安甑遇熱時可能會 破裂）。<1以無菌辦法用一無菌吸 管從已準備好的上述液體培養(yǎng)基中移取0.50.8 ml到安甑中。輕輕地旋轉(zhuǎn)安甑以使凍 干菌種和液體培養(yǎng)基充分 混合并完全溶解。f用無菌吸管將安甑內(nèi)菌 液全部轉(zhuǎn)接到相應的液體 培養(yǎng)基。9根據(jù)安甑上所標明的不 合菌種類型而將其培養(yǎng)于 相應的溫度（細菌培養(yǎng)溫度 $055°C,培養(yǎng)182列 小時；真菌培養(yǎng)溫度2$ 28°C,培養(yǎng)$5天。觀察 是否渾濁，渾濁說明菌種蘇 醒生長；若不渾濁，細菌應 延長培養(yǎng)時間至7天，真菌 應延長培養(yǎng)時間至口天， 若仍未渾濁，

9、滅菌處理。h黑曲霉的菌懸液先室溫 待菌懸液融化后用無菌吸 管吸取管內(nèi)液體I2滴滴 在改進馬丁瓊脂斜面上，用 吸管涂布均勻，置2$28°C培養(yǎng)57天，斜面正 面為黑褐色厚絨狀,色澤均 一，不該有雜色，斜面正面 無色,接近菌層培養(yǎng)基略帶 黃色。確認后用含有0.05% (ml/ml)的吐溫 80 的0.9%無菌氯化鈉溶液洗脫到無菌試管中。i取經(jīng)蘇醒后的上述細菌 菌液810ml至液體培養(yǎng)基 中按9項操縱對菌種進行 復壯。以無菌技術(shù)向復壯后 的菌種中加入IOOml2O% 的無菌甘油混勻，"ml/管 分裝于凍存管。每個菌種制 備10支，按順序進行編號, 最后一支做為質(zhì)控管進行 質(zhì)量控制

10、，即進行相應簡直 認。其余作為蘊藏管。黑曲 霉的h項下洗脫液按h項下 辦法進行復壯，制成復壯后 的孑包子懸液20mlo以無菌 技術(shù)向復壯后的菌種中加 入20ml >10%的無菌甘油 混勻，12ml/管封存于凍存 管。制備10支，按順序進 行編號，最后一支做為質(zhì)控 管進行質(zhì)量控制，即進行相 應簡直認。其余作為蘊藏 管。將上述制備好的凍存管 逐支粘貼標簽。內(nèi)容包含: 菌種名稱、菌種代號、編號、 代次、制備日期、制備人、 貯存條件、有效期至等。 j蘊藏菌種管制備勝利， 貯存于一20C,有效期為菌種確認用無菌接種環(huán)從質(zhì)控管中 取細菌培養(yǎng)物接種到營養(yǎng) 瓊脂培養(yǎng)基平板上，或相應 的宜于該細菌生長的鑒

11、別 平板上，劃線別離出單個菌 落。然后在5O 55 C下培 養(yǎng)天；同樣的辦法取 真菌到玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng) 基平板，并在2548 C下培養(yǎng)7天；培養(yǎng)后，觀察其菌落形態(tài)，應合適該菌種形 態(tài)特征O $5污染處理假如在該平板上發(fā)明有其 他菌落生長，則說明或操縱 有污染或菌種不純。將此被 污染了的培養(yǎng)物滅菌處理。 可尋找原因重新別離挑選 純菌落轉(zhuǎn)接斜面菌種作為 第四代。偏重新制備蘊藏菌 種管$6菌種的傳代與收藏 將菌種接種至一新鮮培養(yǎng) 基上,每萌發(fā)一次即稱為一 代，因此，當原始菌種復溶 并轉(zhuǎn)至新培養(yǎng)基內(nèi)生長，即 認為已傳代一次，從菌種收 藏中心獲得的冷凍干燥的 菌種為第0代，冷凍干燥的 原始菌種開啟后轉(zhuǎn)種

12、后為 第I代，直到第5代為工 作菌種。菌種的傳代次數(shù)（自原始菌種凍干粉起）不 得超岀5代。菌種的傳代收藏過程項下標準菌的蘇醒為 傳第一代，復壯為第二代。傳第三代時取I支凍存管 自然解凍，將其轉(zhuǎn)接斜面菌 種作為工作用菌種。此時, 工作用菌種為第$代。工作 用菌種，分為兩類:一類用 于按期傳代(UH), 類用 于實驗用(«)o按期傳代用菌的傳代其操縱步調(diào)如下(斜面接種法):(1) 從冰箱冷藏室中取出 菌種斜面后，應在室溫放置 約$0分鐘。(2) 將裝有新鮮配制的培 養(yǎng)基菌種收藏管管壁上注 明菌名及接種日期，和傳代 菌種一并移入潔凈工作臺, 掀開紫外燈照射一小時。(5) 關(guān)閉紫外燈。撲滅酒

13、 精燈，左手握住菌種斜面, 將管口靠近火焰上方，右手 拿接種棒后端，將接種環(huán)燒 紅約$0秒，隨后將接種棒 金屬部分在火焰上燒灼，往 返通過三次。右手用無名指、小指 及掌部夾住管塞，左手將管 口在火焰上旋轉(zhuǎn)燒灼，右手 再輕輕拔開管塞，將接種環(huán) 伸入管內(nèi)先在近壁的瓊脂 斜面上靠一下，稍冷后再至 菌苔上，刮取少量菌苔，隨 即取岀接種棒并將菌種管 口移至火焰上方。(5)塞上管塞，左手將菌 種管放下，取營養(yǎng)瓊脂斜面 (或改進馬丁瓊脂斜面)一 支，照上述操縱掀開管塞, 將接種環(huán)伸入管內(nèi)至瓊脂 斜面的底部向上劃一條直 線，然后從底部向上作連續(xù) 曲線劃線，一直劃到斜面頂 端，使細菌接種在斜面的概 略上。(6)

14、 取出接種環(huán)，在火焰 上方將培養(yǎng)基管蓋上塞子, 然后將接種過細菌的接種 環(huán)在火焰上燒灼滅菌。(7) 將已接種好的細菌管 置I0 J5 C細菌培養(yǎng)箱培 養(yǎng)22Mh,真菌管置 2$28°C真菌培養(yǎng)箱最多 培養(yǎng)7天。當工作用菌種傳代代數(shù)小 于5時，可直接用上一代工 作用菌種轉(zhuǎn)接下一代工作 用菌種，如H （IU5）可直接 轉(zhuǎn)接為（UMI）。按上述法度 操縱，直至（UPI）轉(zhuǎn)為（IU5） 為止，需重新接種，舊的工 作菌種進行銷毀。菌種斜面的培養(yǎng)、收藏條件 及時間菌種培養(yǎng)條件及時間培養(yǎng) 基保管條件及時間 年夜腸埃希菌(CmCC(B)IO2) so 55 CMMh營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基2°C8

15、°C保管5 個月金黃色葡萄球菌(cmcc(B)a600s) so 55 CMMh營養(yǎng)瓊脂 培養(yǎng)基2°C8 °C保管5 個月枯草芽抱桿菌 (CmCC(B)6550l)50 55 CMMh營養(yǎng)瓊脂 培養(yǎng)基2°C8 °C保管5 個月銅綠假單胞菌 (OmOO(B)IOIOI) 50 J5 CM2砒營養(yǎng)瓊脂 培養(yǎng)基2°C8 °C保管1 個月乙型副傷寒沙門菌 (OmCO(B)5009l)50 55 C422砒營養(yǎng)瓊脂 培養(yǎng)基2°C8 °C保管5 個月生 抱 梭 菌 (CmOO(B)6WI) $0 55 C222砒營養(yǎng)瓊脂 培養(yǎng)基2°C8 °C保管5 個月白 色 念 珠 菌 (cmoc(r)98001) 25 28°C最多7天改進馬丁瓊 脂培養(yǎng)基2°C8 °C保管 $個月黑曲霉(cmcc(r)98ooi) 2$28°C最多7天改進馬 丁瓊脂培養(yǎng)基2°C- 8 °C 保管S個月短小芽抱桿菌 (CmCC(B)65602)10 J5 CM2砒營養(yǎng)瓊脂 培養(yǎng)基2°C8 &#