試驗(yàn)一抗體的制備及效價(jià)檢測(cè)

1、實(shí)驗(yàn)一抗體的制備及效價(jià)檢測(cè)一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康谋緦?shí)驗(yàn)是單克隆抗體技術(shù)的免疫階段的過(guò)程，為單克隆抗體技術(shù)提供免疫淋 巴細(xì)胞。了解免疫的原理，掌握免疫方法和抗血活的制備技術(shù)，掌握雙向免疫擴(kuò) 散法測(cè)定抗體的效價(jià)。二、實(shí)驗(yàn)原理機(jī)體的特異性免疫反應(yīng)是指機(jī)體受抗原物質(zhì)刺激后產(chǎn)生體液免疫和細(xì)胞免疫 的過(guò)程。一種抗原能否引發(fā)抗體反應(yīng)，一方面取決于抗原分子表面有無(wú)特異性的 化學(xué)結(jié)構(gòu)-抗原決定簇，另一方面取決于機(jī)體有無(wú)相應(yīng)的免疫活性細(xì)胞。當(dāng)上述 兩個(gè)條件具備時(shí)，抗原進(jìn)入機(jī)體經(jīng)過(guò)一定的潛伏期，抗體效價(jià)逐步上升，達(dá)到高 峰后，能維持一短暫的時(shí)期，以后乂逐漸下降，但當(dāng)?shù)诙谓佑|相同的抗原時(shí)， 抗體的上升較前次為快，高峰時(shí)的效價(jià)

2、也比前次為高。抗體持續(xù)的時(shí)間也較長(zhǎng)，此也稱為再次反應(yīng)。完全福氏佐劑的使用能夠延長(zhǎng)抗原在體內(nèi)的存留時(shí)間，增加可溶性抗原的免 疫性。通常制備抗體時(shí)常用完全福氏佐劑加強(qiáng)免疫。抗原、抗體在合適的濃度和比例條件下，抗原和其相應(yīng)的抗體在有固相支持 的液相環(huán)境中各自發(fā)生擴(kuò)散。分子雙向擴(kuò)散接觸時(shí)形成肉眼可見(jiàn)的沉淀線反應(yīng)。 抗體的效價(jià)即時(shí)指與固定濃度的抗原發(fā)生沉淀反應(yīng)時(shí)所需的最小抗體濃度。三、實(shí)驗(yàn)步驟1. 動(dòng)物的選擇：選擇2-3個(gè)月以上的小鼠。免疫作好標(biāo)號(hào)。分籠飼養(yǎng)。2. 抗原的選擇：將抗原（纖維素酶）稀釋為 4 mg/ml,即可與佐劑混合制成 乳劑用于動(dòng)物免疫。3. 佐劑和抗原乳劑的制備佐劑 完全福氏佐劑：輕

3、礦物油（石臘油）8.5 ml;羊毛脂1.5 ml;滅活結(jié)核 桿菌10 mg?？乖閯┲苽?（1）油劑：礦物油和羊毛脂按比例混合，高壓 8磅20分鐘 滅菌后作為油劑，使用前微火融化。（2）水劑：滅活結(jié)核桿菌1 mg/ml +抗原4 mg/ml（均為終濃度）。（3）油劑和水劑1: 1混合?；旌戏绞剑貉心セ蛘咦⑸淦骰旌?。4. 免疫方法：小鼠背部皮下多點(diǎn)注射，每點(diǎn)0.1ml。第一次免疫：實(shí)驗(yàn)組小鼠加佐劑的抗原。A組：每只小鼠背部、腋下多點(diǎn)注射，共計(jì) 0.4 ml磷酸緩沖液。B組：每只小鼠背部、腋下多點(diǎn)注射，共計(jì) 0.4 ml加佐劑的抗原乳劑。第二次免疫：第3周實(shí)驗(yàn)組小鼠不加佐劑抗原。A組：每只小鼠背部

4、、腋下多點(diǎn)注射，共計(jì) 0.4 ml磷酸緩沖液。B組：每只小鼠背部、腋下多點(diǎn)注射，共計(jì) 0.4 ml 2mg/ml纖維素酶液。第三次免疫：第二次免疫后1周，實(shí)驗(yàn)組小鼠不加佐劑抗原。A組：每只小鼠背部、腋下多點(diǎn)注射，共計(jì) 0.4 ml磷酸緩沖液。B組：每只小鼠背部、腋下多點(diǎn)注射，共計(jì) 0.4 ml 2mg/ml纖維素酶液。第四次免疫：第三次免疫后1周，實(shí)驗(yàn)組小鼠不加佐劑抗原。A組：每只小鼠背部、腋下多點(diǎn)注射，共計(jì) 0.4 ml磷酸緩沖液。B組：每只小鼠背部、腋下多點(diǎn)注射，共計(jì) 0.4 ml 2mg/ml纖維素酶液。5. 抗血活的制備第四次免疫一周后，乙酰麻醉小鼠，眼眶取血或心臟取血。 收集的血液置

5、于室 溫下1h左右，凝固后，置4C下，析出血活，離心，4000rpm,10min。在無(wú)菌條件， 吸出血活，分裝（0.050.2ml）,貯于-40 C以下冰箱，或凍十后貯存于 4度冰箱 保存。6 .抗體的效價(jià)檢測(cè)：雙向免疫擴(kuò)散法。瓊脂凝膠板的制備：膠布包圍一片載玻片使之形成不透水的槽。用生理鹽水 加熱溶解瓊脂配成1%溶液，均勻澆注于玻片內(nèi)。注意勿產(chǎn)生氣泡，瓊脂厚度約 2.5mm。打孔：待瓊脂凝固后，用去尖頭的吸頭（直徑約為3-4mm）在凝膠上打孔,孔間距為3-5mm。在小孔中加少量加熱的液體瓊脂，防止?jié)B漏。打孔樣式為梅花 樣，如圖TOOOOOO OC組：血清A組血清素 隹 身 纖 原 抗B組：血清加樣：加樣丁孔內(nèi)，左中間孔為抗原；右中間孔為無(wú)關(guān)抗原（牛血活白蛋白）； 邊孔為不同濃度的抗體（系列用生理鹽水稀釋的抗體1-1/2-1/4-1/8-1/16-1/32,效價(jià) 分析，本實(shí)驗(yàn)不做）。注意不要外溢（加滿為止）。結(jié)果觀察：加樣完畢，將瓊脂板平放丁濕盒內(nèi)，在室溫或37C擴(kuò)散18-24小時(shí)后，觀察結(jié)果。四. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果五. 結(jié)果討論實(shí)驗(yàn)內(nèi)容要求：（1）每組要求注射同一只小鼠； （2）在注射過(guò)程中，不要弄死小鼠；盡 量選擇淋巴較多的部位，增加小鼠產(chǎn)生抗體能力；（3）免疫后小鼠取血時(shí)，盡量讓血取在離心管中；