瓊脂糖凝膠電泳

1、原理瓊脂糖凝膠電泳是用瓊脂糖作支持介質(zhì)的一種電泳方法。其分析原理與其他支持物電泳的最主要區(qū)別是：它兼有“分子篩”和“電泳”的雙重作用。瓊脂糖凝膠具有網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，物質(zhì)分子通過時會受到阻力，大分子物質(zhì)在涌動時受到的阻力大，因此在凝膠電泳中，帶電顆粒的分離不僅取決于凈電荷的性質(zhì)和數(shù)量，而且還取決于分子大小，這就大大提高了分辨能力。 但由于其孔徑相當(dāng)大， 對大多數(shù)蛋白質(zhì)來說其分子篩 效應(yīng)微不足道，現(xiàn)廣泛應(yīng)用于核酸的研究中。蛋白質(zhì)和核酸會根據(jù) pH不同帶有不同電荷，在電場中受力大小不同，因此跑的速度不 同，根據(jù)這個原理可將其分開。電泳緩沖液的pH在69之間，離子強(qiáng)度0.020.05為最適。常用1%的瓊脂糖

2、作為電泳支持物。瓊脂糖凝膠約可區(qū)分相差 100bp的DNA片段，其分辨率雖比聚丙烯酰胺凝膠低，但它制備容易，分離范圍廣。普通瓊脂糖凝膠分離DNA的范圍為0.2-20kb,利用脈沖電泳，可分離高達(dá)10A7bp的DNA片段。操作流程準(zhǔn)備干凈的配膠板和電泳槽注意DNA酶污染的儀器可能會降解 DNA,造成條帶信號弱、模糊甚至缺失的現(xiàn)象。 選擇電泳方法一般的核酸檢測只需要瓊脂糖凝膠電泳就可以；如果需要分辨率高的電泳，特別是只 有幾個bp的差別應(yīng)該選擇聚丙烯酰胺凝膠電泳；用普通電泳不合適的巨大 DNA鏈應(yīng)該使用脈沖凝膠電泳。注意巨大的DNA鏈用普通電泳可能跑不出膠孔導(dǎo)致缺帶。正確選擇凝膠濃度對于瓊脂糖凝膠

3、電泳，濃度通常在0.52 %之間，低濃度的用來進(jìn)行大片段核酸的電泳， 高濃度的用來進(jìn)行小片段分析。低濃度膠易碎，小心操作和使用質(zhì)量好的瓊脂糖是解決辦法。注意高濃度的膠可能使分子大小相近的DNA帶不易分辨，造成條帶缺失現(xiàn)象。適合的電泳緩沖液常用的緩沖液有 TAE和TBE,而TBE比TAE有著更好的緩沖能力。電泳時使用新制的緩沖液可以明顯提高電泳效果。注意電泳緩沖液多次使用后，離子強(qiáng)度降低，pH值上升，緩沖性能下降，可能使 DNA電泳產(chǎn)生條帶模糊和不規(guī)則的DNA帶遷移的現(xiàn)象。電泳的合適電壓和溫度電泳時電壓不應(yīng)該超過 20V/cm ,電泳溫度應(yīng)該低于 30 C,對于巨大的DNA電泳，溫度 應(yīng)該低于1

4、5C。注意如果電泳時電壓和溫度過高，可能導(dǎo)致出現(xiàn)條帶模糊和不規(guī)則的DNA帶遷移的現(xiàn)象。特別是電壓太大可能導(dǎo)致小片段跑出膠而出現(xiàn)缺帶現(xiàn)象 DNA樣品的純度和狀態(tài)是電壓太大可能導(dǎo)致小片段跑出膠而出現(xiàn)缺帶現(xiàn)象DNA樣品的純度和狀態(tài)注意樣品中含鹽量太高和含雜質(zhì)蛋白均可以產(chǎn)生條帶模糊和條帶缺失的現(xiàn)象。乙醇沉淀可以去除多余的鹽，用酚可以去除蛋白。注意變性的DNA樣品可能導(dǎo)致條帶模糊和缺失，也可能出現(xiàn)不規(guī)則的DNA條帶遷移。在上樣前不要對DNA樣品加熱，用20mM NaCl緩沖液稀釋可以防止DNA變性。 DNA的上樣正確的DNA上樣量是條帶清晰的保證。注意太多的DNA上樣量可能導(dǎo)致DNA帶型模糊， 而太小的

5、DNA上樣量則導(dǎo)致帶信號弱甚至缺失。TIANGEN公司DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)每次上樣 6ul 即可得到清晰均勻的條帶。Marker的選擇DNA電泳一定要使用 DNA Marker或已知大小的正對照 DNA來估計 DNA片段大小。Marker應(yīng)該選擇在目標(biāo)片段大小附近ladder較密的，這樣對目標(biāo)片段大小的估計才比較準(zhǔn)確。TIANGEN公司的DNA Marker條帶清晰，亮度均勻，質(zhì)量穩(wěn)定，是您實驗的首選。需要 注意的是 Marker的電泳同樣也要符合 DNA電泳的操作標(biāo)準(zhǔn)。如果選擇入DNA/HindIII或者入DNA/EcoRI的酶切Marker,需要預(yù)先65C加熱5min ,冰上冷卻后使用。從而避

6、免 HindIII或EcoRI酶切造成的粘性接頭導(dǎo)致的片段連接不規(guī)則或條帶信號弱等現(xiàn)象。 凝膠的染色和觀察實驗室常用的核酸染色劑是漠化乙嚏(EB),染色效果好，操作方便，但是穩(wěn)定性差，具有毒性。而其他系列例如SYBR Green, GelRed,雖然毒性小，但價格昂貴。TIANGEN公司的GeneGreen相比則是性價比高的低毒替代染料，其靈敏度比傳統(tǒng) EB染料高10倍以上。注意觀察凝膠時應(yīng)根據(jù)染料不同使用合適的光源和激發(fā)波長，如果激發(fā)波長不對，條帶則不易觀察，出現(xiàn)條帶模糊的現(xiàn)象。要跑瓊脂糖凝膠電泳，5ng就能很清楚的跑出來是這樣嗎？能夠照相的清楚的條帶，至少需要多少量呢？參考見解：5ng已經(jīng)

7、可以了，但是或許 20ng50ng-200ng效果好，在此范圍內(nèi)呈線性。把210bp的pcr產(chǎn)物進(jìn)行酶切，得到190+20bp的兩個片段，請問能用瓊脂糖凝膠電泳檢測 酶切結(jié)果嗎？用多大濃度的膠和多大的電壓呢？參考見解：可以用瓊脂糖凝膠電泳分開，電壓不變，可用1.5%到2%的膠,20bp得片斷不一定能看得到，所以應(yīng)用未酶切的 PCR片斷作對照.瓊脂糖濃度(W/V)大小范圍(bp)0.6%1000-230000.8%800-100001.0%400-80001.2%300-70001.5%200-40002%100-3000丙烯酰胺凝膠電泳更適合于分離純化小分子量核酸(5-500bp)并且分辨率高

8、，可以達(dá)到1個bp。所以建議進(jìn)行丙烯酰胺凝膠電泳試試。Marker做瓊脂糖凝膠電泳，發(fā)現(xiàn) Marker在加樣孔有一個明顯的亮帶，什么原因？參考見解：marker有時會出現(xiàn)這樣的問題，應(yīng)該是時間久了。新買時跑膠在點樣孔沒有，過一段時間就會在點樣孔出現(xiàn)亮點。也可能是蛋白，有時 DNA提的不純含有蛋白時就會出 現(xiàn)上樣孔有條帶的現(xiàn)象。瓊脂糖凝膠電泳檢測 DNA時,跑出的帶后面出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象，什么原因造成的？參考見解：DNA帶模糊？：1、DNA降解？?避免核酸酶污染。2、DNA上樣量過多？減少凝膠中DNA上樣量。3、所用電泳條件不合適 ？電泳時電壓不應(yīng)超過 20V/cm，溫度V 30 C，巨大DNA鏈，溫

9、 度應(yīng)v 15C,核查所用電泳緩沖液是否有足夠的緩沖能力。4、DNA樣含鹽過高？電泳前通過乙醇沉淀去除過多的鹽。5、有蛋白污染？電泳前酚抽提去除蛋白。6、 DNA變性，？電泳前勿加熱，用 20mM NaCl緩沖液稀釋DNA。將從組織提取的 DNA進(jìn)瓊行脂糖凝膠電泳，用的 1.5%的膠加了 EB, 80V跑1小時，漠酚藍(lán)已經(jīng)跑到頭了， 在紫外燈觀察什么帶也沒有，只見孔里面有橘紅色的亮光。好象沒跑出來，是怎么回事？參考見解：1、 根據(jù)目的條帶長度來調(diào)整凝膠濃度，一般1.5%左右，也不一定。2、 紫外燈下沒見帶，不一定沒有出孔，而是量少看不到，可以測一下濃度看一下，或 直接試跑一下PCR3、最好加一

10、個marker孔，尤其你第一次跑膠時。4、電泳時間可能過長，一般 75vx 30min左右，但是具體看漠酚藍(lán)的離孔距離和目的 條帶離孔距離。內(nèi)切酶酶切后應(yīng)該產(chǎn)生300+74+25bp的3個片段，用瓊脂糖凝膠電泳能不能跑得開？如果能，得用多少濃度？參考見解：1、 分是分的開的，只是不知道要不要看到這條帶，如果只是對多個樣本的分析的，那 是完全沒有問題的。用2.53.0%的膠跑過，不同樣本間是肯定看的到的。當(dāng)然， 25BP這條 帶是看不到的。2、 用10%的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳來進(jìn)行電泳分離，可以分開的。不過緩沖液 要用0.5的TBE不要用TAE其效果差些。下面是 10ml的配方：30%丙烯酰

11、胺母液 3.3 ml5 乂 TBE 1ml10% A.P 70 ulTEMED 5ul120v 1.5h在pH7.6的TBE緩沖液中進(jìn)行質(zhì)粒(DNA)的瓊脂糖凝膠電泳時質(zhì)粒向哪一極運(yùn)動，為 什么？如在DNA樣品中加足夠的亞精氨后再電泳會發(fā)生什么現(xiàn)象，為什么？參考見解：1、DNA分子在堿性凝膠緩沖液中帶負(fù)電荷，在電場中由負(fù)極向正極遷移。2、 樣品中加足夠的亞精氨后，亞精胺頭部的強(qiáng)陽極性使整個分子高度親和于DNA, DNA 與堿性亞精胺結(jié)合，結(jié)合分子帶陽離子。在瓊脂糖電泳時 0.5CM孔DNA上樣量不宜超過 500ng;可是當(dāng)組分不同時可加2030ug這是怎么回事？參考見解：單個條帶不超過 500

12、ng,如果有很多條帶的話，總量500ng可能就會少了點， 條帶不清晰。怎樣根據(jù)目測條帶亮度來判斷DNA濃度？參考見解：1、 跑膠時候 marker可以加成定量 marker,如1kb、100bp等marker,按說明書的量 上樣電泳，如加500ng量的DNA marker,電泳完畢后，就可將目的DNA條帶和MARKER條帶的亮度做個大致的比較，找出兩者最接近亮度的條帶。因為marker的各條帶都已知所含的DNA濃度(說明書中詳細(xì)注明)，因此根據(jù)條帶的亮度、大小大致就可推測目的DNA的 濃度。2、在通過目測 DNA濃度的時候，最好要把加樣量設(shè)一個梯度，比如從 0。5、2、4、6, 因為，如果質(zhì)粒

13、的量很濃的話，通過簡單的對一條條帶的目測產(chǎn)生的結(jié)果誤差是很大的或者利用marker(推薦DL 2000)，再用軟件做半定量分析。變性單鏈DNA在變性聚丙烯酰胺凝膠電泳中遷移率與什么有關(guān)？應(yīng)該選用什么marker ?marker上樣時要變性嗎？參考見解：電泳遷移率(mobility):如果把生物大分子的膠體溶液放在沒有干擾的電場中， 使帶電顆粒具有恒定遷移率的驅(qū)動力來自于顆粒上的有效電荷Q和電位梯度E,即：F = QE (1)帶電顆粒在遷移中同時受到來自于介質(zhì)的摩擦力F',對于球形顆粒來說，在自由溶液中此阻力服從 Stock定律：F' = 6兀r門v這里v是在介質(zhì)粘度為Y的溶液中

14、，半徑為r的帶電顆粒的移動速 度。但在凝膠中，這種阻力并不完全符合Stocks定律。F'還取決于介質(zhì)中的其它因素如凝膠厚度、顆粒大小和介質(zhì)的內(nèi)滲等。當(dāng)帶電顆粒達(dá)到穩(wěn)態(tài)運(yùn)動時，F(xiàn)=F,由(1)、(2)式推導(dǎo)出：v Q=(3)E 6 兀 r y不同的帶電顆粒在同一電場中運(yùn)動速度不同，其泳動速度用遷移率 (或稱泳動度)m來表示，定義為在電位梯度 E(V/cm)的影響下，顆粒在時間t中遷移距離d(cm),即在單位電場 強(qiáng)度(1 V/cm)時的泳動速度：v dm =(4)E t?E將代入(4),得到Qm =(5)6兀r由上式可看出電泳遷移率與球形分子、介質(zhì)粘度、顆粒所帶電荷有關(guān)。在確定的條件下，

15、某物質(zhì)的遷移率為常數(shù)，是該物質(zhì)的物化特性常數(shù)。從(4)式可以導(dǎo)出遷移率的單位是 cm2?s-1?V-1。請問配制聚丙烯酰胺凝膠電泳膠時，促凝的是TEMED還是過硫酸鉉？膠聚時間很長如何解決？參考見解：過硫酸鉉提供驅(qū)動丙烯酰胺和雙丙烯酰胺聚合所需的自由基，而TEMED通過催化過硫酸鉉形成自由基而加速它倆的聚合。膠聚合時間長可能是TEMED失效了，過硫酸鉉固體時間過久也會失效的。一個讓PAGE膠很快聚合的方法：不要先配AP (過硫酸鉉)溶液，因為 AP很容易變質(zhì)。在保證 TEMED和AP質(zhì)量的情況 下，每次配膠時，直接稱一定量的AP粉劑溶入液體狀態(tài)的 PAGE中，這樣可以保證 AP的催化能力，而且

16、可以多加一點。配25ml的PAGE交，加0.03克AP粉劑，最后加入25ulTEMED, 20分鐘左右就可以凝固(當(dāng)然這個時候拔梳子，會有少量未凝固的 PAGE在孔里形成絲狀干 擾，使加的樣品看起來不太漂亮，但一般不影響跑膠效果和條帶的形狀和位置)。DNA電泳的 MARKER怎么是扭曲的?參考見解：.最好是同時配制.電泳時緩沖1、配制膠時的緩沖液需要和電泳緩沖液不是同時配制的液高過液面1 2mm即可。2、 電泳時電壓過高，可以在電泳前15分鐘用較低電壓（3V/cm）,等條帶出孔后比較漂亮 了.然后再調(diào)電壓。3、上樣時盡量慢慢加樣，等樣品自然沉降后再加電壓。跑出的DNA帶模糊？參考見解：1、DN

17、A降解：避免核酸酶污染。2、 電泳緩沖液陳舊：電泳緩沖液多次使用后，離子強(qiáng)度降低，pH值上升，緩沖能力減 弱，從而影響電泳效果。建議經(jīng)常更換電泳緩沖液。3、 所用電泳條件不合適：電泳時電壓不應(yīng)超過 20V/cm，溫度 30C ；巨大DNA鏈電泳， 溫度應(yīng)v 15C；核查所用電泳緩沖液是否有足夠的緩沖能力。4、DNA上樣量過多：減少凝膠中 DNA上樣量。5、DNA樣含鹽過高：電泳前通過乙醇沉淀去除過多的鹽。6、有蛋白污染：電泳前酚抽提去除蛋白。7、 DNA變性：電泳前勿加熱，用 20mM NaCl緩沖液稀釋 DNA。有不規(guī)則DNA帶遷移？參考見解：1、對于入/Hind III片段cos位點復(fù)性：

18、電泳前于 65C加熱DNA 5分鐘，然后在冰上冷 卻5分鐘。2、 電泳條件不合適：電泳電壓不超過20V/cm ;溫度v 30C；經(jīng)常更換電泳緩沖液。3、DNA變性：以20mM NaCl Buffer稀釋DNA,電泳前勿加熱。跑出的DNA條帶帶弱或無 DNA帶？參考見解：1、DNA的上樣量不夠：增加 DNA的上樣量；聚丙烯酰胺凝膠電泳比瓊脂糖電泳靈敏 度稍高，上樣量可適當(dāng)降低。2、DNA降解：避免DNA的核酸酶污染。3、DNA走出凝膠：縮短電泳時間，降低電壓，增強(qiáng)凝膠濃度。4、對于EB染色的DNA,所用光源不合適？?應(yīng)用短波長（254nm）的紫外光源。跑出的DNA帶缺失不完整是怎么回事 ？參考見

19、解：？1、小DNA帶走出凝膠？?縮短電泳時間，降低電壓，增強(qiáng)凝膠濃度。2、 分子大小相近的 DNA帶不易分辨？曾加電泳時間，核準(zhǔn)正確的凝膠濃度。3、 DNA變性：電泳前請勿高溫加熱DNA鏈，以20mM NaCl Buffer稀釋DNA。DNA鏈巨大，常規(guī)凝膠電泳不合適 ？在脈沖凝膠電泳上分析。做PCR電泳后跑電泳，目的基因是489BP的，結(jié)果每次切膠回收后再跑電泳就變成500多了，快到600 了？為什么？參考見解：有時只靠電泳結(jié)果判斷是不準(zhǔn)確的，同樣的片段每次跑的遠(yuǎn)近會有不同。有經(jīng)驗顯示目的片段是 1300多，結(jié)果就跑到1000的marker T面去了，后來證實片段沒有問 題。也有做的一個片段也是這樣，是490BP理論上兩個條帶一樣，可是PCR結(jié)果顯