免疫比濁檢驗(yàn)技術(shù)原理與進(jìn)展

1、整理ppt免疫比濁分析技術(shù)原理與進(jìn)展桂林英美特生物技術(shù)研究所整理ppt一、免疫學(xué)基本原理二、免疫沉淀三、免疫比濁技術(shù)原理免疫比濁檢驗(yàn)技術(shù)原理與進(jìn)展整理ppt一、免疫學(xué)基本原理1、抗原與抗體2、抗原抗體的結(jié)合免疫學(xué)反應(yīng)3、免疫學(xué)反應(yīng)的檢測技術(shù)整理ppt1、抗原與抗體l抗原（抗原（Antigen, Ag）是刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫）是刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)應(yīng)答答的物質(zhì)。的物質(zhì)。 l“應(yīng)應(yīng)” 是指抗原刺激機(jī)體產(chǎn)生是指抗原刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答產(chǎn)物免疫應(yīng)答產(chǎn)物- - -抗體或免疫效應(yīng)細(xì)胞抗體或免疫效應(yīng)細(xì)胞l“答答” 是指相應(yīng)抗原與免疫應(yīng)答產(chǎn)物結(jié)合并是指相應(yīng)抗原與免疫應(yīng)答產(chǎn)物結(jié)合并將其排除體外）將其排除體外）l抗原的

2、免疫原性和免疫反應(yīng)性抗原的免疫原性和免疫反應(yīng)性l完全抗原與半抗原完全抗原與半抗原l抗原表位與抗原結(jié)合價位抗原表位與抗原結(jié)合價位整理ppt1、抗原與抗體整理ppt1、抗原與抗體l免疫原性免疫原性 免疫原性（免疫原性（immunogenecity）是指是指抗原分子能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答（產(chǎn)生特抗原分子能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答（產(chǎn)生特異性抗體及免疫效應(yīng)細(xì)胞）的性質(zhì)。異性抗體及免疫效應(yīng)細(xì)胞）的性質(zhì)。免疫原性示意圖免疫原性示意圖整理ppt1、抗原與抗體l免疫反應(yīng)性：是指抗原分子與免疫應(yīng)答產(chǎn)物免疫反應(yīng)性：是指抗原分子與免疫應(yīng)答產(chǎn)物（抗體或免疫效應(yīng)細(xì)胞）發(fā)生特異性結(jié)合的性（抗體或免疫效應(yīng)細(xì)胞）發(fā)生特異性結(jié)

3、合的性質(zhì)。質(zhì)。致敏致敏抗體整理ppt1、抗原與抗體完全抗原完全抗原（complete antigen) 具有免疫原性和抗原具有免疫原性和抗原性的物質(zhì)。性的物質(zhì)。半抗原半抗原（hapten，又稱不完全抗原，又稱不完全抗原 incomplete antigen ）無免疫原性，只有抗原性的物質(zhì)。無免疫原性，只有抗原性的物質(zhì)。 載體（載體（carrier）賦予半抗原以免疫原性的蛋白質(zhì)。賦予半抗原以免疫原性的蛋白質(zhì)。 半抗原半抗原 + 蛋白質(zhì)（載體）蛋白質(zhì)（載體） 完全抗原。完全抗原。整理ppt BThBBBTh半抗原半抗原載體效應(yīng)示意圖載體效應(yīng)示意圖半抗原半抗原 + + 蛋白質(zhì)（載體）蛋白質(zhì)（載體）

4、完全抗原完全抗原整理ppt1、抗原與抗體抗原決定簇抗原決定簇：抗原分子存在的能：抗原分子存在的能TCR/BCR或抗體或抗體Fab片片段特異性結(jié)合的特殊化學(xué)基團(tuán)，是免疫應(yīng)答特異性的段特異性結(jié)合的特殊化學(xué)基團(tuán)，是免疫應(yīng)答特異性的物質(zhì)基礎(chǔ)。物質(zhì)基礎(chǔ)。構(gòu)象決定簇構(gòu)象決定簇 ：構(gòu)象決定簇（：構(gòu)象決定簇（conformational determinant）由空間構(gòu)象形成的決定簇，序列上不連續(xù)。由空間構(gòu)象形成的決定簇，序列上不連續(xù)。順序決定簇：順序決定簇（順序決定簇：順序決定簇（sequence determinant），又），又稱線性決定簇（稱線性決定簇（linear determinant），序列相連

5、續(xù)的），序列相連續(xù)的氨基酸肽片段構(gòu)成的決定簇。氨基酸肽片段構(gòu)成的決定簇。抗原結(jié)合價抗原結(jié)合價：抗原結(jié)合價（：抗原結(jié)合價（antigenic valence）是指能夠）是指能夠與抗體分子結(jié)合的決定簇?cái)?shù)目。與抗體分子結(jié)合的決定簇?cái)?shù)目。整理ppt1、抗原與抗體整理ppt1、抗原與抗體l抗原表位的性質(zhì)、數(shù)目、位置、空間排列和立體構(gòu)象決抗原表位的性質(zhì)、數(shù)目、位置、空間排列和立體構(gòu)象決定著抗原定著抗原- -抗體反應(yīng)的高度特異性抗體反應(yīng)的高度特異性。整理ppt1、抗原與抗體共同表位共同表位（common epitope）指）指不同抗原之間含有的相同或相似的抗不同抗原之間含有的相同或相似的抗原表位。原表位。交

6、叉反應(yīng)交叉反應(yīng)（cross-reaction）指）指抗體或致敏淋巴細(xì)胞對具有相同或相似抗體或致敏淋巴細(xì)胞對具有相同或相似表位的不同抗原均具有的反應(yīng)（交叉結(jié)合）。表位的不同抗原均具有的反應(yīng)（交叉結(jié)合）。整理ppt1、抗原與抗體抗體抗體（antibody, Ab）功能性概念）功能性概念 是由抗原刺激而產(chǎn)生并能與刺激其產(chǎn)生的抗原發(fā)生是由抗原刺激而產(chǎn)生并能與刺激其產(chǎn)生的抗原發(fā)生特異性結(jié)合的、特異性結(jié)合的、具有免疫功能的球蛋白具有免疫功能的球蛋白。抗體主要存在。抗體主要存在血清中，也存在于如呼吸道粘膜液、小腸粘膜液、唾液血清中，也存在于如呼吸道粘膜液、小腸粘膜液、唾液以及乳汁等其它體液中。以及乳汁等其它

7、體液中。 免疫球蛋白免疫球蛋白（immunoglobulin, Ig）結(jié)構(gòu)性概念）結(jié)構(gòu)性概念 具有具有抗體活性抗體活性或化學(xué)結(jié)構(gòu)或化學(xué)結(jié)構(gòu)與抗體分子相似與抗體分子相似的的球蛋白球蛋白。 抗體一定是球蛋白，球蛋白未必是抗體 整理ppt1、抗原與抗體整理ppt1、抗原與抗體“Y”型，四肽鏈型，四肽鏈重鏈重鏈 （5種種: 、 、 、 、 ） 輕鏈輕鏈 （2種種: 、）可變區(qū)可變區(qū) （V區(qū)）區(qū)） 超變區(qū)（超變區(qū)（ 又稱又稱CDR 互補(bǔ)互補(bǔ)決定區(qū)）決定區(qū)） 骨架區(qū)骨架區(qū): FR恒定區(qū)恒定區(qū) （C區(qū)）區(qū)）鉸鏈區(qū)鉸鏈區(qū)整理ppt整理ppt1、抗原與抗體根據(jù)重鏈抗原性的不同，免疫球蛋白可以根據(jù)重鏈抗原性的不同

8、，免疫球蛋白可以分為分為5 5類：類： IgG (gamma) IgA (alpha) IgM (mu) IgD (delta) IgE (epsilon) 整理ppt整理ppt1、抗原與抗體根據(jù)輕鏈根據(jù)輕鏈C區(qū)抗原性不同，免疫球蛋白可分區(qū)抗原性不同，免疫球蛋白可分為為2 2型型) ) (kappa) )型型 (lambda) )型型輕鏈存在于各類免疫球蛋白中輕鏈存在于各類免疫球蛋白中同一個免疫球蛋白分子中的輕鏈同型同一個免疫球蛋白分子中的輕鏈同型整理ppt1、抗原與抗體抗體的生物學(xué)功能抗體的生物學(xué)功能特異性結(jié)合抗原特異性結(jié)合抗原 超變區(qū)表位超變區(qū)表位 靜電力、氫鍵、范德華力靜電力、氫鍵、范德

9、華力 可逆可逆 影響因素：影響因素：PHPH、溫度溫度、電解質(zhì)電解質(zhì) 整理ppt2、抗原抗體的結(jié)合免疫學(xué)反應(yīng)l抗原抗體反應(yīng)的原理 l抗原與抗體能夠特異性結(jié)合是基于兩種分子間的結(jié)構(gòu)互補(bǔ)性與親和性，這兩種特性是由抗原與抗體分子的一級結(jié)構(gòu)決定的。 l抗原抗體反應(yīng)可分為兩個階段。第一為抗原與抗體發(fā)生特異性結(jié)合的階段，此階段反應(yīng)快，僅需幾秒至幾分鐘，但不出現(xiàn)可見反應(yīng)。第二為可見反應(yīng)階段，抗原抗體復(fù)合物在環(huán)境因素（如電解質(zhì)、pH、溫度、補(bǔ)體）的影響下，進(jìn)一步交聯(lián)和聚集，表現(xiàn)為凝集、沉淀、溶解、補(bǔ)體結(jié)合介導(dǎo)的生物現(xiàn)象等肉眼可見的反應(yīng)。l抗原抗體的結(jié)合使電荷減少或消失，蛋白質(zhì)由親水膠體轉(zhuǎn)化為疏水膠體。 l四種

10、分子間引力（電荷引力、范登華引力 、氫鍵結(jié)合力 和疏水作用 ）參與并促進(jìn)抗原抗體間的特異性結(jié)合。 整理ppt2、抗原抗體的結(jié)合免疫學(xué)反應(yīng)典型的抗原抗體結(jié)合反應(yīng)特異性識別形成抗原抗體復(fù)合物整理ppt2、抗原抗體的結(jié)合免疫學(xué)反應(yīng)l抗原抗體反應(yīng)的特點(diǎn) 特異性特異性按比例按比例可逆性可逆性整理ppt2、抗原抗體的結(jié)合免疫學(xué)反應(yīng)Antigen added 整理ppt2、抗原抗體的結(jié)合免疫學(xué)反應(yīng)l影響抗原抗體反應(yīng)的因素l電解質(zhì)（離子強(qiáng)度）：抗原與抗體發(fā)生特異性結(jié)合后，雖由親水膠體變?yōu)槭杷z體，若溶液中無電解質(zhì)參加，仍不出現(xiàn)可見反應(yīng)。為了促使沉淀物或凝集物的形成，常用0.85氯化鈉或各種緩沖液作為抗原及抗體

11、的稀釋液。由于氯化鈉在水溶液中解離成Na+和C1，可分別中和膠體粒子上的電荷，使膠體粒子的電勢下降。當(dāng)電勢降至臨界電勢（1215mV）以下時，則能促使抗原抗體復(fù)合物從溶液中析出，形成可見的沉淀物或凝集物。l酸堿度（pH）：抗原抗體反應(yīng)必須在合適的pH環(huán)境中進(jìn)行。蛋白質(zhì)具有兩性電離性質(zhì)，因此每種蛋白質(zhì)都有固定的等電點(diǎn)。抗原抗體反應(yīng)一般在pH為68進(jìn)行。PH過高或過低都將影響抗原與抗體的理化性質(zhì)，例如pH達(dá)到或接近抗原的等電點(diǎn)時，即使無相應(yīng)抗體存在，也會引起顆粒性抗原非特異性的凝集，造成假陽性反應(yīng)。l溫度：在一定范圍內(nèi)，溫度升高可加速分子運(yùn)動，抗原與抗體碰撞機(jī)會增多，使反應(yīng)加速。但若溫度高于56時

12、，可導(dǎo)致已結(jié)合的抗原抗體再解離，甚至變性或破壞；在40時，結(jié)合速度慢，但結(jié)合牢固，更易于觀察。常用的抗原抗體反應(yīng)溫度為37。每種試驗(yàn)都有其獨(dú)特的最適反應(yīng)溫度，例如冷凝集素在4左右與紅細(xì)胞結(jié)合最好，20以上反而解離。l其它：適當(dāng)振蕩也可促進(jìn)抗原抗體分子的接觸，加速反應(yīng)。整理ppt3、免疫學(xué)檢測技術(shù)凝集與沉淀比濁電位、微天平放射性核素標(biāo)記酶標(biāo)記、熒光標(biāo)記和膠體金標(biāo)記化學(xué)發(fā)光物標(biāo)記或偶聯(lián)化學(xué)發(fā)光反應(yīng) 非標(biāo)記免疫檢測技術(shù)標(biāo)記免疫檢測技術(shù)整理ppt二、免疫沉淀凝集：細(xì)菌、螺旋體和紅細(xì)胞等顆粒抗原，在適當(dāng)電解質(zhì)參與下可直接與相應(yīng)抗體結(jié)合出現(xiàn)凝集，稱為凝集反應(yīng)（agglutination）是最經(jīng)典的免疫學(xué)檢

13、測技術(shù)。 整理ppt二、免疫沉淀l免疫沉淀反應(yīng)免疫沉淀反應(yīng):(precipitation) 可溶性抗原與相應(yīng)抗體，在適宜條件下發(fā)生結(jié)合，出現(xiàn)的沉淀現(xiàn)象。免疫沉淀液體內(nèi)沉淀反應(yīng)凝膠內(nèi)沉淀反應(yīng)免疫電泳技術(shù)免疫濁度技術(shù)絮狀沉淀試驗(yàn)環(huán)狀沉淀試驗(yàn)單向擴(kuò)散試驗(yàn)雙向擴(kuò)散試驗(yàn)試管法平板法免疫電泳對流免疫電泳火箭免疫電泳免疫固定電泳透射免疫比濁t(yī)urbidimetermeasure 散射免疫比濁nephelomitermeasure 整理ppt1:21:41:81:16 1:32 1:64 1:128各管抗原倍比稀釋各管抗原倍比稀釋加入抗血清加入抗血清各管抗體量不變各管抗體量不變振搖振搖 混勻、混勻、37孵育孵

14、育沉淀量不同沉淀量不同試管內(nèi)絮狀沉淀試驗(yàn)試管內(nèi)絮狀沉淀試驗(yàn)輕搖輕搖絮絮 狀狀 沉沉示示 意意 圖圖淀淀AgAbAg整理pptAbAg凝膠內(nèi)沉淀凝膠內(nèi)沉淀試管法試管法單單向向瓊瓊脂脂擴(kuò)擴(kuò)散散試試驗(yàn)驗(yàn)整理ppt凝膠內(nèi)沉淀試驗(yàn)?zāi)z內(nèi)沉淀試驗(yàn)平板法平板法標(biāo)準(zhǔn)品抗原濃度測定標(biāo)準(zhǔn)品抗原濃度測定不同病人抗原濃度測定不同病人抗原濃度測定 將一定量的抗體混入將一定量的抗體混入瓊脂凝膠中，使待測抗瓊脂凝膠中，使待測抗原在凝膠中自由擴(kuò)散，原在凝膠中自由擴(kuò)散，與相應(yīng)抗體結(jié)合形成沉與相應(yīng)抗體結(jié)合形成沉淀環(huán)，沉淀環(huán)大小與抗淀環(huán)，沉淀環(huán)大小與抗原濃度呈正相關(guān)。原濃度呈正相關(guān)。整理ppt 凝膠內(nèi)沉淀雙向瓊脂擴(kuò)散原理示意圖Ab

15、Ag模擬圖模擬圖染色瓊脂圖染色瓊脂圖1.1.抗原抗體雙向自由擴(kuò)散抗原抗體雙向自由擴(kuò)散2.242.24小時出結(jié)果小時出結(jié)果3.3.呈現(xiàn)沉淀線或弧呈現(xiàn)沉淀線或弧整理ppt三、免疫比濁技術(shù)原理 當(dāng)當(dāng)可溶性抗原可溶性抗原與相應(yīng)抗體特異結(jié)合，二者與相應(yīng)抗體特異結(jié)合，二者比例合適比例合適時，在時，在特殊特殊的緩沖液的緩沖液中它們快速形成一定大小的抗原抗體復(fù)合物，使反應(yīng)液中它們快速形成一定大小的抗原抗體復(fù)合物，使反應(yīng)液體出現(xiàn)濁度。利用現(xiàn)代光學(xué)測量儀器對濁度進(jìn)行測定從而檢測抗體出現(xiàn)濁度。利用現(xiàn)代光學(xué)測量儀器對濁度進(jìn)行測定從而檢測抗原含量原含量。 檢測器檢測器光源光源 透鏡透鏡 濾光片濾光片平光線平光線散散射射

16、透射光透射光整理ppt光波光波比濁測定法原理示意圖比濁測定法原理示意圖d當(dāng)復(fù)合物大于入射光波的1/20時，形成不對稱前向散射，在90o以前的角度測量散射光皆取得最佳效果，散射光的量代表復(fù)合物的量 當(dāng)復(fù)合物小于入射波長時呈全透射，透射與散射相當(dāng) 整理ppt三、免疫比濁技術(shù)原理免疫比濁技術(shù)分類：按光路透射免疫比濁散射免疫比濁按測定時間終點(diǎn)比濁速率比濁按增敏劑無增敏PEG增敏膠乳增敏整理ppt透射比濁法和透射比濁法和散射比濁法光路散射比濁法光路檢測器檢測器A檢測器檢測器B IC I0 I I 透射比濁法透射比濁法 散射比濁法散射比濁法整理ppt單色器透透射射比比濁濁計(jì)計(jì)散射散射比濁計(jì)比濁計(jì)散射比濁和

17、透射比濁的區(qū)別示意圖散射比濁和透射比濁的區(qū)別示意圖透射光散射光散射光整理ppt 透射免疫比濁法透射免疫比濁法（transmission turbidimetry抗原與抗體在一定緩沖液中形成抗原與抗體在一定緩沖液中形成ICIC，當(dāng)光線透過反應(yīng)溶液時，由，當(dāng)光線透過反應(yīng)溶液時，由于溶液內(nèi)于溶液內(nèi)ICIC粒子對光線的反射和粒子對光線的反射和吸收，引起透射光減少，吸收，引起透射光減少，ICIC越多越多透射光越少，可用吸光度表示。透射光越少，可用吸光度表示。整理ppt透射免疫比濁法透射免疫比濁法反應(yīng)要求反應(yīng)要求整理ppt透射免疫比濁法l靈敏度較低。要求抗原抗體復(fù)合物分子應(yīng)足夠大、足夠多，分子太小則入射光

18、直接通過。加增敏劑。l直線光路，靈敏度有先天缺陷。設(shè)計(jì)散射比濁。l透射比濁是依據(jù)透射光減弱的原理來定量的，因此只能測定抗原抗體反應(yīng)的第二階段，檢測仍需抗原抗體溫育反應(yīng)時間，檢測時間較長。缺陷缺陷整理ppt散射免疫比濁法散射免疫比濁法 抗原抗體復(fù)合物對一定波長的光產(chǎn)生折射、偏轉(zhuǎn)，偏轉(zhuǎn)角度及散射光強(qiáng)度與復(fù)合物粒子的大小和量有關(guān)原理原理單色器散射散射比濁計(jì)比濁計(jì)散射光散射光整理ppt散射免疫比濁法散射免疫比濁法l定時散射比濁分析基本原理： 免疫沉淀反應(yīng)和散射比濁分析結(jié)合之技術(shù)，反應(yīng)分兩個階段，預(yù)反應(yīng)階段和反應(yīng)階段保證抗原不過量的方法： 確保反應(yīng)體系抗體過量 對抗原過量進(jìn)行閾值限定時間時間檢測分兩個檢

19、測分兩個在預(yù)反應(yīng)時段，在預(yù)反應(yīng)時段，加小量樣本與加小量樣本與抗原抗原/ /抗體反應(yīng)，抗體反應(yīng)，測定第一次散測定第一次散射光信號值射光信號值加全量樣本，加全量樣本，約反應(yīng)約反應(yīng) 2 2分分鐘后，第二鐘后，第二次測定散射次測定散射光信號光信號信號峰值信號峰值計(jì)算機(jī)處理計(jì)算機(jī)處理轉(zhuǎn)換為樣轉(zhuǎn)換為樣品濃度品濃度整理ppt預(yù)反應(yīng)階段5ul樣本抗原過剩區(qū)閾值信號反 應(yīng) 階 段45ul樣本7.5秒2分鐘定時散射比濁反應(yīng)曲線圖定時散射比濁反應(yīng)曲線圖抗原不過量抗原過量整理ppt散射免疫比濁法散射免疫比濁法l速率散射比濁分析基本原理： 抗原抗體結(jié)合反應(yīng)的一種動態(tài)測定法，適時檢測抗原抗體復(fù)合物形成的散射光信號。是測定

20、抗原抗體結(jié)合反應(yīng)的動態(tài)過程。 所謂速率，是在單位時間內(nèi)抗原抗體結(jié)合形成復(fù)合物的速度。將各單位時間內(nèi)形成復(fù)合物的速率及測定的散射信號連接在一起，即是動態(tài)的速率比濁分析。 當(dāng)儀器測定到某一時間內(nèi)形成速率下降時，即出現(xiàn)速率峰，該峰值的高低，即代表所測抗原的量。 速率峰值一般在25秒時出現(xiàn)。 在反應(yīng)介質(zhì)中加入一定量的促凝劑，可加速抗原抗體復(fù)合物的形成，以減少反應(yīng)時間。 速率法的優(yōu)點(diǎn)：是快速、不需要減去樣本和試劑本底讀數(shù)，校正結(jié)果也較穩(wěn)定。整理ppt抗原濃度遞增抗原濃度遞增散射光峰值散射光峰值峰值信號與抗原抗體反應(yīng)之間的關(guān)系圖峰值信號與抗原抗體反應(yīng)之間的關(guān)系圖ABCDFGHI整理ppt反應(yīng)時間（秒）06

21、085散射率抗體過量抗原過量第二峰值信號整理ppt粒子增強(qiáng)免疫比濁分析技術(shù)l基本原理 選擇一種大小適中，均勻一致的膠乳顆粒吸附或交聯(lián)抗體后，當(dāng)遇到相應(yīng)抗原時，則發(fā)生聚集，單個膠乳顆粒在入射光波長之內(nèi)，光線可透過。當(dāng)兩個膠乳顆粒凝聚時，則使透射光減少，這種減少的程度與膠乳凝集成正比，當(dāng)然也與抗原量成正比。 特點(diǎn)：變非均相反應(yīng)為均相反應(yīng)，靈敏度提高（ 0.1ng/mL ）； 聚乙烯、聚苯乙烯等高分子膠乳顆粒，直徑100200nM; 以物理吸附（多抗）或化學(xué)交聯(lián)（單抗）方式與抗體連接； 基于單抗膠乳免疫散射速率比濁技術(shù)的定量分析是發(fā)展方向。整理ppt光波光波dd 2d當(dāng)粒子直徑小于入射波長時呈全透射，透射與散射相當(dāng) 當(dāng)粒子直徑大于入射光波的1/20時，形成不對稱前向散射，在90o以前的角度測量散射光皆取得最佳效果，散射光的量代表復(fù)合物的量 整理ppt特定蛋白分析儀簡介l以免疫比濁法原理設(shè)計(jì)的特定蛋白分析儀有1970年 Immuno Preciptin）、1977年BEHRING公司開發(fā)的BL（(Behring Laser Nephelometer)）、而后該公司又先后于1985年研制出BN（Behring Nephelometer Analysers）、1987年研制出TTS（Turbi Time System