植物生化制藥第五章核酸類藥物

1、第五章第五章 核酸類藥物核酸類藥物第一節(jié)第一節(jié) 概述概述核酸核酸是以核苷酸為基本組成單位的生物大是以核苷酸為基本組成單位的生物大分子，攜帶和傳遞遺傳信息。分子，攜帶和傳遞遺傳信息。 98%98%分布于細胞核，其余分布于核外分布于細胞核，其余分布于核外如線粒體，葉綠體。如線粒體，葉綠體。主要主要分布于分布于細胞質(zhì)（細胞質(zhì)（90%90%），剩），剩余余10%10%位于細胞核位于細胞核。(deoxyribonucleic acid, DNA)(ribonucleic acid, RNA)脫氧核糖核酸脫氧核糖核酸 核糖核酸核糖核酸攜帶遺傳信息，決定細胞和個攜帶遺傳信息，決定細胞和個體的基因型體的基因型

2、(genotype)。參與細胞內(nèi)參與細胞內(nèi)DNA遺傳信息的表遺傳信息的表達。某些病毒達。某些病毒RNA也可作為遺也可作為遺傳信息的載體。傳信息的載體。核酸核酸堿基堿基戊糖戊糖核苷核苷磷酸磷酸核苷酸核苷酸核酸類藥物核酸類藥物是具有藥用價值的核酸、核苷酸、核苷以是具有藥用價值的核酸、核苷酸、核苷以及堿基的統(tǒng)稱。除了天然存在的堿基、核苷、核苷酸及堿基的統(tǒng)稱。除了天然存在的堿基、核苷、核苷酸外，它們的類似物、衍生物或這些類似物、衍生物的外，它們的類似物、衍生物或這些類似物、衍生物的聚合物也屬于核酸藥物。聚合物也屬于核酸藥物。一、一、RNA的制備的制備（一）材料的選擇與預處理（一）材料的選擇與預處理制備

3、制備RNA的材料要選擇含核酸量豐富的組織。的材料要選擇含核酸量豐富的組織。RNA的含量和細胞的活躍程度有關，在蛋白質(zhì)合成旺盛的的含量和細胞的活躍程度有關，在蛋白質(zhì)合成旺盛的細胞中，其核酸的含量也相應地較高。細胞中，其核酸的含量也相應地較高。第二節(jié)第二節(jié) 核酸類藥物的一般制備方法核酸類藥物的一般制備方法組織勻漿組織勻漿沉淀物（沉淀物（DNA、蛋白質(zhì)等）、蛋白質(zhì)等）上清液（上清液（RNA等）等）殘留物（殘留物（DNA等）等）酸提取液（酸提取液（RNA）堿處理堿處理酸處理酸處理殘留物殘留物脂溶性物質(zhì)脂溶性物質(zhì)有機溶有機溶劑處理劑處理殘留物殘留物酸溶性小分子酸溶性小分子冷酸處理冷酸處理1. 酸處理法酸

4、處理法 將經(jīng)酸和有機溶劑處理后的殘留物用將經(jīng)酸和有機溶劑處理后的殘留物用1mol/L的過氯酸的過氯酸液于液于4下處理下處理18 h，從中抽提出，從中抽提出RNA，沉淀部分再用，沉淀部分再用0.5mol/L的過氯酸液的過氯酸液70 下處理下處理20 min提取提取DNA。此法的此法的缺點缺點是有些材料的是有些材料的DNA在冷過氯酸抽提時被少量提在冷過氯酸抽提時被少量提取，從而使取，從而使RNA部分中混有少量的部分中混有少量的DNA。2. 堿處理法堿處理法將殘留物用將殘留物用1mol/L的的NaOH溶液于溶液于37 處理過夜，則處理過夜，則RNA被堿解為堿溶性核苷酸，被堿解為堿溶性核苷酸，DNA不

5、溶解。加入過氯酸或三氯不溶解。加入過氯酸或三氯乙酸使溶液酸化，至酸濃度為乙酸使溶液酸化，至酸濃度為5%-10%,此時，此時，RNA的分解的分解產(chǎn)物溶解在上清液中，產(chǎn)物溶解在上清液中，DNA等則被沉淀下來。此法的等則被沉淀下來。此法的優(yōu)點優(yōu)點是是RNA和和DNA分開得較為徹底，分開得較為徹底，缺點缺點是是RNA中還含有其他中還含有其他含磷化合物，如磷肽，磷酸肌醇等。含磷化合物，如磷肽，磷酸肌醇等。（二）提取與純化（二）提取與純化1. 提取提?。?）乙醇沉淀法）乙醇沉淀法（2）去污劑處理法）去污劑處理法（3）酚法）酚法2. 純化純化（1）密度梯度離心法）密度梯度離心法（2）柱色譜法）柱色譜法（3）

6、凝膠電泳法）凝膠電泳法（三）含量測定（三）含量測定1. 定磷法定磷法 2. 定糖法定糖法Vit CRNA中的戊核糖可在鹽酸的水解作用下游離出來，進一步形成糠醛，然中的戊核糖可在鹽酸的水解作用下游離出來，進一步形成糠醛，然后與地衣酚反應，反應物程鮮綠色，在后與地衣酚反應，反應物程鮮綠色，在670nm有最大吸收峰。有最大吸收峰。二、二、DNA的制備的制備1. 材料的選擇與處理材料的選擇與處理2. 2. 提取與純化提取與純化3. 3. 含量測定含量測定4. （1）定磷法）定磷法 同同RNA5. （2）定糖法）定糖法6. 又稱二苯胺法，在酸性溶液中，將又稱二苯胺法，在酸性溶液中，將DNA與二苯胺共與二

7、苯胺共熱，形成藍色化合物，該化合物在熱，形成藍色化合物，該化合物在595nm有最大吸收。有最大吸收。當當DNA濃度在濃度在20-200ug/mL時，光吸收度與時，光吸收度與DNA濃度濃度呈正比。呈正比。三、核苷酸、核苷及堿基的制備三、核苷酸、核苷及堿基的制備（一）制備方法（一）制備方法1. 直接提取法直接提取法2. 水解法水解法（1）酶水解法）酶水解法（2）堿水解法）堿水解法（3）酸水解法）酸水解法3. 化學合成法化學合成法4. 酶合成法酶合成法5. 微生物發(fā)酵法微生物發(fā)酵法光合磷酸化法制備光合磷酸化法制備ATP的工藝流程的工藝流程5-AMP 溶解，混合溶解，混合 Na2HPO4，Tris，P

8、MS肌激酶，肌激酶，ATP（引子）（引子）混合液混合液反應液反應液ATP粗制品粗制品上清液上清液濾液濾液ATP成品成品ATP沉淀沉淀洗脫液（含洗脫液（含ATP）吸附物吸附物流出液流出液 光合光合 葉綠體葉綠體pH3,1-1.5h 沉淀沉淀 三氯乙酸三氯乙酸10以下以下 提取提取 乙醇乙醇10 4-5h 干燥干燥 乙醇，乙醚乙醇，乙醚減壓減壓 去陽離子去陽離子 732樹脂樹脂pH61212 除熱源、沉淀除熱源、沉淀 硅藻土、乙醇硅藻土、乙醇 去雜質(zhì)去雜質(zhì) 蒸餾水、硅藻土蒸餾水、硅藻土 洗脫洗脫 NaCl溶液溶液pH3.8 吸附吸附 NaOH，717樹脂樹脂pH6.5-7ATPATP的藥理作用與臨

9、床應用的藥理作用與臨床應用 在生物體內(nèi)，在生物體內(nèi)，ATP廣泛參與各種生化過程，除參與核廣泛參與各種生化過程，除參與核酸形成外，主要起著供應能量和磷酸基團的作用。酸形成外，主要起著供應能量和磷酸基團的作用。 ATP除了作為危重病人搶救的輔助藥物外，還可對慢除了作為危重病人搶救的輔助藥物外，還可對慢性肝炎、肝硬化、腎炎、心肌炎、冠狀動脈硬化、進行性性肝炎、肝硬化、腎炎、心肌炎、冠狀動脈硬化、進行性肌肉萎縮、再生障礙性貧血、腦血管意外后遺癥、中心性肌肉萎縮、再生障礙性貧血、腦血管意外后遺癥、中心性血管痙攣性視網(wǎng)膜脈絡膜炎、風濕性關節(jié)炎、耳聾、耳鳴血管痙攣性視網(wǎng)膜脈絡膜炎、風濕性關節(jié)炎、耳聾、耳鳴等

10、有一定療效。等有一定療效。第五章第五章 酶類藥物酶類藥物第一節(jié)第一節(jié) 概述概述 一、酶類藥物發(fā)展簡史一、酶類藥物發(fā)展簡史 酶類藥物是直接用各種劑型的酶以改變體內(nèi)酶活力，或酶類藥物是直接用各種劑型的酶以改變體內(nèi)酶活力，或改變體內(nèi)某性質(zhì)生物活性物質(zhì)和代謝產(chǎn)物的數(shù)量等，從而達改變體內(nèi)某性質(zhì)生物活性物質(zhì)和代謝產(chǎn)物的數(shù)量等，從而達到治療某些疾病的目的。到治療某些疾病的目的。1926年，年，Sumner將尿素酶結晶是藥用酶工業(yè)化的起點。將尿素酶結晶是藥用酶工業(yè)化的起點。1952年，年，Innerfield首次將結晶的胰蛋白酶用于治療血栓性首次將結晶的胰蛋白酶用于治療血栓性靜脈炎，真正揭開了酶在醫(yī)療應用的序

11、幕。靜脈炎，真正揭開了酶在醫(yī)療應用的序幕。20世紀世紀60年代后期，逐漸發(fā)展到從微生物發(fā)酵液中獲得大量年代后期，逐漸發(fā)展到從微生物發(fā)酵液中獲得大量的酶。的酶。70年代后，開始利用人的某些組織細胞培養(yǎng)技術和基因工程年代后，開始利用人的某些組織細胞培養(yǎng)技術和基因工程手段來獲取有關的酶，使酶類藥物的應用得到了迅速發(fā)展。手段來獲取有關的酶，使酶類藥物的應用得到了迅速發(fā)展。對酶類藥物的要求對酶類藥物的要求1. 藥用酶應在生理環(huán)境（藥用酶應在生理環(huán)境（pH中性）下具有最高活力和穩(wěn)定性。中性）下具有最高活力和穩(wěn)定性。2. 對其作用的底物具有較高的親和力。對其作用的底物具有較高的親和力。3. 在血清中半衰期較

12、長。在血清中半衰期較長。4. 要求純度高，特別是對注射用的酶類藥物純度要求更高。要求純度高，特別是對注射用的酶類藥物純度要求更高。5. 酶應免疫源性較低或無免疫源性。酶應免疫源性較低或無免疫源性。二、酶的分子組成及分類二、酶的分子組成及分類1. 酶分子的組成酶分子的組成單體酶單體酶寡聚酶寡聚酶多酶復合體多酶復合體酶酶有機物分子有機物分子金屬有機物金屬有機物金屬金屬輔酶或輔基（非蛋白部分）輔酶或輔基（非蛋白部分）酶蛋白酶蛋白復合蛋白質(zhì)復合蛋白質(zhì)單純蛋白質(zhì)（單體酶）單純蛋白質(zhì)（單體酶）2. 酶的分類酶的分類分類分類 名稱名稱 催化反應的類型催化反應的類型 實例實例 1 氧化還原酶氧化還原酶 電子轉

13、移電子轉移 醇脫氫酶醇脫氫酶 2 轉移酶轉移酶 轉移功能基團轉移功能基團 己糖激酶己糖激酶 3 水解酶水解酶 水解反應水解反應 胰蛋白酶胰蛋白酶 4 裂合酶裂合酶 鍵的斷裂鍵的斷裂 丙酮脫羧酶丙酮脫羧酶 5 異構酶異構酶 分子內(nèi)基團的轉移分子內(nèi)基團的轉移 順丁烯二酸異構酶順丁烯二酸異構酶 6 連接酶或合成酶連接酶或合成酶 鍵形成與水解偶聯(lián)鍵形成與水解偶聯(lián) 丙酮羧化酶丙酮羧化酶表表6-1 6-1 酶的國際分類酶的國際分類三、酶類藥物的臨床應用三、酶類藥物的臨床應用1. 消化酶類消化酶類2. 抗炎、黏痰溶解酶抗炎、黏痰溶解酶3. 與纖維蛋白溶解作用有關的酶類與纖維蛋白溶解作用有關的酶類4. 抗腫瘤

14、的酶類抗腫瘤的酶類5. 其它生理活性酶其它生理活性酶6. 復合酶復合酶 表表6-2 酶類藥物一覽表酶類藥物一覽表第二節(jié)第二節(jié) 酶類藥物的一般制備方法酶類藥物的一般制備方法酶制備過程的特點：酶制備過程的特點：一是某種酶在生物體內(nèi)含量甚少，且有分布部位特異性。一是某種酶在生物體內(nèi)含量甚少，且有分布部位特異性。二是酶可以通過測定其活力加以跟蹤。二是酶可以通過測定其活力加以跟蹤。酶制備一般包括四個步驟：酶的原材料的選擇與處理；酶的酶制備一般包括四個步驟：酶的原材料的選擇與處理；酶的提取；酶的純化；酶活力的測定和純度檢測。提?。幻傅募兓?；酶活力的測定和純度檢測。一、酶的原材料選擇與預處理一、酶的原材料選

15、擇與預處理（一）原材料的選擇（一）原材料的選擇（1）了解目的酶在生物材料中的分布特點，選擇適宜的）了解目的酶在生物材料中的分布特點，選擇適宜的生物材料。生物材料。（2）考慮生物在不同發(fā)育階段及營養(yǎng)狀況時，酶含量的）考慮生物在不同發(fā)育階段及營養(yǎng)狀況時，酶含量的差別及雜質(zhì)干擾的情況。差別及雜質(zhì)干擾的情況。（3）原料來源是否豐富，原料易得，原料產(chǎn)地較近。）原料來源是否豐富，原料易得，原料產(chǎn)地較近。（4）提取步驟是否簡便易行。）提取步驟是否簡便易行。用植物組織作原料，要擇時采集并就地去除不用部分，用植物組織作原料，要擇時采集并就地去除不用部分，將有用部分保鮮處理。將有用部分保鮮處理。（二）原材料的預處

16、理（二）原材料的預處理1. 機械法機械法2.反復凍融法反復凍融法3. 超聲波法超聲波法4. 酶解法酶解法5. 丙酮粉法丙酮粉法二、酶的提取二、酶的提取1. 水溶液法水溶液法 常用稀鹽溶液或緩沖液提取，經(jīng)過預處常用稀鹽溶液或緩沖液提取，經(jīng)過預處理的原料，包括組織糜，勻漿，細胞顆粒，丙酮粉都理的原料，包括組織糜，勻漿，細胞顆粒，丙酮粉都可用水溶液抽提?？捎盟芤撼樘?。 水溶液的水溶液的pH選擇對抽提具有影響，應考慮的因素有：選擇對抽提具有影響，應考慮的因素有： 酶的穩(wěn)定性酶的穩(wěn)定性 酶的溶解性酶的溶解性 酶與其他物質(zhì)結合的性質(zhì)酶與其他物質(zhì)結合的性質(zhì) 選擇選擇pH的總原則是，在酶穩(wěn)定的的總原則是，在

17、酶穩(wěn)定的pH范圍內(nèi)，選擇偏離范圍內(nèi)，選擇偏離等電點的適當?shù)牡入婞c的適當?shù)膒H。2. 有機溶劑法有機溶劑法 某些結合酶，由于和脂質(zhì)結合牢固，某些結合酶，由于和脂質(zhì)結合牢固，需用有機溶劑除去脂質(zhì)，且不能使酶變性。常用有機需用有機溶劑除去脂質(zhì)，且不能使酶變性。常用有機溶劑是丁醇。溶劑是丁醇。 丁醇性質(zhì)：親脂性強、兼具親水性、在脂與水分子間丁醇性質(zhì)：親脂性強、兼具親水性、在脂與水分子間能起表面活性劑的橋梁作用。能起表面活性劑的橋梁作用。 丁醇提取方法：均相法和兩相法丁醇提取方法：均相法和兩相法3. 表面活性劑法表面活性劑法三、酶的純化三、酶的純化不同的酶，因性質(zhì)不同，其純化工藝可能有很大不同。不同的酶

18、，因性質(zhì)不同，其純化工藝可能有很大不同。評價一個純化工藝好壞，主要看兩個指標：酶比活和總活評價一個純化工藝好壞，主要看兩個指標：酶比活和總活力回收率。力回收率。（一）雜質(zhì)的除去（一）雜質(zhì)的除去1. 調(diào)調(diào)pH和加熱沉淀法（核糖核酸酶，溶菌酶的提?。┖图訜岢恋矸ǎê颂呛怂崦?，溶菌酶的提?。?. 蛋白質(zhì)表面變性法（蛋白質(zhì)表面變性法（CAT用氯仿提?。┯寐确绿崛。?. 選擇性變性法（細胞色素選擇性變性法（細胞色素C可用三氯醋酸提?。┛捎萌却姿崽崛。?. 降解或沉淀核苷酸法降解或沉淀核苷酸法5. 利用結合底物保護法除去雜蛋白（利用結合底物保護法除去雜蛋白（D-甲基苯甲酸為甲基苯甲酸為D-氨氨基酸氧化酶

19、的保護劑）基酸氧化酶的保護劑）（二）脫鹽和濃縮（二）脫鹽和濃縮1. 脫鹽脫鹽（1）透析）透析（2）凝膠過濾）凝膠過濾2. 濃縮濃縮（1）蒸發(fā)）蒸發(fā)（2）超濾法）超濾法（3）凝膠吸水法）凝膠吸水法（4）冷凍干燥法）冷凍干燥法（三）酶的結晶（三）酶的結晶1. 鹽析法鹽析法2. 有機溶劑法有機溶劑法3. 透析平衡法透析平衡法4. 等電點法等電點法四、酶活力的測定與純度檢驗四、酶活力的測定與純度檢驗1. 活力測定活力測定 無論在酶的抽提純化過程中或是對酶的性質(zhì)進行研究無論在酶的抽提純化過程中或是對酶的性質(zhì)進行研究過程中為了了解所選擇方法是否適宜，幾乎每一步驟前后過程中為了了解所選擇方法是否適宜，幾乎每

20、一步驟前后都應進行酶的活力測定，做出總活力和比活力的比較。都應進行酶的活力測定，做出總活力和比活力的比較。2.純度檢測純度檢測 在酶的分離提純中，總活力用于計算某一抽提或純化在酶的分離提純中，總活力用于計算某一抽提或純化步驟后酶的回收率（步驟后酶的回收率（Y），而比活力則用于計算某一純化），而比活力則用于計算某一純化步驟的效果，即純度的提高（步驟的效果，即純度的提高（E），其關系如下：），其關系如下： Y=某步驟后的總活力某步驟后的總活力/某步驟前的總活力某步驟前的總活力 E=某步驟后的比活力某步驟后的比活力/某步驟前的比活力某步驟前的比活力五、菠蘿蛋白酶五、菠蘿蛋白酶 是從菠蘿汁或加工菠蘿削

21、下的廢皮中提取的一種蛋白水是從菠蘿汁或加工菠蘿削下的廢皮中提取的一種蛋白水解酶，粗菠蘿水解酶是各種成分的混合物，除蛋白水解酶系解酶，粗菠蘿水解酶是各種成分的混合物，除蛋白水解酶系外，還含有磷酸酯酶、過氧化物酶、纖維素酶、其它糖苷酶外，還含有磷酸酯酶、過氧化物酶、纖維素酶、其它糖苷酶及非蛋白物質(zhì)。及非蛋白物質(zhì)。 實驗證明，菠蘿蛋白酶具有消炎抗水腫作用，作用特點實驗證明，菠蘿蛋白酶具有消炎抗水腫作用，作用特點是能選擇性水解纖維蛋白，對與凝血有關的纖維蛋白原僅有是能選擇性水解纖維蛋白，對與凝血有關的纖維蛋白原僅有微弱的作用，不影響正常血液的凝固。能分解肌纖維，可單微弱的作用，不影響正常血液的凝固。能

22、分解肌纖維，可單獨或與胰蛋白酶制成合劑使用，消除各種單純性炎癥、水腫、獨或與胰蛋白酶制成合劑使用，消除各種單純性炎癥、水腫、血腫，促進抗生素和化療藥物的滲透和擴散。血腫，促進抗生素和化療藥物的滲透和擴散。 臨床適用于治療支氣管哮喘、急性肺炎、產(chǎn)后乳房充血、臨床適用于治療支氣管哮喘、急性肺炎、產(chǎn)后乳房充血、乳腺炎、產(chǎn)后血栓靜脈炎、視網(wǎng)膜炎等。試用于同抗生素配乳腺炎、產(chǎn)后血栓靜脈炎、視網(wǎng)膜炎等。試用于同抗生素配伍治療關節(jié)炎、關節(jié)周圍炎、蜂窩組織炎和小腿潰瘍等。伍治療關節(jié)炎、關節(jié)周圍炎、蜂窩組織炎和小腿潰瘍等。（一）化學性質(zhì)和組成（一）化學性質(zhì)和組成白色至淺棕黃色無定形粉末。略溶于水，水溶液無色至白

23、色至淺棕黃色無定形粉末。略溶于水，水溶液無色至淡黃色，有時有乳白光，不溶于乙醇、氯仿和乙醚，為淡黃色，有時有乳白光，不溶于乙醇、氯仿和乙醚，為一種巰基酶。半胱氨酸能激活酶的活性，但受重金屬抑一種巰基酶。半胱氨酸能激活酶的活性，但受重金屬抑制。最適制。最適pH7.0，相對分子量，相對分子量33000。 主要作用原理：使多肽類水解為低分子量的肽類。主要作用原理：使多肽類水解為低分子量的肽類。（二）生產(chǎn)工藝（白陶土吸附法）（二）生產(chǎn)工藝（白陶土吸附法）（吸附）（吸附）白陶土白陶土10菠蘿蛋白酶成品菠蘿蛋白酶成品濕菠蘿蛋白酶精制品濕菠蘿蛋白酶精制品澄清液澄清液粗制品粗制品（沉淀）（沉淀）HCl pH4

24、（溶解）（溶解）自來水，自來水，NaOH洗脫液洗脫液（鹽析、抽濾）（鹽析、抽濾）HCl，（，（NH4）2SO4pH=4.55吸附物吸附物（洗脫）（洗脫）Na2CO3或或NaOH（NH4）2SO4pH=6.57壓出液壓出液菠蘿皮菠蘿皮（壓榨）（壓榨）苯甲酸鈉苯甲酸鈉（干燥、粉碎）（干燥、粉碎）pH77.5（三）檢驗方法（三）檢驗方法1. 性狀性狀 富有菠蘿香氣，淺黃色或淺棕黃色粉末。富有菠蘿香氣，淺黃色或淺棕黃色粉末。2. 蛋白酶水解活力測定蛋白酶水解活力測定（1）原理）原理 菠蘿蛋白酶在一定溫度與菠蘿蛋白酶在一定溫度與pH條件下，水解條件下，水解酪蛋白底物，然后加入三氯乙酸終止酶反應，并沉淀酪

25、蛋白底物，然后加入三氯乙酸終止酶反應，并沉淀除去未水解的蛋白，濾液對紫外光有吸收，用紫外分除去未水解的蛋白，濾液對紫外光有吸收，用紫外分光光度計法測定，根據(jù)吸光度計算酶活力。光光度計法測定，根據(jù)吸光度計算酶活力。（2）酶活力單位定義）酶活力單位定義 在測定條件下在測定條件下 pH7.0，（37+0.2），每分鐘水解酪蛋白釋放出的三氯乙酸，每分鐘水解酪蛋白釋放出的三氯乙酸可溶物在可溶物在275nm的吸光度與的吸光度與1g酪氨酸的吸光度相當酪氨酸的吸光度相當時，所需酶量為時，所需酶量為1U。（3）測定步驟）測定步驟 適當稀釋樣品后，精密量取樣品待測液適當稀釋樣品后，精密量取樣品待測液1mL，置于具

26、，置于具塞試管中，于，塞試管中，于，37預溫預溫10min，迅速加入，迅速加入37預溫的酪預溫的酪蛋白溶液蛋白溶液5mL，從開始加入起準確反應，從開始加入起準確反應10min，加入三氯，加入三氯乙酸溶液乙酸溶液5mL，混勻，保溫，混勻，保溫10min后過濾。后過濾。另量取另量取1mL待測樣品液于待測樣品液于37預溫預溫10min，精密加入三，精密加入三氯乙酸溶液氯乙酸溶液5mL，準確反應，準確反應10min，加入酪蛋白溶液，加入酪蛋白溶液5mL，搖勻，保溫搖勻，保溫10min后過濾，濾液作為上述溶液的空白對照。后過濾，濾液作為上述溶液的空白對照。用分光光度計在用分光光度計在275nm的波長處測

27、吸光度的波長處測吸光度A。以水做空白對照，在以水做空白對照，在275nm的波長處測定的波長處測定50g/mL酪氨酪氨酸吸光度酸吸光度A。（四）菠蘿蛋白酶在醫(yī)藥、保健品業(yè)的應用（四）菠蘿蛋白酶在醫(yī)藥、保健品業(yè)的應用 1、抑制腫瘤細胞的生長、抑制腫瘤細胞的生長 經(jīng)相關臨床研究觀察表明，菠蘿蛋白酶能抑制腫瘤經(jīng)相關臨床研究觀察表明，菠蘿蛋白酶能抑制腫瘤細胞的生長。細胞的生長。 2、對心血管疾病的防治、對心血管疾病的防治 菠蘿蛋白酶作為蛋白水解酶對心血管疾病的防治是菠蘿蛋白酶作為蛋白水解酶對心血管疾病的防治是有益的。它能抑制血小板聚集引起的心臟病發(fā)作和中風有益的。它能抑制血小板聚集引起的心臟病發(fā)作和中風

28、, 緩解心絞痛癥狀緩解心絞痛癥狀,緩和動脈收縮緩和動脈收縮, 加速纖維蛋白原的分解。加速纖維蛋白原的分解。 3、用于燒傷脫痂、用于燒傷脫痂 菠蘿蛋白酶能選擇性地除菠蘿蛋白酶能選擇性地除 皮皮, 使新皮移植得以盡早使新皮移植得以盡早進行。動物實驗證明進行。動物實驗證明, 菠蘿蛋白酶對鄰近的正常皮膚無不菠蘿蛋白酶對鄰近的正常皮膚無不良影響。局部使用抗生素不影響菠蘿蛋白酶的效果。良影響。局部使用抗生素不影響菠蘿蛋白酶的效果。 4、消炎作用、消炎作用 菠蘿蛋白酶在各種組織中能有效地治療炎癥和水菠蘿蛋白酶在各種組織中能有效地治療炎癥和水腫腫(包括血栓靜脈炎、骨骼肌損傷、血腫、口腔炎、糖包括血栓靜脈炎、骨

29、骼肌損傷、血腫、口腔炎、糖尿病人潰瘍及運動損傷尿病人潰瘍及運動損傷)，菠蘿蛋白酶具有激活炎癥反，菠蘿蛋白酶具有激活炎癥反應的潛力。菠蘿蛋白酶還可治療腹瀉。應的潛力。菠蘿蛋白酶還可治療腹瀉。 5、增進藥物吸收、增進藥物吸收 將菠蘿蛋白酶與各種抗生素將菠蘿蛋白酶與各種抗生素(如四環(huán)素如四環(huán)素, 阿莫西林阿莫西林等等)聯(lián)用聯(lián)用, 能提高其療效。相關研究表明能提高其療效。相關研究表明, 它能促進抗生它能促進抗生素在感染部位的傳輸素在感染部位的傳輸, 從而減少抗生素的用藥量。據(jù)推從而減少抗生素的用藥量。據(jù)推斷斷, 對于抗癌藥物對于抗癌藥物, 也有類似的作用。此外，菠蘿蛋白也有類似的作用。此外，菠蘿蛋白酶

30、能促進營養(yǎng)物質(zhì)的吸收。酶能促進營養(yǎng)物質(zhì)的吸收。第七章第七章 多糖類藥物多糖類藥物第一節(jié)第一節(jié) 糖類藥物概述糖類藥物概述按照含有糖基數(shù)目的不同分為按照含有糖基數(shù)目的不同分為: 單糖：葡萄糖、果糖、氨基葡萄糖和維生素單糖：葡萄糖、果糖、氨基葡萄糖和維生素C等。等。 低聚糖：蔗糖、麥芽糖、乳糖等。低聚糖：蔗糖、麥芽糖、乳糖等。 多糖：（糖類藥物研究的最多是多糖類藥物多糖：（糖類藥物研究的最多是多糖類藥物 ）多糖如有）多糖如有旋糖酐、甘露聚糖、香菇多糖、茯苓多糖等。旋糖酐、甘露聚糖、香菇多糖、茯苓多糖等。 還有一些糖類藥物是糖的衍生物，如還有一些糖類藥物是糖的衍生物，如6-磷酸葡萄糖，磷酸葡萄糖，1，

31、6-二磷酸果糖，磷酸肌醇等。二磷酸果糖，磷酸肌醇等。多糖的藥理作用多糖的藥理作用（1）調(diào)節(jié)免疫功能）調(diào)節(jié)免疫功能 主要表現(xiàn)為影響抗體活性，促進淋主要表現(xiàn)為影響抗體活性，促進淋巴細胞增殖，激活或提高吞噬細胞的功能。增強機體的巴細胞增殖，激活或提高吞噬細胞的功能。增強機體的抗炎、抗氧化和抗衰老作用。抗炎、抗氧化和抗衰老作用。（2）抗感染作用，多糖可以提高機體組織細胞對細菌，）抗感染作用，多糖可以提高機體組織細胞對細菌，原蟲，病毒和真菌感染的抵抗力。原蟲，病毒和真菌感染的抵抗力。（3）促進細胞）促進細胞DNA，蛋白質(zhì)的合成，促進細胞的增殖、，蛋白質(zhì)的合成，促進細胞的增殖、生長。生長。（4）抗輻射損傷

32、作用，抗射線的損傷，有抗氧化、防輻）抗輻射損傷作用，抗射線的損傷，有抗氧化、防輻射作用。射作用。（5）抗腫瘤和抗凝血作用，肝素是天然抗凝劑。）抗腫瘤和抗凝血作用，肝素是天然抗凝劑。 （6）降血脂和抗動脈粥樣硬化功能。硫酸軟骨素、小分）降血脂和抗動脈粥樣硬化功能。硫酸軟骨素、小分子肝素、殼聚糖等具有降血脂、降血膽固醇，抗動脈粥樣子肝素、殼聚糖等具有降血脂、降血膽固醇，抗動脈粥樣硬化作用，用于防治冠心病和動脈硬化。硬化作用，用于防治冠心病和動脈硬化。多糖多糖結合型結合型游離型游離型脂多糖：與脂類結合在一起脂多糖：與脂類結合在一起糖蛋白：與蛋白質(zhì)結合在一起糖蛋白：與蛋白質(zhì)結合在一起 多糖的相對分子量

33、較大，有直鏈和支鏈兩種，多可溶多糖的相對分子量較大，有直鏈和支鏈兩種，多可溶于水，水溶液具有一定的黏度，能被酸、堿和酶水解成單于水，水溶液具有一定的黏度，能被酸、堿和酶水解成單糖或低聚糖。糖或低聚糖。多糖根據(jù)來源不同可分為：多糖根據(jù)來源不同可分為：(1) 植物多糖：黃芪多糖，人參多糖。植物多糖：黃芪多糖，人參多糖。(2) 動物多糖：肝素，透明質(zhì)酸，硫酸軟骨素等。動物多糖：肝素，透明質(zhì)酸，硫酸軟骨素等。 (3) 微生物多糖：香菇多糖，靈芝多糖。微生物多糖：香菇多糖，靈芝多糖。第二節(jié)第二節(jié) 糖類藥物的一般制備技術糖類藥物的一般制備技術一、單糖、低聚糖及其衍生物的制備一、單糖、低聚糖及其衍生物的制備

34、 用水或在中性條件下以用水或在中性條件下以50乙醇，也可以用乙醇，也可以用82乙醇，乙醇，在在7078下回流提取。溶劑用量一般為材料的下回流提取。溶劑用量一般為材料的10倍，需多倍，需多次提取。次提取。 植物材料磨碎經(jīng)乙醚或石油醚脫脂，拌加碳酸鈣，以植物材料磨碎經(jīng)乙醚或石油醚脫脂，拌加碳酸鈣，以50乙醇溫浸，浸液合并，于乙醇溫浸，浸液合并，于4045減壓濃縮至適當體積，減壓濃縮至適當體積，用中性醋酸鉛去雜蛋白及其他雜質(zhì)，鉛離子可通用中性醋酸鉛去雜蛋白及其他雜質(zhì)，鉛離子可通H2S除去，除去，再濃縮至粘稠狀。再濃縮至粘稠狀。以甲醇或乙醇溫浸，去不溶物如無機鹽或殘留蛋白質(zhì)等。以甲醇或乙醇溫浸，去不溶

35、物如無機鹽或殘留蛋白質(zhì)等。 醇液經(jīng)活性炭脫色、濃縮、冷卻、滴加乙醚，或置于硫酸醇液經(jīng)活性炭脫色、濃縮、冷卻、滴加乙醚，或置于硫酸干燥器中旋轉，析出結晶。單糖或小分子寡糖也可以在提取干燥器中旋轉，析出結晶。單糖或小分子寡糖也可以在提取后，用吸附層析法或離子交換法進行純化。后，用吸附層析法或離子交換法進行純化。 二、多糖的分離與純化二、多糖的分離與純化 多糖可來自動物、植物和微生物多糖可來自動物、植物和微生物 ，植物體內(nèi)含有水，植物體內(nèi)含有水解多糖衍生物的酶，必須抑制或破壞酶的作用后，才能制解多糖衍生物的酶，必須抑制或破壞酶的作用后，才能制取天然存在形式的多糖。取天然存在形式的多糖。 提取多糖的材

36、料必須新鮮或及時干燥保存，避免受提取多糖的材料必須新鮮或及時干燥保存，避免受高溫破壞因此，速凍冷藏是保存材料的有效方法。高溫破壞因此，速凍冷藏是保存材料的有效方法。 提取所用溶劑根據(jù)多糖的溶解性質(zhì)而定。提取所用溶劑根據(jù)多糖的溶解性質(zhì)而定。（一）多糖的提?。ㄒ唬┒嗵堑奶崛√崛《嗵菚r，一般先需進行脫脂，以便多糖釋放。提取多糖時，一般先需進行脫脂，以便多糖釋放。方法是將材料粉碎，用甲醇或方法是將材料粉碎，用甲醇或1 1乙醇乙醚混合液，加乙醇乙醚混合液，加熱攪拌熱攪拌13小時，也可用石油醚脫脂。動物材料可用丙小時，也可用石油醚脫脂。動物材料可用丙酮脫脂、脫水處理。酮脫脂、脫水處理。 1、稀堿液提取、稀

37、堿液提取 用于難溶于冷水、熱水，可溶于稀堿液者。這一用于難溶于冷水、熱水，可溶于稀堿液者。這一類多糖主要是不溶性膠類，如木聚精、半乳聚糖等。類多糖主要是不溶性膠類，如木聚精、半乳聚糖等。用冷水浸潤材料后用用冷水浸潤材料后用0.5 molL NaOH提取，提取液提取，提取液用鹽酸中和、濃縮后，加乙醇沉淀得多糖。用鹽酸中和、濃縮后，加乙醇沉淀得多糖。 如在稀堿中仍不易溶出者，可加入硼砂，對甘露如在稀堿中仍不易溶出者，可加入硼砂，對甘露聚糖、半乳聚糖等能形成硼酸絡合物的多糖，此法可聚糖、半乳聚糖等能形成硼酸絡合物的多糖，此法可得相當純的物質(zhì)。得相當純的物質(zhì)。2、溫熱水提取、溫熱水提取 易溶于溫水、難

38、溶于冷水和乙醇者。易溶于溫水、難溶于冷水和乙醇者。材料用冷水浸材料用冷水浸過，用熱水提取，必要時可加熱至過，用熱水提取，必要時可加熱至8090攪拌提取。攪拌提取。 提取液用正丁醇與氯仿混合液除去雜蛋白（或用三氯提取液用正丁醇與氯仿混合液除去雜蛋白（或用三氯乙酸除雜蛋白），離心除去雜蛋白后的清液，透析后用乙酸除雜蛋白），離心除去雜蛋白后的清液，透析后用乙醇沉淀得多糖。乙醇沉淀得多糖。 3、粘多糖、粘多糖 因大部粘多糖與蛋白質(zhì)結合于細胞中，因此需用酶解因大部粘多糖與蛋白質(zhì)結合于細胞中，因此需用酶解法或堿解法使糖法或堿解法使糖-白質(zhì)間的結合鍵斷裂，促使多糖釋放。白質(zhì)間的結合鍵斷裂，促使多糖釋放。（1

39、）堿解法）堿解法 多糖與蛋白質(zhì)結合的糖肽鍵對堿不穩(wěn)定，故多糖與蛋白質(zhì)結合的糖肽鍵對堿不穩(wěn)定，故可用堿解法使糖與蛋白質(zhì)分開?？捎脡A解法使糖與蛋白質(zhì)分開。（2）酶解法）酶解法 蛋白酶水解法已逐步取代堿提取法而成為提取多糖的蛋白酶水解法已逐步取代堿提取法而成為提取多糖的最常用方法。最常用方法。鑒于蛋白酶不能斷裂糖肽鍵及其附近的肽鍵，為除去鑒于蛋白酶不能斷裂糖肽鍵及其附近的肽鍵，為除去長肽段，常與堿解法合用。長肽段，常與堿解法合用。 常用的酶制劑有胰蛋白酶、木瓜蛋白酶和鏈霉菌蛋白酶常用的酶制劑有胰蛋白酶、木瓜蛋白酶和鏈霉菌蛋白酶及枯草桿菌蛋白酶。及枯草桿菌蛋白酶。（二）多糖的純化（二）多糖的純化1.

40、乙醇沉淀法乙醇沉淀法 乙醇沉淀法是制備粘多糖的最常用手段。乙醇的加乙醇沉淀法是制備粘多糖的最常用手段。乙醇的加入，改變了溶液的極性，導致糖溶解度下降。入，改變了溶液的極性，導致糖溶解度下降。 向溶液中加入一定濃度的鹽，如醋酸鈉，醋酸鉀、向溶液中加入一定濃度的鹽，如醋酸鈉，醋酸鉀、醋酸銨或氯化鈉有助于使粘多糖從溶液中析出，鹽的最醋酸銨或氯化鈉有助于使粘多糖從溶液中析出，鹽的最終濃度終濃度5即足夠。即足夠。多次乙醇沉淀法脫鹽，也可以用超濾法或分子篩法多次乙醇沉淀法脫鹽，也可以用超濾法或分子篩法（SephadexG-10或或G-15）進行多糖脫鹽。）進行多糖脫鹽。沉淀物可用無水乙醇、丙酮、乙醚脫水，

41、真空干燥即可沉淀物可用無水乙醇、丙酮、乙醚脫水，真空干燥即可得疏松粉末狀產(chǎn)品。得疏松粉末狀產(chǎn)品。2. 分級沉淀法分級沉淀法 不同多糖在不同濃度的甲醇、乙醇或丙酮中的溶不同多糖在不同濃度的甲醇、乙醇或丙酮中的溶解度不同，因此可用不同濃度的有機溶劑分級沉淀分解度不同，因此可用不同濃度的有機溶劑分級沉淀分子大小不同的粘多糖。子大小不同的粘多糖。 在在Ca2+、Zn2+等二價金屬離子的存在下，采用乙等二價金屬離子的存在下，采用乙醇分級分離粘多糖可以獲得最佳效果。醇分級分離粘多糖可以獲得最佳效果。 3. 季胺鹽絡合法季胺鹽絡合法 粘多糖與一些陽離子表面活性劑如十六烷基三粘多糖與一些陽離子表面活性劑如十六

42、烷基三甲基溴化銨（甲基溴化銨（CTAB）和十六烷基氯化砒啶（）和十六烷基氯化砒啶（CPC）等能形成季胺鹽絡合物。等能形成季胺鹽絡合物。絡合物在低離子強度的水溶液中不溶解，在離子絡合物在低離子強度的水溶液中不溶解，在離子強度大時，絡合物可以解離、溶解、釋放。強度大時，絡合物可以解離、溶解、釋放。（三）多糖藥物的鑒定檢測方法（三）多糖藥物的鑒定檢測方法1. 定量測定定量測定（1）苯酚）苯酚-硫酸法硫酸法（2）蒽酮）蒽酮-硫酸法硫酸法（3）氨基己糖的比色測定）氨基己糖的比色測定 先在鹽酸溶液中將氨基己糖經(jīng)先在鹽酸溶液中將氨基己糖經(jīng)堿性乙酰化后，再與對二甲基苯甲酸發(fā)生呈色反應，從而堿性乙?；螅倥c對

43、二甲基苯甲酸發(fā)生呈色反應，從而進行定量測定。進行定量測定。 2.鑒別鑒別（1）測定糖基組成）測定糖基組成（2）高壓電泳法鑒定多糖均一性）高壓電泳法鑒定多糖均一性（3）超離心法鑒定多糖均一性）超離心法鑒定多糖均一性（4）凝膠柱色譜法鑒定多糖均一性）凝膠柱色譜法鑒定多糖均一性（5）分子量測定）分子量測定第三節(jié)第三節(jié) 香菇多糖香菇多糖一、結構與性質(zhì)一、結構與性質(zhì)為白色粉末狀固體，對為白色粉末狀固體，對光和熱穩(wěn)定。溶于水和光和熱穩(wěn)定。溶于水和0.5mol/L的的NaOH，不，不溶于甲醇、乙醇、丙酮溶于甲醇、乙醇、丙酮等有機溶劑。等有機溶劑。二、生產(chǎn)工藝二、生產(chǎn)工藝1.常規(guī)提取法常規(guī)提取法 鮮香菇鮮香菇

44、 搗碎搗碎 浸漬浸漬 過濾過濾 濃縮濃縮 乙醇沉淀乙醇沉淀 乙醇、乙醚洗滌乙醇、乙醚洗滌 干燥干燥 成品成品2. 復合酶提取法復合酶提取法3. 深層培養(yǎng)提取法深層培養(yǎng)提取法三、質(zhì)量檢測三、質(zhì)量檢測1.試劑試劑濃硫酸：分析純，濃硫酸：分析純，95.5%苯酚：苯酚：80g苯酚加苯酚加20g水使之溶解，可置冰箱中長期貯存。水使之溶解，可置冰箱中長期貯存。6%苯酚：臨用前用苯酚：臨用前用80%苯酚配制。苯酚配制。標準葡聚糖、葡萄糖或標準香菇多糖。標準葡聚糖、葡萄糖或標準香菇多糖。2. 方法方法（1）制作標準曲線）制作標準曲線 準確稱取標準葡萄糖準確稱取標準葡萄糖20mg溶于溶于500mL容量瓶中加水至

45、刻度，分別吸取容量瓶中加水至刻度，分別吸取0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0mL、1.2mL、1.4mL、1.6mL及，及，1.8mL各用水補充至各用水補充至2.0mL，然后加入，然后加入6%苯酚苯酚1.0mL以及濃硫酸以及濃硫酸5.0mL，靜止，靜止10min，搖勻，室溫放置，搖勻，室溫放置20min。在。在490nm處測光密度，以處測光密度，以2.0mL水按同樣顯水按同樣顯色操作作為空白，橫坐標為多糖微克數(shù)，縱坐標為光色操作作為空白，橫坐標為多糖微克數(shù)，縱坐標為光密度值，得標準曲線。密度值，得標準曲線。（2）樣品含量測定。吸?。悠泛繙y定。吸取1mL樣品，按上述步驟操樣品，按上述

46、步驟操作，測光密度，以標準曲線計算多糖含量。作，測光密度，以標準曲線計算多糖含量。第八章第八章 脂脂 類類 藥藥 物物第一節(jié)第一節(jié) 概概 述述 脂類物質(zhì)是廣泛存在于生物體中的脂肪及類似脂肪脂類物質(zhì)是廣泛存在于生物體中的脂肪及類似脂肪的、能夠被有機溶劑提取出來的化合物，由于分子中的的、能夠被有機溶劑提取出來的化合物，由于分子中的碳氫比例都較高，能夠溶解在乙醚、氯仿、苯等有機溶碳氫比例都較高，能夠溶解在乙醚、氯仿、苯等有機溶劑中，不溶于水。脂類化合物的這種性質(zhì)，稱之為脂溶劑中，不溶于水。脂類化合物的這種性質(zhì)，稱之為脂溶性，利用這一性質(zhì)，將脂類物質(zhì)用有機溶劑從生物體中性，利用這一性質(zhì)，將脂類物質(zhì)用有

47、機溶劑從生物體中提取出來。提取出來。 實際上，脂類藥物往往是互溶在一起的，依據(jù)脂溶實際上，脂類藥物往往是互溶在一起的，依據(jù)脂溶性這一共同特點歸為一大類成為脂類，而不是一個準確性這一共同特點歸為一大類成為脂類，而不是一個準確的化學名詞。的化學名詞。脂類藥物脂類藥物是具有重要生理生化、藥理藥效作用的脂類物質(zhì)。是具有重要生理生化、藥理藥效作用的脂類物質(zhì)。大體可分為以下幾類：大體可分為以下幾類：膽汁酸類，如膽酸、脫氧膽酸。膽汁酸類，如膽酸、脫氧膽酸。不飽和脂肪酸類，如花生四烯酸、亞麻油酸等；不飽和脂肪酸類，如花生四烯酸、亞麻油酸等； 磷脂類，如：卵磷脂、腦磷脂；磷脂類，如：卵磷脂、腦磷脂； 固醇類，如

48、：膽固醇、麥角固醇；固醇類，如：膽固醇、麥角固醇； 色素類，如：膽紅素、血紅素等；色素類，如：膽紅素、血紅素等； 其他，如鯊烯等。其他，如鯊烯等。一、脂類藥物的制備方法一、脂類藥物的制備方法1. 直接抽提法直接抽提法2. 水解法水解法3. 化學合成化學合成4. 生物合成法生物合成法二、脂類藥物的分離二、脂類藥物的分離1. 溶解度法溶解度法2. 吸附分離法吸附分離法3. 超臨界流體萃取技術超臨界流體萃取技術 待分離物質(zhì)待分離物質(zhì) 提提 取取 溶溶 劑劑（腦干提取液）（腦干提取液） 丙酮丙酮 乙醇乙醇 乙醚乙醚 膽固醇膽固醇 卵磷脂卵磷脂 腦磷脂腦磷脂 超臨界流體超臨界流體（supercritical fluid, SF）是指某種氣體（液體）或氣體（液體）混合物在操作壓力和是指某種氣體（液體）或氣體（液體）混合物在操作壓力和溫度均高于臨界點時，使其密度接近液體，而其擴散系數(shù)和溫度均高于臨界點時，使其密度接近液體，而其擴散系數(shù)和黏度均接近氣體，其性質(zhì)介于氣體和液體之間的流體。黏度均接近氣體，其性質(zhì)介于氣體和液體之間的流體。超臨界流體萃取法超臨界流體萃取法（supercritical fluid extraction, SFE）技術就是利用超臨界流體為溶劑，從固體或液體中萃取出某技術就是利用超臨界流體為溶劑，