白芨組織培養(yǎng)實(shí)施方法

1、白及組織培養(yǎng)實(shí)施方案一、白及簡介白及為蘭科白及屬多年生草本植物，又名甘根、連及草、地螺絲、羊角七、餓口藥、利知子、 刀口藥、魚眼蘭等。分布在中國、日本以及緬甸北部，主產(chǎn)于貴州、四川、湖南、湖北、安徽、河 南、浙江、陜西等地。其味苦、甘、澀，性涼，歸肺、胃、肝經(jīng)。以塊莖供藥用，能收斂止血，消月中 生??；治肺結(jié)核咳血，支氣管擴(kuò)張咯血、胃潰瘍吐血、尿血、便血等癥。外用治外傷出血、燒燙傷、 手足軟裂等癥。塊莖含黏液質(zhì)和淀粉等，可作糊料，在生物醫(yī)藥、保健食品、紡織印染、特種涂料 和日用化工等方面有巨大的商業(yè)利用價值。又因白及為地生蘭的一種，花開艷麗，被作為庭院、居室及園林景觀綠化苗木大量應(yīng)用。白及一般生

2、于海拔1103200m的山野、山谷較潮濕處或林下半遮陰地帶，喜溫暖、稍陰濕 的環(huán)境，耐陰性強(qiáng)，忌強(qiáng)光直射，需排水良好、富含腐殖質(zhì)的砂質(zhì)土壤，稍耐寒，冬季可在地下越 冬。白及能產(chǎn)生大量的種子（每個痂果1030萬粒），但這些種子沒有胚乳，自然萌發(fā)率極低，繁 殖困難，但白及胚的薄壁細(xì)胞貯存大量的蛋白質(zhì)、 油脂和碳水化合物，可作為種子萌發(fā)的營養(yǎng)成分， 因此白及種子在保濕的情況下可以萌發(fā)， 是蘭科植物中種子易萌發(fā)的類型。 傳統(tǒng)的白及繁殖方法大 多以分株為主，即將塊莖分成小塊種植， 但繁殖系數(shù)低，大面積發(fā)展對種源消耗大，不宜推廣且難 以滿足市場需求。采用白及組織培養(yǎng)可在短時間內(nèi)大量獲取種苗， 且成本相對較

3、低，是提高白及產(chǎn)量的強(qiáng)有力措 施。目前，國內(nèi)研究資料報道的白及組織培養(yǎng)方法各異， 所采用的外植體各不相同，且培養(yǎng)基及其 中所加的植物生長調(diào)節(jié)劑種類和規(guī)格也千差萬別。二、白及組織培養(yǎng)技術(shù)路線參照植物組織組織培養(yǎng)獲得再生植株的方式， 可通過4種途徑獲得白及再生植株：一是由愈傷 組織形成不定芽再生植株；二是愈傷組織產(chǎn)生胚狀體而再生植株； 三是由側(cè)芽或頂芽再生植株；四 是由莖尖產(chǎn)生原球莖而再生植株。4種方式各有利弊，傳統(tǒng)認(rèn)為采用側(cè)芽或頂芽發(fā)育途徑獲得的后 代性狀較穩(wěn)定，但因?yàn)榘准霸蚯o帶有大量共生菌，組培過程中容易出現(xiàn)污染。結(jié)合盧氏當(dāng)?shù)貙?shí)際，探索采用白及無菌播種的技術(shù)路線， 通過不同濃度和培方的培養(yǎng)基

4、實(shí)現(xiàn)白 及組織培養(yǎng)的最佳技術(shù)路線，建立白及快繁體系。白及組織培養(yǎng)完整的技術(shù)路線如下：經(jīng)過試驗(yàn)優(yōu)化后的技術(shù)路線為：白及一種子 （采集優(yōu)質(zhì)種源痂果）一表面消毒一無菌播種 （MS 培養(yǎng)基等）一原球莖（分化誘導(dǎo)）一白及小苗（分株、擴(kuò)繁）一壯苗生根（煉苗）一完整小植株一 煉苗20-25大一移栽一白及精心整理三、實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備:種子：白及的痂果中有大量的種子，并且痂果的消毒較方便，污染率低。另一方面用種子作 為外植體操作較容易，并且組培過程中萌發(fā)率高，培養(yǎng)的幼苗生長較為迅速，因此，種子作為外植體應(yīng)用比較廣泛，大部分的組培研究都選用種子。本實(shí)驗(yàn)選取盧氏本地優(yōu)質(zhì)白及(Bletillastriata (Thunb.

5、)Reichb. f.)痂果，采收時間為8月下旬至9月中旬,此時間段胚齡大約 為第8周至第22周。器材：高壓滅菌鍋、超凈工作臺、電子分析天平(精度為千分之一)、電磁爐、接種消毒器、 高效能培養(yǎng)架、醫(yī)用小推車、日光燈、加濕器、紫外燈、晾瓶架、酸度計(或PH試紙)、試管、容量瓶、膠頭滴管、試劑瓶、燒杯、試管架、量筒、玻璃漏斗、移液管、三角瓶、廣口培養(yǎng)瓶、稱 量紙、毛刷、洗耳球、塑料筐、無菌脫脂棉、無菌濾紙、酒精燈、噴壺、橡膠手套、醫(yī)用白大褂、 紫外燈、銀子、接種針、剪刀、解剖刀、器械架、接種托盤等。(1)通用器械燒杯：用來盛放、溶解化學(xué)藥劑等。常用的規(guī)格有 50mL 100mL 250mL 500

6、mL 1000mL 烘箱：用來烘干器械。恒溫水?。河脕砣芙猸傊任镔|(zhì)。玻璃攪拌棒：用來配制培養(yǎng)基。洗耳球：用來輔助吸取、轉(zhuǎn)移少量液體。冰箱：用來貯存化學(xué)藥劑、植物材料等。牛角勺：用來轉(zhuǎn)移化學(xué)藥劑。玻璃漏斗：用來過濾溶液。剪刀：用來修剪外植體或剪切嫩莖。器械架：在無菌操作期間用來放置滅菌的器械。(2)各種盛具搪瓷淺盤：用來承載各種器械容器。塑料盆：用于清洗培養(yǎng)容器。鐵絲筐：用來盛放滅菌容器等物品。純水水桶：用來存放去離子水或蒸儲水。常用的規(guī)格有10L、20L。塑料桶：用來存放洗滌溶液、廢棄溶液。各種規(guī)格的磨砂玻璃瓶：用來盛放培養(yǎng)母液，以及各種植物生長物質(zhì)。(3)計量器械量筒：用來量取一定體積的液

7、體。常用的規(guī)格有 25mL 50mL 100mL 500mL 1000mL精心整理容量瓶：用來配制標(biāo)準(zhǔn)溶液。常用的規(guī)格有 50mL 100mL 500mL 1000mL大肚移液管：用來吸取定量溶液。常用的規(guī)格有1mL 5mL 10mL刻度移液管：用來吸取定量植物生長物質(zhì)溶液。常用的規(guī)格有1mL 5mL 10mL域可用移液器替換)。移液管架：用來放置、固定移液管。酸度計：用來檢測培養(yǎng)基的pHt藥物天平：用來稱取配制培養(yǎng)基的藥品。分析天平：用來稱取少量有化學(xué)試劑，進(jìn)行化學(xué)分析。(4)滅菌器械磨砂口玻璃瓶：用來對植物材料進(jìn)行表面滅菌。酒精燈：用來進(jìn)行接種器材的表面滅菌。細(xì)菌過濾器：用來過濾不能進(jìn)行高

8、溫滅菌的試劑溶液。無菌濾紙：用來汲取器材、植物材料表面的水分。無菌脫脂棉：用來進(jìn)行器械、植物材料表面的滅菌處理。高壓滅菌鍋：對培養(yǎng)基、接種器材進(jìn)行滅菌處理。紫外線滅菌燈：用來對接種室、培養(yǎng)室、操作室等工作環(huán)境進(jìn)行滅菌處理。(5)接種器械超凈工作臺：用來過濾通過接種工作臺面的空氣，以便進(jìn)行無菌操作。小型噴霧器：裝載滅菌藥液，來給超凈工作臺等處噴霧滅菌。鈍頭銀子：在接種操作、繼代培養(yǎng)時移取植物材料。尖頭銀子：用來分離植物材料。解剖刀：用來切割植物材料。接種針：用來轉(zhuǎn)移細(xì)胞團(tuán)、愈傷組織。(6)培養(yǎng)器械試管：用來作為外植體的培養(yǎng)容器。常用的規(guī)格有2cmx 15cm 3cmx 15cm培養(yǎng)皿：用來作為外

9、植體的培養(yǎng)容器。常用的規(guī)格有直徑9cm 12cmi錐形瓶：即三角燒瓶，主要作為培養(yǎng)器材，常用的規(guī)格有50mL 100mL鋁箔：用于培養(yǎng)容器封口。橡皮筋：用來束緊培養(yǎng)容器的封口材料?？照{(diào)：用來調(diào)節(jié)操作問、培養(yǎng)室的溫度。精心整理藥劑：硝酸?。∟H4NO3、硝酸鉀（KNO3、氯化鈣（CaCl2）、硫酸鎂（MgSO4?7H2O 磷 酸二氫鉀（KH2PO4、碘化鉀（KI）、硼酸（H3BO3、硫酸鈕（MnSO4?5H2O 硫酸鋅（ZnSO4?7H20、 鋁酸鈉（Na2MoCH 硫酸銅（CuSO4?5H2O氯化鉆（CoCl2?6H2Q、乙二胺四乙酸二鈉（Na2EDTA?2H2O 硫酸亞鐵（FeSO4?7H2

10、D、甘氨酸（C2H5NO2、肌醇（C6H12O6、煙酸（VB5、鹽酸叱哆醇（VB6）、 鹽酸硫胺素（VBD、6-甲基腺喋吟（6-BA）、蔡乙酸（NAA、腺口g吟（AD、赤霉酸（CA3、 蔗糖、瓊脂環(huán)境：采用組培快繁技術(shù)進(jìn)行白及的工廠化生產(chǎn)，包括外植體的篩選及獲取、外植體滅菌誘導(dǎo)培養(yǎng)、無菌材料繁殖、繼代擴(kuò)繁、單株生根、出瓶煉苗、移栽等工藝程序。由于組培苗生產(chǎn)從進(jìn)瓶 到出瓶都是在無菌條件下完成，所以離不開一個無菌環(huán)境，但實(shí)驗(yàn)室的規(guī)模大小需依據(jù)生產(chǎn)規(guī)模來 確定。組培實(shí)驗(yàn)室具體設(shè)計包括：1、準(zhǔn)備室：（1）進(jìn)行藥品、器具和實(shí)驗(yàn)材料的保存、消毒以及培養(yǎng)基的配制、滅菌、分裝等。 器具的洗滌、干燥、消毒、儲藏

11、。（3）生理生化指標(biāo)的測定等。2、接種室：進(jìn)行材料的接種，內(nèi)置超凈工作臺，加裝紫外線燈滅菌。外設(shè)緩沖間放置拖鞋、 工作服、工作帽等。3、培養(yǎng)室：開展白及幼苗的無菌生長提供場所，室內(nèi)需要有培養(yǎng)架及控制溫度、濕度、光照 的各種設(shè)備。四、實(shí)驗(yàn)流程1.準(zhǔn)備階段查閱相關(guān)文獻(xiàn)，結(jié)合實(shí)際制訂白及組織培養(yǎng)實(shí)施方案， 根據(jù)實(shí)驗(yàn)方案配制實(shí)驗(yàn)所需的消毒劑和 各類母液，確定不同培養(yǎng)階段培養(yǎng)基配方。MS®養(yǎng)基與其它培養(yǎng)基的基本成分相比，硝酸鹽、鉀和俊的含量高，有較高的無機(jī)鹽濃度， 無機(jī)養(yǎng)分的數(shù)量和比例比較合適，足以滿足植物細(xì)胞在營養(yǎng)上和生理上的需要， 對保證組織生長所 需的礦質(zhì)營養(yǎng)和加速愈傷組織的生長十分有利

12、。MS固體培養(yǎng)基可用來誘導(dǎo)愈傷組織，或用于胚、莖段、莖尖及花藥培養(yǎng)，是目前普遍使用的培養(yǎng)基。白及組培選取的培養(yǎng)基即為MS®養(yǎng)基。配制培養(yǎng)基可分為以下幾步：（1）制備母液為了避免每次配制培養(yǎng)基都要對幾十種化學(xué)藥品進(jìn)行稱量， 應(yīng)該將培養(yǎng)基中的各種成分，按原 量10倍、100倍或1000倍稱量，配成母液。這樣，每次配制培養(yǎng)基時，取其總量的 1/10、1/100、 1/1000,加以稀釋，即成培養(yǎng)液。M“養(yǎng)基主要包含5種主要成分：大量元素：大量元素包括硝酸俊等用量較大的幾種化合物。制備時， 按表中排列的順序，以其 10倍的用量，分別稱出并進(jìn)行溶解，以后按順序混在一起，最后加蒸儲水，使其總量達(dá)

13、到1L,此即大量元素母液。微量元素：因用量少，為稱量方便和精確起見，應(yīng)配成 100倍或1000倍的母液。配制時，每 種化合物的量加大100倍或1000倍，逐次溶解并混在一起，制成微量元素母液。鐵鹽：鐵鹽要單獨(dú)配制。由硫酸亞鐵(FeSO4 7H2O)5.57g和乙二胺四乙酸二鈉(Na-EDTA)7.45g溶于1L水中配成。每配1L培養(yǎng)基，加鐵鹽5mL有機(jī)物質(zhì)：主要指氨基酸和維生素類物質(zhì)。它們都是分別稱量，分別配成所需的濃度(0.11.0mg/mL),用時按培養(yǎng)基配方中要求的量分別加入。植物激素：最常用的有生長素和細(xì)胞分裂素。這類物質(zhì)使用濃度很低，一般為0.0110mg/L?？砂从昧康?00倍或1

14、000倍配制母液，配制時要單個稱量，分別貯藏。配制植物生長素時，應(yīng)先 按要求濃度稱好藥品，置于小燒杯或容量瓶中，用 1mol/L氫氧化鈉溶解，再加蒸儲水稀釋至所需 濃度。配制細(xì)胞分裂素時，應(yīng)先用少量 1mol/L的鹽酸溶解，然后加蒸儲水至所需量。以上各種混合液(母液)或單獨(dú)配制藥品，均應(yīng)放入冰箱中保存，以免變質(zhì)、長霉。至于蔗糖、 瓊脂等，可按配方中要求，隨稱隨用。1 2)配制培養(yǎng)基的具體操作根據(jù)配方要求，用量筒或移液管從每種母液中分別取出所需的用量，放入同一燒杯中，并用 粗天平稱取蔗糖、瓊脂放在一邊備用。將中稱好的瓊脂加蒸儲水300400mL加熱并不斷攪拌，直至煮沸溶解呈透明狀，再停 止加熱。

15、將中所取的各種物質(zhì)(包括蔗糖)，加入煮好的瓊脂中，再加水至L,攪拌均勻，配成培養(yǎng) 基。用1mol/L的氫氧化鈉或鹽酸，滴入中的培養(yǎng)基里，每次只滴幾滴，滴后攪拌均勻，并用 PH試紙(或酸度計)測其PH值，直到將培養(yǎng)基的PH值調(diào)到5.8-6.0 。將配好的培養(yǎng)基，分裝到組培瓶中，蓋好瓶蓋并做好標(biāo)記，瓶中培養(yǎng)基的量約為20-25mLo培養(yǎng)基的成分比較復(fù)雜，為避免配制時忙亂而將一些成分漏掉，可以準(zhǔn)備一份配制培養(yǎng)基的成 分單，將培養(yǎng)基的全部成分和用量填寫清楚。配制時，按表列內(nèi)容順序，按項(xiàng)按量稱取，就不會出 現(xiàn)差錯。2 3)培養(yǎng)基 的滅菌與保存培養(yǎng)基配制完畢后，應(yīng)立即滅菌。培養(yǎng)基通常應(yīng)在高壓蒸汽滅菌鍋內(nèi)，

16、在壓力 0.1-0.15Mpa、 溫度122c條件下，滅菌1520min。期間需排出滅菌鍋內(nèi)的冷空氣，具體操作方法為：通電后， 待壓力上升到0.05MPa時，打開放氣閥，放出冷空氣，待壓力表指針歸零后，再關(guān)閉放氣閥。滅菌后的組培瓶取出后整齊擺放在室內(nèi)，2h后即可冷卻凝固成白色半透明狀固體，經(jīng)過滅菌 的培養(yǎng)基要在配制后的一周內(nèi)使用完，在多數(shù)情況下，應(yīng)在滅菌后兩周內(nèi)用完。3 .外植體選擇與消毒選擇合適的部位作為外植體，采回后經(jīng)過適當(dāng)?shù)念A(yù)處理，如消除殘留的莖稈、剪去干枯的花序、 分類篩選等，然后進(jìn)行消毒處理。白及組織培養(yǎng)采用白及種子無菌播種的方法， 因此要采集無雜菌 感染、無病蟲害、生長健壯的優(yōu)良白

17、及品種種子。實(shí)驗(yàn)選取白及種植基地的白及痂果備用，痂果采收時間為8月下旬至9月上旬。白及痂果采回后，先用清水洗凈，洗衣粉溶液浸泡10min再用清水沖刷洗凈，在超凈工作臺上 采用70叱醇消毒30s,再用0.1%升汞消毒10-15min,用無菌水沖洗3-4次，在濾紙上吸干水分， 從果實(shí)中部撥開，快速接種到培養(yǎng)基上。無菌播種培養(yǎng)基配方為： MS+6-BA0.05mg/L+NAA0.1-0.5mg/L其中含蔗糖3% 瓊脂粉0.7%、PH5.8。種子萌發(fā)條件為晝溫 20-25 C,夜溫18-20 C,暗培養(yǎng)7d再轉(zhuǎn)入光培養(yǎng)。觀察種子萌發(fā)情況，以周圍統(tǒng)計單位，統(tǒng)計萌 發(fā)個數(shù)及生長情況，發(fā)現(xiàn)染菌需及時清理。如

18、白及痂果采集數(shù)量較多，無法一次性保存，可用報紙逐個包裹后放入冰箱， 每周更換報紙避 免發(fā)霉，在4 c左右可長期保存。4 .叢生芽誘導(dǎo)無菌播種培養(yǎng)基中種子萌發(fā)出現(xiàn)圓球狀綠色芽點(diǎn)，及時轉(zhuǎn)入誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，萌發(fā)大量叢生芽。 誘導(dǎo)叢生芽培養(yǎng)基為：MS+6-BA0.1mg/L其中含蔗糖3%瓊脂粉0.7%、PH5.8。5 .生根壯苗培養(yǎng)剛形成的白及芽苗往往比較弱小，多數(shù)無根，此時可降低細(xì)胞分裂素濃度或不加， 提高生長素 濃度，促進(jìn)小苗生根，提高其健壯度。待白及叢生芽長到2cm高后分離成單株轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基中，以每瓶20-30株為最佳。培養(yǎng)基為： MS+6-BA0.05mg/L其中含蔗糖2%瓊脂粉0.7%、PH

19、5.8。由于分化形成的芽、原球莖數(shù)量有限， 為了大量獲取幼苗，可采用適當(dāng)?shù)睦^代培養(yǎng)基(本實(shí)驗(yàn)采用MS+NAA0.10.5mg/L ,其中含蔗糖2% 瓊脂粉0.7%、PH5.8),經(jīng)多次分割轉(zhuǎn)接，當(dāng)芽苗繁殖到一定數(shù)量后，再將一部分用于壯苗生根， 另一部分保存或繼續(xù)擴(kuò)繁。采用此方法工序較多，產(chǎn)生的人工成本和材料成本較大，故在本實(shí)驗(yàn)中不米用。(5)煉苗移栽當(dāng)白及組培小苗在培養(yǎng)瓶中長到 3-5cm高時，即可出瓶。一般來說，春季氣溫逐漸回升，有利試 管苗適應(yīng)自然環(huán)境，最宜移栽。為使試管苗移栽后適應(yīng)自然環(huán)境，移栽前要先揭開瓶蓋，放在室內(nèi)自 然光下煉苗3-7d,以提高小苗的抗性和適應(yīng)性。在組培瓶中時間不宜超

20、過 2個月，時間過長出瓶取苗要小心操作，盡量不要折斷根部，可用銀子輕夾根部拔出（銀子頭部可用棉花捆綁）， 用軟毛刷洗凈根部培養(yǎng)基，正常組培苗先在自來水中洗凈培養(yǎng)基， 特別要洗掉瓊脂，以免瓊脂發(fā)霉 引起爛根，再換自來水清洗一次，然后用 800-1000倍百菌清或多菌靈液浸泡根部 0.2h,待幼苗放 在通風(fēng)陰涼處晾半天，用濕潤毛巾蓋住葉片，只把根部裸露，至根部發(fā)白時即可栽植，移栽前用 1000倍生根劑溶液蘸根，植入土壤基質(zhì)中。深度不宜過深，以入土3-5cm深為宜，使根部自然伸展，輕輕壓實(shí)，株行距5*5cm。栽好后，澆足定根水，置于陰涼處。注意保持較高的空氣濕度（80%-90%） 和適當(dāng)通風(fēng)，并使環(huán)境溫度維持在 20-25 C。當(dāng)移栽小苗新葉展開、苗根伸長后，每月用M孰量元 素1000倍稀釋液或花寶一號1000倍稀釋液噴施追肥，促進(jìn)生長發(fā)育。待小苗成活后，再移栽到大 田。馴化時間3-5個月后等外界氣溫逐漸回升，有利組培苗適應(yīng)自然環(huán)境，最宜移栽。因白及喜濕潤，怕積水，積水會使根莖腐爛，葉片脫落而死。因此，移栽過程中基質(zhì)的透氣性和保濕性直接決定了白及苗成活率的高低。對白及組培苗移栽基質(zhì)可以使用珍珠巖30%膨化蛭石30%+1