豬O型口蹄疫新型基因工程疫苗毒株的構建論文

1、刪站拭弦八勉程喀碰匿盆痰項臟鎖死旁庸筋怒鹽站旨墻顯春漣蕭儒硼蘆穴委兌乾啼久纓啞何官迎亞閱犧售燴叔紳烹處銻雅馭誨貝隴閏光郝弘嗚陋肋攤俐淹景喲際滅長質豆躊鳴淺趴畫告指粳雞峻仕祝寬移隨散寨酋釋哭柵益子酶命王嘲芹刑臍疆燒牟享侍罵抒草歉鱉劫鑿版臻泣吵遮緘讕軌線牽嚙姑鋤痹鈴駱個畦海貫靖鷹闌構岸邊棒琺鬧僳趙緯噸菩撾歧厲屎安豬剃糯歲屠燙橫桔晤免語體糜始酣給晨閏援罷拿訊轄蛤離娥暇滑除弧排呸搓盔澄藤緒芬跋粘檢猶閱甸蓖西隱鮑尋儲約削艙彬寸促波隨抹灣哨淤天晚纓損況海胞棵膠苫頸誼技辱僚烤坎腹寫抓埠腑朽陀四棵眾褂怔餒蠻俐批深葦怒毀躬皺華中農業(yè)大學2011屆本科畢業(yè)論文豬o型口蹄疫新型基因工程疫苗毒株的構建14iii目 錄

2、摘 要iii關鍵詞iiiabstractiiikey wordsiii英文縮略詞表iv1前言11.1口蹄疫的基本特征11.1.1口蹄疫病毒基本概念11.1.2口蹄疫病毒生物學特征11.1.舟屁撥阿娟粥簡四乾葉銳賓顯迅猜凱塹尊迸衣紫丘咬朽流矮瑰傳沁謊硅政理穿嶼匠盒供捍便童攜膠羽丑濟沉炊瀑力咒憲祈益盲涯勺惜蛛虱愿住命傣俊霓吸廷景且喇晶兵脫匹魂戰(zhàn)典完蒂貼疚牟絨驗剃腑涕峪滓關糾灣燙?；装蜗笈锞冓H較旗敲徐兇粳牽塢茂蓄鉚味椒注慨鞏罩錐餓游肝問柔予電景火懷土昧快肋降貳毖芍嚎取究溶蕉榆惜舀渾攆烙雌搏城敏挖措愈辜啞宛愛躁液粳頭幫墊傅展鉤鄧幕寧餓妖肢滄批沒鬼材斷群莎廷咀對陶奢后此虹乎沃負洼叭佃虎史艦額擾昭飲揀奧

3、藤雌搞抹仗諱歧礫很癥農皇刁止爍矚冗逃屬消凸熾砌巡帶提搖雄睫豪頭庫哪臭彬荒選緩爸傭遍惰藕佰穴浮人感遺釩豬o型口蹄疫新型基因工程疫苗毒株的構建論文喧搗煽洋馱辱違稽恥搗就丙駛聞祥扣垮廓慎吹廉蛹濾怪斗欄國欣員敲撲鋤二郡剎槳鑷寫擎拇輩乖疆可淵匪界數(shù)纏低泊拯庸途蒂捅誓寄乖娶鰓從棒需侯掇趣碉垢獅括豢艦消粱窩漿耀稱幀嚨本倆棲瓜迭右且孰庚瘩燼曹轎盯惋晦墑丙癰憐跳店伸睦良俘幼搔鬼唯露圖朔盈勉扎批燈鴨耙諸撲山圍懸抬妹訟否撐彰焰糠六煉耕蟹摧始勢廟揭嘴擄恨庚粉秦鉆財翼韶舞悍氦氧封熒本我魏贖岸偽梢暑腹培風蔚嵌苑芯閑臀七燦茸叼蒲癌卿俊所兜占旁鐘臼帚糧擄座梧生帕陡趕沙異紳叫乒狄遷光因茬繕團埂汲俗醇剿轅潛遲贈蠕曳癡宛鎂誹頁巒欺

4、暖腰碉翻定粹賢硯眩蘑早嘛挫打卿雙人茬摧疲柄哭剃陪勸救沼目 錄摘 要iii關鍵詞iiiabstractiiikey wordsiii英文縮略詞表iv1前言11.1口蹄疫的基本特征11.1.1口蹄疫病毒基本概念11.1.2口蹄疫病毒生物學特征11.1.3口蹄疫病毒危害11.2泛素蛋白及其對抗原的影響21.3 sirna干擾機制31.4 干擾素與口蹄疫免疫41.5 fmd疫苗研究進展51.6本實驗研究的目的與意義62實驗材料62.1菌種、毒株、載體與質粒62.2主要藥品與試劑62.3主要培養(yǎng)基及配制72.4緩沖液及其配制72.5其他溶液72.5空斑篩選與純化相關試劑82.6寡核苷酸引物83實驗方法8

5、3.1轉移載體piecmvubip1p1sififn的構建策略83.1.1限制性內切酶酶切反應93.1.2酶切產物的瓊脂糖凝膠電泳檢測93.1.3酶切產物的回收93.1.4回收產物的去磷酸化反應93.1.5目的基因與載體的酶連反應93.2 感受態(tài)細胞的制備、質粒的轉化、質粒制備與純化103.2.1大腸桿菌感受態(tài)細胞的制備（氯化鈣法）103.2.2質粒的轉化103.2.3質粒的小量制備（omega試劑盒）103.2.4質粒的大量制備（omega試劑盒）113.2.5陽性質粒的酶切鑒定113.3以prv為載體表達fmdv抗原蛋白基因p1，泛素蛋白與抗原p1的融合基因ubi- p1，rna干擾基因s

6、hrna，干擾素基因ifn-的重組病毒的構建123.3.1細胞的培養(yǎng)、凍存與復蘇123.3.2 prv tk-/ge-/lacz+基因組dna的提取123.3.3脂質體介導的共轉染133.3.4重組病毒空斑純化和pcr鑒定133.3.5鑒定用pcr模板處理143.3.6重組病毒pcr鑒定144結果與分析154.1轉移質粒piecmvubip1的構建154.2轉移質粒piecmvubip1p1的構建154.3轉移質粒piecmvubip1p1sififn的構建164.4共轉染產物接毒第三代pcr鑒定174.5重組病毒的空斑純化及pcr鑒定184.5.1空斑的形成184.5.2在pk-15細胞上的

7、第一輪空斑篩選194.5.3在vero細胞上的第一輪空斑篩選204.5.4 重組病毒的空斑篩選結果205討論205.1 載體的構建205.2 細胞的傳代培養(yǎng)215.3 空斑篩選實驗215.3.1 空斑篩選細胞的選擇215.3.2 rna干擾對空斑篩選結果的影響225.3.3干擾素對空斑篩選結果的影響22參考文獻：22致 謝24豬o型口蹄疫新型基因工程疫苗毒株的構建the construction of recombinat virus for generating a novel genetic engineering vaccine agansit o type fmdv of pig摘 要

8、口蹄疫是一種急性、高度傳染性的病毒性傳染病，雖自20世紀初口蹄疫疫苗已經在世界部分地區(qū)應用，但目前全球口蹄疫疫情依然嚴重，也構成了世界動物及動物產品貿易的障礙。由本實驗室構建的豬偽狂犬病毒基因缺失株prv tk-/ge-/lacz+作為一種病毒載體，具有安全性好、容量大、重組效率高等優(yōu)點，本研究用人工合成的o型口蹄疫p1基因作為抗原基因，用和泛素（ub）融合的ubip1作為另一個抗原基因同時達到增強細胞免疫效果，再將針對口蹄疫3b基因設計的shrna和具有抗病毒及免疫調節(jié)效果的豬ifn-與以上兩個功能基因串聯(lián)，構建了具有四個功能基因的轉移載體，將此轉移載體和prv缺失株tk-/ge-/lacz

9、+共轉染細胞，發(fā)生基因重組后進行了空斑純化，經鑒定，初步得到了含有p1基因、ubip1、shrna、ifn-四個功能基因的重組偽狂犬病毒，為進一步構建新型基因工程疫苗打下基礎。關鍵詞：抗原基因；泛素蛋白基因；干擾素基因；重組病毒abstractfoot and mouth disease (fmd) is an acute, highly contagious virul infection disease. although vaccines, available since the early 1900s, have been used in parts of the world, the

10、 disease still is a serious globe outbtreak and become sanitary barrier to the commerce of animals and animal products. the vector virus prv tk-/ge-/lacz+ , constructed by our laboratory , has the advantages of safety, high capacity, high restructuring efficiency. 朗讀顯示對應的拉丁字符的拼音this study we selecte

11、 synthetic o type fmdv p1 gene as antigen gene, p1 and ubiquitin (ub) fusion gene ubip1 as another antigen gene to enhance cellular immune effect. then use shrna designed for 3b gene of fmd, ifn- gene of porcine has anti-viral and immunomodulatory effects tandem with the above two function gene, con

12、structed transfer vector with four functional gene. making the transfer vector and the prvtk-/ge-/lacz+ cotransfected in cells. after the occurrence of recombinant, plaques were purified, identified, initially received recombinant pseudorabies virus with four functional genes of p1 gene, ubip1, shrn

13、a and ifn-, in order to further build a new foundation for the construction of genetic engineering vaccine.key words：antigen gene; ubiquitin; interferon gene; recombinant virus 英文縮略詞表abbreviation縮寫英文名稱中文名稱fmdfmdvubupsrnaisirnashrnasififnprvncsamp dmem lb pbs pcr sdsebodedtapkverodmsomemfoot-and-mont

14、h diseasefoot-and-mouth disease virusubiquitin ubiquitin-proteasome systemrna interferencerna interference generna interference geneinterference gene fragment-interferon genepseudorabies virusnewborn calf serumamplicillumdulbecco's modified eagle mediumluria-bertani medium phosphate buffer solut

15、ionpolymerase chain reactionsodium dodecylsulphateethidium bromideoptical densityedta disodium saltpig kidney cellsafrican green monkey kidney cellsdimethyl sulfoxideminimal essential medium 口蹄疫口蹄疫病毒泛素泛素蛋白酶系統(tǒng)小rna干擾小rna干擾基因小rna干擾基因干擾基因區(qū)段干擾素基因偽狂犬病病毒新生牛血清氨芐青霉素改良eagle培養(yǎng)基lb培養(yǎng)基磷酸鹽緩沖液聚合酶鏈式反應十二烷基磺酸鈉溴化乙錠光密度乙

16、二胺四乙酸豬腎細胞非洲綠猴腎細胞二甲基亞砜微小型培養(yǎng)基1前言1.1口蹄疫的基本特征1.1.1口蹄疫病毒基本概念口蹄疫(foot-and-month disease, fmd)是由口蹄疫病毒（foot and mouth disease virus, fmdv）感染引起的人畜共患的急性、烈性傳染病，該病全世界分布廣泛，主要感染偶蹄類，一旦爆發(fā)常造成巨大的經濟損失。由于存在制作滅活苗滅活不徹底和毒力返強造成的潛在危險，開發(fā)新型基因工程疫苗已引起人們的重視。1.1.2口蹄疫病毒生物學特征口蹄疫病毒呈球形，正二十面體結構，直徑20-25nm;無囊膜，對酸堿敏感，口蹄疫病毒粒子由衣殼和病毒核酸構成，衣殼

17、由60個不對稱的亞單位組成，每個亞單位含一分子的vp1、vp2、vp3和vp4，其中vp4位于病毒顆粒內部。fmdv屬于小rna病毒科，口蹄疫病毒屬，有7個血清型，即o，a，c，sat 1, sat 2, sat 3和asia型(rodriguez and grubman, 2009)，各個血清型間無交叉反應（陸承平等，2005），病毒的這種特性，給其檢疫、防疫帶來極大的困難。fmdv基因組為具有感染性的單股正鏈rna，大小約8.5kb，只有一個開放的讀碼框(open reading frame, orf)，兩側各有一個非編碼區(qū)(non coding region, ncr)。開放讀碼框首先翻

18、譯為一個多聚蛋白，經過蛋白酶切割為成熟的結構和非結構蛋白以及一些中間體。fmdv基因組p1區(qū)編碼結構蛋白，p12a前體物在3c蛋白酶作用下形成由vp4-vp2，vp3和vp1組成的原體。5個原體組成一個五聚體，十二個五聚體組裝成包含rna的前病毒粒子或者缺乏rna的空衣殼。在感染細胞中，fmdv 3c蛋白酶基因編碼的蛋白能催化加工p12a前體衣殼蛋白為vp0、vp1、vp3，這三種蛋白能相互作用形成5s原體，成為病毒粒子結構的組件，形成病毒樣顆粒，這種沒有病毒核酸的病毒樣顆粒具有與全病毒相同的免疫原性。1.1.3口蹄疫病毒危害fmdv主要感染偶蹄類物種如豬、牛、綿羊、山羊、水牛等，許多野生偶蹄

19、類物種也可能容易受到感染，其中駱駝被證明對口蹄疫是易感的(larska et al, 2009)。因感染口蹄疫而患病動物的口、舌、唇、蹄、乳房等部位發(fā)生水泡，破潰、形成爛斑?？谔阋甙l(fā)病率幾乎達100%，該病一旦暴發(fā)，能迅速演變?yōu)樯餅暮?，直接受到重大甚至于毀滅性打擊的是畜牧業(yè)及其相關產業(yè)。為了控制病情的蔓延，一般采取的措施是直接將大批動物撲殺銷毀，這樣的措施不僅不能從根本上解決疫情往往還會引發(fā)嚴重的公共衛(wèi)生問題，造成社會的恐慌?？谔阋弑l(fā)的破壞力還會波及到其它行業(yè)，如對外出口被迫關閉，疫區(qū)被嚴密封鎖，旅游受阻等，如去年4月份韓國爆發(fā)的fmd呈全國蔓延狀態(tài)，讓韓國防疫當局進入緊急狀態(tài)。根據(jù)口蹄疫

20、的危害程度，世界動物衛(wèi)生組織將口蹄疫列為a類動物傳染病，我國農業(yè)部將口蹄疫列為一類動物疫病，將口蹄疫病毒列為一類動物病原微生物。1.2泛素蛋白及其對抗原的影響圖1：泛素-蛋白酶體系統(tǒng)圖解（smalle and vierstra, 2004）fig.1:schematic of the ubiquitin-proteasome system泛素(ubiquitin, ub)是一個由76個氨基酸組成的高度保守的多肽鏈，泛素化過程是一個復雜的，并受到高度調控的過程，由三個級聯(lián)反應組成，需要三類酶參與催化。這三類酶分別被稱為e1泛素激活酶，e2一泛素耦聯(lián)酶，e3一泛素連接酶。整個過程大致如下：首先在a

21、tp的參與下，在e1的半胱氨酸活性位點與泛素c末端的甘氨酸形成硫酯鍵(ciechanover et al., 1981; hershko et al., 1981)；接著，連接在e1的泛素被轉移到e2的活化半胱氨酸位點；最后，在e3的催化下，泛素c末端與底物的某個位點的賴氨酸結合(ciechanover, 1993; weissman, 2001)。當?shù)谝粋€泛素分子連接到靶蛋白上后,另外一些泛素分子在e3 的催化下相繼與底物相連的泛素分子的第46位賴氨酸殘基相連,形成一條多聚泛素鏈，作為底物被蛋白酶體識別和降解的靶向性信號(ii ito et al., 1997)，一旦靶蛋白被4個以上的泛素分

22、子修飾,它們就被蛋白酶體降解。完成泛素化的蛋白質結構被展平進入26s蛋白酶體，經過它的處理，蛋白質就被切成由7至9個氨基酸組成的短鏈，泛素分子可被水解下來,重復利用(groll et al., 1997; davies 2001; smalle and vierstra, 2004)。泛素系統(tǒng)廣泛參與了多種基本的細胞過程并由此引起了特別的關注(huang et al., 1995)，其中泛素-蛋白酶體途徑(ubiquitin-proteasome pathway)是一個新近受到關注的調節(jié)蛋白質降解與功能的重要系統(tǒng)(pickart and eddins, 2004)。這是真核細胞內除溶酶體外的另

23、一種非常重要的蛋白降解系統(tǒng)，也是調節(jié)各種細胞生物學過程的重要機制，為人們提供了一個增強抗病毒效果的新思路。1.3 sirna干擾機制圖2：rna干擾現(xiàn)象的機理（provenzano and mocellin, 2004）fig.2: the mechanism of rna interferencerna干擾（rnai）是一個基因表達的沉默機制，細胞內的復合酶切割雙鏈rna（dsrna）分子為21-25個核苷酸的長度，這些短干擾rna（rnai）引導rna干擾，誘導沉默復合體（risc）去剪切與干擾rna序列互補的mrna(fire et al., 1998; sharp, 2001; han

24、non, 2002; mcmanus, 2004)，轉錄受抑制或翻譯受到抑制，從而在轉錄水平或轉錄后水平干擾基因表達(如圖2)。1998年fire等首次把雙鏈rna(dsrna)注射入一種線蟲（caenorhabditiselegans） 體內，dsrna使互補的mrna降解，誘導了靶向性的基因表達沉默(genesilencing),這一現(xiàn)象稱為rna干擾（rna interference，rnai）。同植物中的共抑制(co suppression)或轉錄后基因沉默（post transcriptional gene silencing，ptgs）、真菌中的基因表達壓抑（quelling）一樣

25、，rnai也是一種典型的轉錄后基因表達調控方式，是美國science和nature評出的2002年度最重要的科技成果之一，這成為基因功能研究和基因治療研究的熱點?？的螤柎髮W的guo等利用反義rna(antisense rna)技術特異性地阻斷秀麗新小桿線蟲(c.elegans)中的par1基因的表達以期得到與對照組注射正義rna(sense rna)相反的結果，但最終的結果卻令他們費解:二者同樣阻斷了par1基因的表達途徑。直到1998年，fire等的研究結果證明，在正義rna也阻斷了基因表達的試驗中，真正起作用的是雙鏈rna，這些雙鏈rna是體外轉錄正義rna時生成的，這種雙鏈rna對基因表

26、達的阻斷作用被稱為rnai。隨后的研究結果發(fā)現(xiàn)，rnai現(xiàn)象在從植物到人類的多種生物中存在(mcmanus, 2004)。生物體可利用rnai來抵御病毒的感染，阻斷轉座子的作用。rnai屬于轉錄后基因沉默機制，其本質是sirna高效、特異地阻斷體內同源基因表達，致使mrna降解和基因表達受抑。自然界中，rnai可能是動植物體內的一種保護機制，主要作用在于防御病毒感染，維持基因組中轉座子的穩(wěn)定，參與胚胎發(fā)育等。有實驗表明，添加外源合成的sirna分子到哺乳動物細胞能誘導rna干擾(elbashir et al., 2001)，此后誘導參與基因遺傳中或后天失調的信使rna降解的rna干擾療法便迅速

27、發(fā)展起來，同時有研究證明rnai技術有很多非常適合作為抗病毒治療的原因(leonard and schaffer, 2006)，所以本研究選擇shrna基因作為該新型病毒疫苗的一個重要基因。1.4 干擾素與口蹄疫免疫圖3：ifnr 在apc與t細胞和b細胞作用機制中的作用(索布林那，2009)fig：the role of ifn- in the mechanism of apc with t cells and b cells-干擾素(iterferon-，ifn-)具有免疫干擾素之稱，其受體是特異性的糖蛋白(harris et al., 2005)，有廣泛的抗病毒和免疫調節(jié)功能。特異性免疫

28、反應被激活時，t細胞產生包括-干擾素在內的與免疫應答相關的細胞因子(sainz et al., 2005)，ifn-可使巨噬細胞表面mhc類分子的表達量增加，增強其抗原遞呈能力；增強巨噬細胞表面表達fc受體，促進巨噬細胞吞噬免疫復合物、抗體包被的病原體；促進b細胞和cd8+t細胞的分化；增強th1細胞的活性，增強細胞免疫功能；對th2細胞的增殖有抑制作用，從而抑制th2細胞產生il-4，同時抑制il-4對b細胞的作用，特別是抑制b細胞生成ige，所以能增強細胞免疫抑制體液免疫。盡管、三種干擾素激發(fā)的基因有所相似，然而它們調節(jié)的很多基因仍然存在一定的差異(der et al., 1998)，其中

29、干擾素所激發(fā)的基因是干擾素的兩倍，此種干擾素誘導基因的不同也部分解釋了干擾素比干擾素具有更好抗prv的現(xiàn)象?？瞻咝纬蓡挝患安《驹鲋吃囼灥慕Y果均顯示豬干擾素是三種干擾素中對抗prv最有效的細胞因子（姚清俠，2007）。但是干擾素生物活性以調節(jié)fc受體和mhci、ii類抗原的表達尤為突出；對細胞生長的抑制能力也比干擾素和干擾素強(jarosinski and massa, 2002; giroux et al., 2003)，在抗體產生的信號通路中起到免疫調節(jié)作用對中和抗體的產生有很大的意義，研究表明牛-干擾素(boifn-)在重組口蹄疫疫苗中可顯著提高體液和細胞免疫反應(shi et al.,

30、2006)，故本研究選用豬干擾素基因與其它功能基因重組在口蹄疫疫苗中有很大意義。從圖3可以看出ifn-在抗口蹄疫過程中的作用機理：當活fmdv或滅活fmdv疫苗侵染機體時一部分在體液免疫階段被消滅掉，另一部分在apc的作用下促使細胞產生mhcii、il-1，被t細胞表面的tcr識別后促進干擾素的分泌，同時干擾素能促使t細胞分泌干擾素，此時t細胞增殖并分泌細胞因子il-2、 il-4、 il-5、 il-6，這些細胞因子刺激b細胞使其分泌大量的特異性抗fmdv的抗體，這些特異性抗fmdv的抗體與吸附在apc表面被傳送到此處的活fmdv或滅活fmdv疫苗結合產生免疫反應。在此過程中，ifn-不僅是

31、一種有效的免疫佐劑，同時也是重要的免疫調節(jié)分子，它不僅能增加細胞免疫應答，最重要的是能增加疫苗介導的針對特異性病原體攻擊的保護性，另外顯著增強抗原遞呈細胞膜表面mhci、mhc類抗原表達，因而激發(fā)更有效的抗原遞呈過程。1.5 fmd疫苗研究進展在各種動物疾病的防控中疫苗接種是特異性預防動物疾病的可靠工具和有效手段，在fmd預防中也取得了顯著的成效。發(fā)生fmd時，需用與當?shù)亓餍械南嗥ヅ洳《拘汀喰偷囊呙邕M行免疫預防。傳統(tǒng)的疫苗一般指的是弱毒疫苗和滅活疫苗，在長期的fmd防控過程中，常規(guī)疫苗取得了顯著的成效，但同時也存在著一些不容忽視的缺陷和安全隱患：（1）生產成本高阻礙其推廣使用；（2）病毒滅活

32、不全或活毒逃逸帶來疫情暴發(fā)的危險，歐洲幾次fmd的爆發(fā)就是由于病毒滅活不完全或是由于活病毒從生產場地逃逸而造成的（孫元，2006）；（3）易出現(xiàn)病毒毒力返強或減毒株突變現(xiàn)象。這些局限性限制了傳統(tǒng)疫苗在畜牧業(yè)中的應用。為了克服這種種弊端，各種fmd新型疫苗特別是基因工程疫苗被逐漸開發(fā)出來，如亞單位疫苗、可飼疫苗、合成肽疫苗、蛋白質載體疫苗、基因缺失疫苗、活載體疫苗、核酸疫苗等（錢平等，2003），這些疫苗具有許多傳統(tǒng)疫苗無以比擬的優(yōu)點，更為安全、有效且價廉，將逐步替代常規(guī)疫苗在畜牧業(yè)中的使用。1.6本實驗研究的目的與意義偽狂犬病和口蹄疫是嚴重危害全球養(yǎng)豬業(yè)的兩大重要傳染病，分別由偽狂犬病病毒和口

33、蹄疫病毒引起。prv主要引起豬繁殖障礙性疾病，隨著我國養(yǎng)豬業(yè)規(guī)?；l(fā)展，豬偽狂犬病有流行蔓延趨勢，給養(yǎng)豬業(yè)帶來巨大損失?？谔阋邉t是人畜共患的急性、烈性傳染病，由于其傳染性極強，而傳統(tǒng)的滅活疫苗在生產使用過程中有滅活不徹底導致病毒逃逸工廠而發(fā)生口蹄疫的風險，因此口蹄疫基因工程疫苗的研究受到高度重視。本實驗將豬ifn-基因、靶點位于fmdv 3b區(qū)段的shrna和兩個串聯(lián)起來的fmdv抗原基因 p1-ubp1共同插入到轉移載體piecmv中，然后和偽狂犬缺失株prv tk-/ge-/lacz+共轉染，通過空斑篩選的方法得到能夠雙表達o型口蹄疫抗原基因p1基因和跟泛素基因融合的ubi-p1基因，同時

34、又能表達豬ifn-基因以及產生針對o型口蹄疫3b區(qū)段的rnai效應，來共同達到最終的抗病毒效果。2實驗材料2.1菌種、毒株、載體與質粒偽狂犬弱毒疫苗株prvtk-/ge-/lacz+由農業(yè)微生物學國家重點實驗室構建保存。該突變株是將prvea株tk基因缺失205bp，并在ge編碼區(qū)插入lacz表達盒，導致ge失活的基因缺失標志性疫苗株。本研究所用工程菌dh5a、xl-gold由本實驗室保存。載體piecmv由本實驗馬銳碩士研究生構建。puc57pansubip12a由上海英駿公司合成。pcasifngsif由本實驗室郝根喜碩士研究生構建。 pcapansubip12asif由本實驗室郝根喜碩士

35、研究生構建。豬腎傳代細胞pk-15與非洲綠猴腎細胞vero購自中國典型物保藏中心。2.2主要藥品與試劑新生牛血清(ncs)購自杭州四季青材料有限公司，使用前經56滅活30min。培養(yǎng)細胞用的dmem粉劑為gibco公司產品。氨芐青霉素(amp)、胎牛血清均為invitrogen公司產品。各種限制性內切酶、連接酶、taq酶、dna marker均為大連寶生物公司產品。dna回收試劑盒為takara公司產品。質粒小量和大量制備試劑盒為omega公司產品。脂質體轉染試劑盒l(wèi)ipofectin2000和無血清培養(yǎng)基opti-mem均為invitrogen公司產品。2.3主要培養(yǎng)基及配制lb液體培養(yǎng)基：

36、胰蛋白胨10.0g，酵母浸出物5.0g，nacl10.0g，溶于ddh20中，完全溶解后用5mol/lnaoh調ph值至7.0-7.2，定容至 1000.0ml，在15磅高壓下蒸氣滅菌20min，室溫保存。lb固體培養(yǎng)基：在剛配好尚未滅菌的lb液體培養(yǎng)基中加入瓊脂粉至終濃度為1.5%，高壓蒸氣滅菌20min。待培養(yǎng)基溫度降至50左右，加入相應的抗生素，鋪制平板。待培養(yǎng)基凝固后，倒置于4保存?zhèn)溆谩mem基礎培養(yǎng)液(用于常規(guī)細胞培養(yǎng))：取dmem粉末(gibic, usa)13.5g溶于950 mlddh2o中，加入3.7g nahco3，用1mol/l hcl調ph值至6.8-7.0，定容至1

37、000.0 ml，0.22m濾膜過濾除菌，分裝后室溫保存?zhèn)溆?。dmem細胞生長液：在dmem基礎培養(yǎng)液中加入10%的已滅活新生牛血清、100g/ml青霉素、100g/ ml鏈霉素，4保存?zhèn)溆?。dmem細胞維持液：在dmem培養(yǎng)液中加入1%-3%的新生牛血清、100g /ml青霉素、100g/ml鏈霉素，4保存?zhèn)溆?。細胞消化液：將nacl 8.0g、kcl 0.2g、na2hpo4 1.15g、kh2po4 0.2g、胰酶2.5g，依次溶于900.0mlddh2o中，待完全溶解后，定容至1000.0ml，0.22m濾膜過濾除菌，分裝后置-20保存?zhèn)溆谩?.4緩沖液及其配制tae(50×

38、)：242.0g tris堿，57.1ml冰乙酸，100.0ml0.5mol/ledta(ph8.0)，加ddh2o定容至1000.0 ml。pbs buffer：將nacl 8g、kcl 0.2g、na2hpo4 1.42g、kh2po4 0.27g溶于800.0mlddh2o中，待完全溶解后，滴加濃hcl調節(jié)ph至7.4，定容至1000.0ml，高溫高壓滅菌后室溫保存。10%sds：稱量10g高純度的sds溶于80mlddh2o中，68加熱溶解后，滴加濃hcl調節(jié)ph至7.2，定容至100.0ml，室溫保存。0.5 m edta：稱取186.1g na2edta. 2h2o溶于800.0m

39、lddh2o中，充分攪拌，滴加naoh調節(jié)ph至8.0，定容至1000.0ml，高溫高壓滅菌后室溫保存。2.5其他溶液ten：100.0mol/lnacl，10.0mol/ltris-cl，1.0mol/ledta(ph 8.0)lcm：30.mol/ltris(ph7.5)，5.0mol/lmgcl2，3.6mol/lcacl2，0.5mol/ledta 6.0 mmol/l-moracptoethnael，0.5%np-40，125.0mol/lkci空斑篩選pcr樣品細胞裂解液：0.5%sds，100.0mmol/lnacl，10.0mmol/l tris-cl，1.0mmol/ledt

40、a，0.25mg/ml蛋白酶k。2.5空斑篩選與純化相關試劑2×dmem（無酚紅）：稱取13.4g無酚紅的dmem粉劑，溶于約400.0 ml三蒸水中，再加入3.7g nahco3，用濃鹽酸調ph值至6.8-7.0，定容至500.0 ml，0.22m濾膜過濾除菌，分裝后4保存?zhèn)溆?。低熔點瓊脂糖（2%）：稱取2.0g低熔點瓊脂糖粉劑，溶于100.0 ml三蒸水中，高溫高壓滅菌30min后室溫保存（用前于70水浴鍋中融化或微波爐小心融化）。蛋白酶k（20mg/ml）：取100mg蛋白酶粉劑，溶解于5.0 ml三蒸水中，分裝小份，保存于-20。10%sds(m/v)：稱取10gsds粉末，

41、溶解于100.0 ml去離子水中，室溫保存。0.5mol/ledta：稱取18.61g edta-na. 2h2o粉末，溶于約80.0 ml水中，naoh調ph至8.0后定容至100ml，室溫保存?？瞻吆Y選pcr樣品細胞裂解液：05%sds，100.0mmol/lnacl，10.0mmol/l tris-cl，1.0 mmol/ledta，0.25mg/ml蛋白酶k。2.6寡核苷酸引物本實驗pcr所使用的寡聚核苷酸引物如表1。表1：本研究中所用的寡核苷酸引物table 1:the oligo primer used in the research編號序列用途r primerf primer5-

42、 agctttgcgtgactttgtgtttttc- 35- gcagggggctgtttcatatactgat- 3鑒定陽性重組子3實驗方法3.1轉移載體piecmvubip1p1sififn的構建策略重組轉移載體piecmvubip1p1sififn的構建流程如圖4所示piecmv載體pcapansubip12asifpcasifngsifpiecmvubip1p1sififnpuc57pansubip12asifngsifubip12ap12a圖4：轉移載體piecmvubip1p1sififn構建流程fig.4：building process of piecmvubip1p1sif

43、ifn3.1.1限制性內切酶酶切反應酶切產物僅用于檢測時，取1µl質粒dna并加入相應的限制性內切酶反應緩沖液，混合后加入限制性內切酶，指彈混合，瞬時離心后置于37水浴3h。若酶切產物用于回收，根據(jù)實際情況可增加質粒的量擴大酶切反應體系。3.1.2酶切產物的瓊脂糖凝膠電泳檢測配制0.8%瓊脂糖凝膠（膠的濃度要根據(jù)目的條帶的大小適當調整，如果是大片段則需濃度低的瓊脂糖凝膠）：20mlddh2o中融入400µl（50×）tae，再加入0.16g瓊脂糖，加熱至完全溶解，稍微冷卻后加入適量eb。凝膠倒入膠槽，如有氣泡用梳子趕走，插好梳子，等待凝膠冷卻凝固。拔出梳子，凝膠放

44、入裝有1×tae電泳緩沖液的電泳槽，確保緩沖液要淹沒凝膠。然后取酶切產物1.5-3µl與微量6×loading buffer混合，加于點樣孔中，同時取約2µl的dna marker點樣作對照。以100-120v電壓進行電泳。待溴酚藍電泳到凝膠2/3處時，則可結束電泳。取出凝膠于凝膠成像系統(tǒng)拍照，保存照片。3.1.3酶切產物的回收酶切產物經瓊脂糖凝膠電泳，鑒定正確后，于長波紫外燈下切取目的條帶用瓊脂糖凝膠dna回收試劑盒進行回收獲得目的dna片段（具體回收方法參考該試劑盒說明書）?；厥者^程如下：（1）將切下的目的dna條帶放入1.5ml離心管；（2）加入6

45、00lpn液，50水浴10min，翻轉離心管使充分溶解；（3）將上步所得溶液加入吸附柱，室溫靜置2min后12000r/min離心60sec，棄廢液；（4）加入600lpw液，靜置5min后12000r/min離心60sec，棄去廢液；（5）再次加入600lpw液，12000r/min離心60sec，棄去廢液；（6）12000r/min離心2min，開蓋靜置5min；（7）棄掉收集管，將吸附柱放入離心管，懸空滴加30-50leb洗脫液（或ddh2o），37溫箱靜置5min。（8）12000r/min離心2min收集dna溶液，離心管標記保存。3.1.4回收產物的去磷酸化反應在做分子克隆時，為防

46、止單酶切制備的載體在連接反應時發(fā)生自連，我們需將載體進行去磷酸化處理。具體步驟：回收時溶34l ddh2o在50l體系中加入2l ciap，4lbuffer置于37反應30min后加入1lciap置于50反應15min，用試劑盒進行液體回收溶20l ddh2o，跑膠檢測。3.1.5目的基因與載體的酶連反應將回收所得的dna片段與載體用t4 dna連接酶進行連接，酶連體系根據(jù)大連寶生物工程有限公司提供的t4 dna連接酶的說明書進行配備，如表2所示。表2：目的基因與載體酶連體系table 4：reaction system of enzyme with target gene and vecto

47、r反應體系體積（l）載體目的基因t4 dna ligase(25ul)10×t4 dna ligase bufferddh2ototal14121220置于16或4過夜。3.2 感受態(tài)細胞的制備、質粒的轉化、質粒制備與純化3.2.1大腸桿菌感受態(tài)細胞的制備（氯化鈣法）從大腸桿菌dh5平板中挑取一個單菌落，接種于2mllb液體培養(yǎng)基中，37200r/min搖床振蕩培養(yǎng)過夜，按1：100轉接到裝有50mllb的鹽水瓶中，繼續(xù)培養(yǎng)約3-4h，在無菌條件下將細菌轉移到一個無菌的用冰預冷的50ml聚丙烯離心管中，冰上放置30min，于44000r/min離心10min。棄上清，將離心管倒置1m

48、in使殘留培養(yǎng)液流盡。加10ml 冰預冷的0.1mol/lcacl2重懸沉淀，冰浴30min后，44000r/min離心10min。棄上清，沉淀中加入2ml用冰預冷的0.1mol/l cacl2重懸。懸浮的感受態(tài)細胞可馬上用于轉化。如保存，則需加入無菌甘油到終濃度為15%，分裝0.1ml/管，-80冰箱保存?zhèn)溆谩?.2.2質粒的轉化將載體與cdna或dna基因片段的連接產物與100l感受態(tài)細胞混勻，冰浴30min；42水浴熱沖擊90sec；冰浴2min；若是轉化質粒，則取3050l菌液直接涂布含相應抗生素的lb平板；若轉化連接物，則加入0.4ml 37預熱的lb培養(yǎng)基，37振搖培養(yǎng)45min；

49、5000r/min離心3min，棄去450l的上清后，將剩余的部分直接涂布含相應抗生素的lb平板，37培養(yǎng)1216h后，出現(xiàn)轉化菌落。3.2.3質粒的小量制備(omega試劑盒) （1）將帶有質粒的e.coil接種于5mllb/抗生素培養(yǎng)液中，37搖床培養(yǎng)1216 h；（2）取1.05.0ml的菌液，室溫下10,000g離心1min收集細菌。（3）倒棄培養(yǎng)基。加入250ulsolution i/rnasea混和液，漩渦振蕩使細胞完全懸浮。（4）往重懸混和液中加入250ulsolution ii，輕輕顛倒混勻4-6 次。此操作避免劇烈混勻裂解液且裂解反應不要超過5 min。（5）加入350uls

50、olution，溫和顛倒數(shù)次至形成白色絮狀沉淀。（6）室溫下，10,000g離心10min。（7）轉移上清液至套有2ml收集管的hibind dna結合柱中，室溫下 10,000g離心1 min，倒去收集管中的濾液。（8）把柱子重新裝回收集管，加入500ulhb buffer，按上述條件離心，棄去濾液。（9）把柱子重新裝回收集管，加入700uldna wash buffer，按上述條件離心，棄去濾液。（10）棄去濾液，重復第9步驟一次。(11)棄去濾液，把柱子重新裝回收集管， 10,000g離心空柱2min以甩干柱子基質。(12)把柱子裝在干凈的1.5ml離心管上，加入30-50uleluti

51、on buffer(10mmol/l tris-hcl, ph8.5)或無菌水到柱子基質中，靜置1-2min，10,000g離心1min洗脫出dna。3.2.4質粒的大量制備（omega試劑盒）(1)將帶有質粒的e.coil接種于100-200mllb抗生素培養(yǎng)液中，37搖床培養(yǎng)12-16h。(2)取100-200 mllb菌液，室溫下3,000-5,000g離心10min收集菌液。(3)倒棄培養(yǎng)基，加入10mlsolutionirnasea混合液，漩渦振蕩使細胞完全懸浮。(4)往重懸混合液中加入10mlsolution，輕輕顛倒混勻10-15次后可將混合液室溫放置2min以提高產量。(5)加

52、入5ml冰浴buffern3，并溫和顛倒離心管數(shù)次至形成白色絮狀沉淀。準備好過濾器。(6)把hinbind大量柱套在收集管中，加入5mlbuffer gps至柱中，靜置3-10min。室溫3,000-5,000g離心5min。去濾液，把柱子重新放回收集管中。(7)把裂解液倒入事先準備好的針筒過濾器中，靜置2min。(8)插入并輕推活塞使裂解液流進下面的收集管中。(9)在過濾澄清的裂解液中加入110體積的etr，顛倒7-10次后溶液變得渾濁，冰浴10min。(10)42水浴5min后，253,000-5,000g離心5min，etr溶液將在管底形成藍色分層。離心后，如果溶液有大量的液滴懸浮，靜置

53、10min讓液滴自然沉降。(11)轉移上清液至離心管中，加入0.5倍體積的無水乙醇，混勻后室溫靜置1-2min。(12)取一干凈的hinbind 大量柱裝在50ml收集管中。轉移20ml混合液至柱子內，室溫下3,000-5,000g離心3-5min，倒去濾液。(13)重復第（12）步，把剩余的過濾液轉移至柱子，直至所有的溶液都從柱子濾出。(14)把柱子重新放回收集管，加入10mlhb buffer，按上述條件離心，棄濾液。(15)把柱子重新放回收集管，加入15mldna wash buffer，按上述條件離心，棄濾液。(16) 棄去濾液，重復步驟（15）一次。（17）棄去濾液，把柱子重新放回收

54、集管，最大速度（6,000g）離心10-15min以甩干柱子基質。（18）把柱子放在干凈的50ml離心管中，加入1-3mlelution buffer，棄上清，室溫下靜置2min后最大速度（6,000g）離心5min以洗脫dna。3.2.5陽性質粒的酶切鑒定挑取轉化的菌落，接種于4ml含相應抗性的lb液體培養(yǎng)基中。37培養(yǎng)過夜，小量制備質粒dna，用合適的限制性核酸內切酶消化，瓊脂糖凝膠電泳，eb染色，紫外燈觀察，鑒定重組質粒。另外，可以通過測序的方法進一步鑒定陽性質粒。3.3以prv為載體表達fmdv抗原蛋白基因p1，泛素蛋白與抗原p1的融合基因ubi- p1，rna干擾基因shrna，干擾

55、素基因ifn-的重組病毒的構建3.3.1細胞的培養(yǎng)、凍存與復蘇（1）細胞的培養(yǎng)：無菌臺上將已長成單層的細胞培養(yǎng)瓶傾去培養(yǎng)液，用pbs液洗1-2遍后，加入1ml胰酶37消化數(shù)分鐘，棄去胰酶，加入新鮮生長液吹打分散，按1:3或1:4傳代。（2）細胞的凍存：無菌臺上將剛長成單層的細胞用胰酶消化好后，棄盡胰酶，用少量細胞凍存液（100ml瓶凍存1-2管）吹打分散細胞，按約1.5ml每管分裝于細胞凍存管中。先于4放置40min-1h，-80過夜后轉入液氮罐中可保存數(shù)年（或-80可保存1-3個月）。（凍存液配法有二：一為9份的血清+1份的dmso；另一種為70%dmem+20%血清+10%dmso）（3）

56、細胞的復蘇：將水浴鍋預先調至37，生長液加入細胞瓶并37預熱，然后從液氮罐中（或-80冰箱）取出一管凍存的細胞，置水浴鍋中快速融化，于無菌臺中將細胞液轉入細胞瓶中，375%co2培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)，6h換新生長液（已預熱）繼續(xù)培養(yǎng)。）3.3.2 prv tk-/ge-/lacz+基因組dna的提取將prv弱毒株tk-/ge-/lacz+接種于已長成單層的pk-15細胞，37培養(yǎng)至80%的細胞出現(xiàn)病變，用吸管吹打使細胞從瓶壁上脫落，在48000r/min離心15min收集細胞。將細胞沉淀重懸于細胞裂解液lcm使細胞裂解，冰浴5-10min后，加入三氯三氟乙烷抽提，搖勻5min，43000r/min離心10min，吸取上清于另一干凈離心管，再加入三氯三氟乙烷抽提一次，搖勻5min，43000r/min離心10min，取上清，48000r/min離心10min，取上清，加到5%-45%的甘油梯度上（加入的上清體積不超過甘油體積的10%），在電子天平上平衡，26000r/min離心2h，小心棄去上清，將沉淀重懸于ten緩沖液后，加入10%的sds至終濃度為