間接免疫熒光法測ANA

1、22021/4/27抗核抗體抗核抗體n【自身抗體】：指抗自身組織、器官、細【自身抗體】：指抗自身組織、器官、細胞及其成分的抗體胞及其成分的抗體n【ANAANA】：指抗細胞核成分（】：指抗細胞核成分（DNADNA，RNARNA，蛋，蛋白質和酶）的抗體。白質和酶）的抗體。ANAANA存在一個譜存在一個譜nANAANA新概念：抗核酸（新概念：抗核酸（Nucleic acidNucleic acid）和核）和核蛋白（蛋白（NucleoproteinNucleoprotein）抗體的總稱）抗體的總稱n某些核抗原成分在核仁和胞漿內比核質內某些核抗原成分在核仁和胞漿內比核質內更豐富更豐富32021/4/27

2、ANA檢測的意義檢測的意義n有助于疾病的診斷 如抗Sm是SLE標記抗體； 抗ScL-70 是SD的標記抗體； 抗Jo-1是PM/DM的標記抗體；n觀察疾病活動度和治療反應n研究發(fā)病機理42021/4/27【ANAANA分類分類】n抗抗DNADNA（dsDNA,ssDNA)dsDNA,ssDNA)n抗組蛋白（抗組蛋白（Histone)Histone)n抗非組蛋白（抗非組蛋白（Nonhistone,Extractable Nonhistone,Extractable Nuclear Antigen, ENANuclear Antigen, ENA）n抗核仁（抗核仁（NucleolusNucleol

3、us）52021/4/27幾種ENA的由來及同義詞nSm：病人名：SmithnRNP: u1 RNP或nRNP Nuclear RibonucleoproteinnSSA: RO Sjogrens syndrome AnSSB: La, Ha, Sjogrens syndrome BnJo-1: 病人JohnnScL-70: Scleroderma62021/4/27【ANA ANA 由由 來】來】中性粒細胞DNP(DNA-Histone)+抗DNP+補體均質體LE細胞LE細胞：并非SLE特有，PM、SD、RA、SS等結締組織病，藥物過敏，慢活肝等亦可陽性。抗DNP取代LE細胞的檢測+7202

4、1/4/27ANA的篩選：間接免疫熒光法的篩選：間接免疫熒光法+抗原抗體（血清）抗原抗體第二抗體82021/4/27ANA的篩選：間接免疫熒光法92021/4/27實驗原理：實驗原理：生物薄膜載片生物薄膜載片上的上的IgAIgA、IgGIgG、IgMIgM類類特特異性抗體異性抗體可以與可以與抗核抗原抗核抗原反應；隨后反應；隨后，結合抗體可與，結合抗體可與標記熒光的二抗標記熒光的二抗進行進行反應，并可在熒光顯微鏡下觀察。反應，并可在熒光顯微鏡下觀察。102021/4/27抗原抗原人特異性抗體FITCFITC標記的抗人抗體標記的抗人抗體FITCFITC FITCFITC載片載片實驗原理：實驗原理：

5、112021/4/27生物薄片馬賽克生物薄片馬賽克TM技術技術122021/4/27【實驗步驟】【實驗步驟】132021/4/27實驗步驟一：準備實驗步驟一：準備p檢查加樣板是否反應區(qū)親水而周邊疏水？如果不是，可用濕紙巾擦拭，必要時可使用家用洗滌劑，再用水徹底沖洗。需要消毒時，可于3的Sekusept Extra （漢高公司）中浸泡1小時。p只有當載片平衡到室溫后方可打開袋子。不要觸及生物薄片。按照要求用記號筆對玻片進行標記。142021/4/27實驗步驟二：樣品準備實驗步驟二：樣品準備l1:100稀釋血清標本。每次實驗均需加入陽性和陰性對照。對照血清使用前必須混勻。 152021/4/27實

6、驗步驟三：加樣實驗步驟三：加樣n在加樣板的每個反應區(qū)加入稀釋血清，避免產(chǎn)生氣泡。滴加完所有待測標本后才開始溫育。使用聚苯乙烯加樣板。n加樣體積: 25 l/反應區(qū)(5 x 5 mm)12345樣品1樣品2樣品3陽性對照陰性對照162021/4/27實驗步驟四：孵育實驗步驟四：孵育n將載片蓋在加樣板對應的凹槽里，反應即開始。確保每個標本均能夠與生物薄片相接觸，而標本之間不相互接觸。室溫（18-25）溫育30分鐘。172021/4/27實驗步驟五：沖洗實驗步驟五：沖洗n 用燒杯盛PBS-Tween緩沖液，流水流水沖洗載片，然后立即立即放入裝有PBS-Tween緩沖液的小杯中浸洗至少至少5分鐘分鐘。

7、182021/4/27實驗步驟六：加樣實驗步驟六：加樣n 將20l熒光標記的抗人球蛋白熒光標記的抗人球蛋白（熒光二抗）加入潔凈加樣板潔凈加樣板的每個反應區(qū)。完完全加完所有的二抗后全加完所有的二抗后，方可繼續(xù)溫育方可繼續(xù)溫育（最多可加50個載片）。建議使用連續(xù)建議使用連續(xù)加樣器加樣器。加樣前應使用加樣器混勻混勻。為為節(jié)約時間，可在第一步溫育的同時滴加節(jié)約時間，可在第一步溫育的同時滴加酶結合物至另一個加樣板的反應區(qū)中。酶結合物至另一個加樣板的反應區(qū)中。192021/4/27實驗步驟七：孵育實驗步驟七：孵育n 從PBS-Tween 清洗緩沖液中取出一張載片取出一張載片，5秒鐘秒鐘內用吸水紙擦一下背面

8、和邊緣后，立立即即將載片覆有生物薄片的一面朝下，蓋在加樣板的凹槽里。n注意：為防止破壞基質，不要擦拭反應區(qū)不要擦拭反應區(qū)的間隙。的間隙。n檢查生物薄片是否與液滴接觸良好，然后繼續(xù)下一張。n從現(xiàn)在開始，注意避免陽光直射載片。從現(xiàn)在開始，注意避免陽光直射載片。n室溫溫育30分鐘分鐘。 202021/4/27實驗步驟八：沖洗實驗步驟八：沖洗n用燒杯盛PBS-Tween緩沖液，流水流水沖洗載片，然后立即立即放入裝有PBS-Tween緩沖液的小杯中浸洗至少浸洗至少5分鐘分鐘。n可在每150ml磷酸鹽緩沖液磷酸鹽緩沖液中加10滴(150 l)伊文氏藍伊文氏藍進行復染復染。212021/4/27實驗步驟九：

9、封片實驗步驟九：封片n 在蓋玻片蓋玻片上滴加甘油甘油/PBS。n封片體積: 10 l/反應區(qū)(5 x 5 mm)n從PBS-Tween 清洗緩沖液中取出一張載片取出一張載片，用紙擦干擦干背面和四邊，注意不要擦拭反應注意不要擦拭反應區(qū)間隙。區(qū)間隙。n將載片的生物薄片朝下置于準備好的蓋玻片上，立即檢查蓋玻片是否放入載片的凹槽里，如有必要，需調整位置，正確放置。n然后再進行下一個載片的操作。222021/4/27實驗步驟十：結果判斷實驗步驟十：結果判斷熒光顯微鏡下觀察熒光。 232021/4/27結果判讀：結果判讀：n熒光顯微鏡下觀察熒光顯微鏡下觀察n 細胞核發(fā)細胞核發(fā)黃綠色熒光黃綠色熒光為為陽性陽

10、性染色細胞，染色細胞，不不發(fā)熒光發(fā)熒光為為陰性陰性。n抗原片中出現(xiàn)陽性染色細胞為抗原片中出現(xiàn)陽性染色細胞為ANA陽性，陽性，否則為陰性。否則為陰性。n陽性待檢血清可作進一步稀釋后測定效價。陽性待檢血清可作進一步稀釋后測定效價。242021/4/27【均質型】【均質型】細胞核呈均勻一致的熒光細胞核呈均勻一致的熒光252021/4/27【核仁型】【核仁型】核仁部分呈現(xiàn)熒光核仁部分呈現(xiàn)熒光262021/4/27【斑點型】【斑點型】(顆粒型顆粒型)細胞核內呈現(xiàn)斑點狀熒光細胞核內呈現(xiàn)斑點狀熒光272021/4/27【胞漿型】【胞漿型】282021/4/27【著絲點型】【著絲點型】292021/4/27

11、混合型：存在兩種以上的類型混合型：存在兩種以上的類型 混合型：存在兩種以上的類型混合型：存在兩種以上的類型302021/4/27ANA結果判斷結果判斷1：100 陰性陰性，標本中未檢測到抗核抗體1：100 陽性微量對于核均質性、著絲點、核點型等熒光模式，提示某種風濕性疾病或其他疾病1：320 陽性陽性提示某種風濕病或其他疾病滴度定義：滴度定義：與相同稀釋倍數(shù)的陰性血清相比，能觀察與相同稀釋倍數(shù)的陰性血清相比，能觀察到特異性熒光反應的最高稀釋度到特異性熒光反應的最高稀釋度312021/4/27【臨床意義】【臨床意義】n總的總的ANA檢測在臨床診斷與鑒別診斷中是一檢測在臨床診斷與鑒別診斷中是一個極

12、為重要的個極為重要的篩選篩選試驗。絕大多數(shù)自身免疫試驗。絕大多數(shù)自身免疫性疾病均可呈陽性。性疾病均可呈陽性。ANA陽性者進一步檢測陽性者進一步檢測各亞類各亞類ANA抗體對明確診斷、臨床分型、病抗體對明確診斷、臨床分型、病情觀察、預后及治療評價有重要意義。情觀察、預后及治療評價有重要意義。n未經(jīng)治療的、活動性未經(jīng)治療的、活動性SLE的陽性率為的陽性率為80%100%。藥物性狼瘡。藥物性狼瘡100%、全身硬皮病、混、全身硬皮病、混合性結綈組織病、狼瘡性肝炎、原發(fā)性膽汁合性結綈組織病、狼瘡性肝炎、原發(fā)性膽汁性肝硬化等。性肝硬化等。n干燥綜合癥（干燥綜合癥（SS）、類風關、橋本甲狀腺炎）、類風關、橋本甲狀腺炎等。等。322021/4/27活動性SLE （95-100%）非活動性SLE （80-100%）藥物誘導的紅斑狼瘡（ 100% ）混合結締組織?。?100% ）類風濕關節(jié)炎（ 20-40% ）其他風濕性疾病（ 20-50% ）進行性系統(tǒng)硬化癥 （ 85-95% ）多肌炎、皮肌炎（ 30-50% ）干燥綜合征 （ 70-80% ）慢性活動性肝炎（ 30-40% ）潰瘍性結腸炎（ 26% ）