瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)

1、可溶性抗原與相應(yīng)抗體特異性結(jié)合，兩者比例適當(dāng)并有電解質(zhì)存在及一定的溫度條件下，經(jīng)一定的時間，可形成肉眼可見的沉淀物，稱為沉淀反應(yīng)。沉淀反應(yīng)的抗原可以 是多糖、蛋白質(zhì)、類脂等，與相應(yīng)的抗體相比，抗原分子?。?lt;20pm ），單位體積內(nèi)所含抗原量多，具有較大的反應(yīng)面積。為了使抗原抗體之間比例適合，不使抗原過剩，故一般均應(yīng)稀釋抗原，并以抗原最高稀釋度仍能與抗體出現(xiàn)沉淀反應(yīng)為該抗體的沉淀反應(yīng)效價（滴度）。免疫擴(kuò)散法就是使抗原與抗體在瓊脂糖凝膠中自由擴(kuò)散而相遇，從而形成抗原抗體復(fù)合物，由于此復(fù)合物分子量增大并產(chǎn)生聚集，不再繼續(xù)擴(kuò)散而形成肉眼可見的帶 狀或線狀沉淀帶?？乖贵w復(fù)合物的沉淀帶是一種特異性

2、的半滲透性屏障，它可以阻 止免疫學(xué)性質(zhì)與其相似的抗原抗體分子通過，而允許那些性質(zhì)不相似的分子繼續(xù)擴(kuò) 散，這樣由不同抗原或不同抗體所形成的沉淀帶各有各的位置，從而可以分離和鑒定 混合系統(tǒng)。利用瓊脂糖凝膠作為擴(kuò)散介質(zhì)是因?yàn)橐欢舛鹊沫傊悄z，其內(nèi)部為多孔網(wǎng) 狀。而且孔徑很大，可以允許大分子物質(zhì)（分子量自十幾萬到幾百萬以上）自由通過。因?yàn)榇蠖鄶?shù)抗原和抗體的分子量都在20萬以上，所以它們在瓊脂糖凝膠中幾乎可以自由擴(kuò)散。而且瓊脂糖凝膠又具有良好的化學(xué)穩(wěn)定性、含水量大、透明度好、來源方 便、處理容易等優(yōu)點(diǎn)，因此是免疫沉淀檢測技術(shù)中最理想的擴(kuò)散介質(zhì)。瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)可在試管內(nèi)、平皿中以及玻片上的瓊脂中進(jìn)行。又

3、可分為單向瓊脂 擴(kuò)散試驗(yàn)和雙向瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)兩類。單向瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)單向瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)是一種常用的定量檢測抗原的方法。將適量稀釋后的抗體與等量瓊脂混勻，澆注成板，凝固后，在板上打孔，孔徑3mm，孔間距10mm ,孔中加入抗原，每孔 10L,放置濕盒中，37 C溫箱，抗原就會向孔的四周擴(kuò)散，邊擴(kuò)散邊與瓊脂中的抗體結(jié)合。24h 48h后觀察結(jié)果，在兩者比例適當(dāng)處形成白色沉淀環(huán)。沉淀環(huán)的直徑與抗原的濃度成正比。如事先用不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)抗原制成標(biāo)準(zhǔn)曲線，則從曲線中可求出標(biāo)本中抗原的含量。本試驗(yàn)主要用于檢測標(biāo)本中各種免疫球蛋白和血清中各種補(bǔ)體成分的含量，敏感性很高。雙向瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)雙向瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)測定時將加熱溶

4、化的瓊脂或瓊脂糖澆至玻片上，等瓊脂凝固后，打多個小孔， 將抗原和抗體分別加入小孔內(nèi)，使抗原和抗體在瓊脂板上相互擴(kuò)散。當(dāng)二個擴(kuò)散圈相遇，如抗原和抗體呈特異性的結(jié)合且比例適當(dāng)時，將會形成抗原抗體復(fù)合物的沉淀，該沉淀可在瓊脂中呈現(xiàn)一條不透明的白色沉淀線。如果抗原與抗體無 關(guān),就不會出現(xiàn)沉淀線，因此可以通過該試驗(yàn)，用特異性抗體鑒定抗原，或反之用已 知抗原鑒定抗體。另外沉淀線的特征與位置不僅取決于抗原，抗體的特異性和濃度，而且與其分子 的大小及擴(kuò)散速度有關(guān)，當(dāng)抗原體存在多種成分時，將呈現(xiàn)多條沉淀線以至交叉反應(yīng) 線，因此可用來檢查抗原和免疫血清的特異性、純度或濃度比較抗原之間的異同點(diǎn)， 因而應(yīng)用范圍較廣。

5、實(shí)驗(yàn)材料1 .材料和試劑（1 ） PH8.6 , 0.1M巴比妥一一巴比妥鈉緩沖液巴比妥鈉 10.3 g巴比妥 1.84 g硫柳汞 100 mg （防腐劑）蒸儲水加熱溶解并定容至500ml（2 ） 1%預(yù)復(fù)瓊脂（或瓊脂糖）1g瓊脂（或瓊脂糖）加蒸儲水 100ml溶化即可。（3 ） 1%瓊脂糖凝膠1g瓊脂糖加50ml蒸儲水置水溶中煮沸溶解或用與波爐加熱溶解（注意不要溢出且注意加入蒸發(fā)的水），然后再加入50ml上述巴比妥緩沖液混勻，置4 C保存?zhèn)溆?。?）抗原及相應(yīng)免疫血清。2. 設(shè)備和器材玻璃板、模具，打孔器和挑針、滴管、有蓋搪瓷盒（內(nèi)鋪有濕潤的濾紙）、溫箱 （25 C）、三角燒杯、玻璃攪拌、微

6、量加樣器、其他常用器材。編輯本段操作步驟1 .預(yù)復(fù)瓊脂玻板的制備將溶化的1%預(yù)復(fù)瓊脂用滴管加玻板上，使之能將表面覆蓋即可，放于溫箱內(nèi)干 燥（或自然干燥），即可用以制備凝膠板。2.凝膠板的制備溶化瓊脂糖，在水平桌上將溶化的瓊脂糖倒在預(yù)復(fù)瓊脂玻板上，制成厚度約34mm厚的瓊脂糖凝膠板，待冷卻后根據(jù)所需形狀打孔（注意不宜在室溫下放置過久， 盡量縮短操作時間，以免干燥）。梅花型：3. 免疫擴(kuò)散及結(jié)果觀察將抗原加入中心孔，倍比稀釋的免疫血清加入周圍孔，留1孔加雙蒸水，以作空白對照（注意：加樣至孔滿為止，不可外溢）。待孔內(nèi)液體滲入凝膠后即可放于溫盒 中（如需要可重復(fù)加樣，加樣間隔時間應(yīng)掌握在第一次加樣后孔

7、內(nèi)液體尚未完全擴(kuò)散 完的情況下即加入，以免孔周圍形成不透明的白色圈）。濕盒于25 C中，一般保溫 2448h ,觀察抗原抗體產(chǎn)生的白色沉淀線。免疫血清的滴度以一定抗原濃度下出現(xiàn)白色沉淀線的最高稀釋度來表示。如不知抗原濃度是否與免疫血清相當(dāng)時，抗原也可倍比稀釋，多做幾個梅花孔以 作比較。標(biāo)本的保存為了保存標(biāo)本，可染色處理，步驟如下：（1） 用生理鹽水浸洗待保存的玻板23天，每天換水 12次，洗去多余的抗 原抗體及其他蛋白。（2） 浸洗后于玻板的凝膠上加5%甘油或用0.5%瓊脂填孔防裂，用濕的優(yōu)質(zhì)濾紙覆在凝膠上（兩者之間不要有空氣），37 C過液使其徹底干燥。（3）打濕濾紙，輕輕揭下，洗凈膠面。（