ELISA技術(shù)方法原理ppt課件

1、 酶聯(lián)免疫吸附法酶聯(lián)免疫吸附法 enzyme linked enzyme linked immunosorbent assayimmunosorbent assay，ELISAELISA.ELISA 的開展 50年代的免疫熒光年代的免疫熒光IFA和和60年代的放射性免年代的放射性免疫疫RIA分析技術(shù)之后，分析技術(shù)之后，70年代初又建立了用年代初又建立了用酶來標(biāo)志抗原或抗體的分析技術(shù)酶來標(biāo)志抗原或抗體的分析技術(shù) 1971年此項(xiàng)技術(shù)由瑞典學(xué)者年此項(xiàng)技術(shù)由瑞典學(xué)者 Engvall 和和Perlmann，荷蘭學(xué)者荷蘭學(xué)者Van Weeman和和 Schuurs分別報道，將免分別報道，將免疫技術(shù)開展為檢

2、測體液中微量物質(zhì)的固相免疫測疫技術(shù)開展為檢測體液中微量物質(zhì)的固相免疫測定方法，稱為酶聯(lián)免疫吸附測定法定方法，稱為酶聯(lián)免疫吸附測定法ELISA.ELISA的運(yùn)用ELISA法在生物醫(yī)學(xué)各領(lǐng)域的運(yùn)用范圍概括為四個方面免疫酶染色各種細(xì)胞內(nèi)成份的定位。 研討抗酶抗體的合成。 顯現(xiàn)微量的免疫沉淀反響。 定量檢測體液中抗原或抗體成份。 .ELISA根本 原理使抗原或抗體結(jié)合到某種固相載體外表，并堅持其免疫活性 使抗原或抗體與某種酶銜接成酶標(biāo)抗原或抗體，這種酶標(biāo)抗原或抗體既保管其免疫活性，又保管酶的活性結(jié)合在固相載體上的酶量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量成一定的比例。參與酶反響的底物后，底物被酶催化變?yōu)橛猩a(chǎn)物，產(chǎn)物的

3、量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān) .在ELISA方法中有三個必要的試劑：1固相的抗原或抗體，即“免疫吸附劑immunosorbent；2酶標(biāo)志的抗原或抗體，稱為“結(jié)合物conjugate；3酶反響的底物。.用于臨床檢驗(yàn)的ELISA主要有以下幾種類型： 雙抗體夾心法測抗原常用夾心法 雙抗原夾心法測抗體間接法測抗體常用 競爭法測抗原競爭法 競爭法測抗體捕獲包被法測抗體親和素-生物素 ELISA法.包被特異性抗體包被特異性抗體參與待測樣品參與待測樣品加酶標(biāo)特異性抗體加酶標(biāo)特異性抗體底物顯色底物顯色洗滌洗滌孵育洗滌孵育雙抗體夾心法測抗原. 待測抗原須有兩個可以與抗體結(jié)合的部位，其一端與包被于固相載體上的

4、抗體結(jié)合，另一端與酶標(biāo)志的特異性抗體結(jié)合。 此法適用于檢驗(yàn)各種二價或二價以上的大分子抗原，如HBsAg、HBeAg、AFP、hCG等。不能用于分子量小于5000的半抗原或小分子單價抗原的測定。.雙抗原夾心法測抗體 反響方式與雙抗體夾心法類似。 用特異性抗原進(jìn)展包被和制備酶結(jié)合物，以檢測相應(yīng)的抗體。 此法中受檢標(biāo)本不需稀釋，可直接用于測定。 乙肝標(biāo)志物中HBsAb的檢測常采用本法。關(guān)鍵在于根據(jù)抗原構(gòu)造的不同制備酶標(biāo)抗原。. 間接法測抗體 間接法是檢測抗體最常用的方法。間接法是檢測抗體最常用的方法。 原理：利用酶標(biāo)志的抗體檢測已與固相結(jié)合的原理：利用酶標(biāo)志的抗體檢測已與固相結(jié)合的 受檢抗體，故稱為

5、間接法。受檢抗體，故稱為間接法。. 操作步驟：操作步驟： 1 1將特異性抗原與固相載體銜接，構(gòu)成固相將特異性抗原與固相載體銜接，構(gòu)成固相 抗抗原，洗滌。原，洗滌。 2 2加稀釋的受檢樣本，其中的特異抗體與固加稀釋的受檢樣本，其中的特異抗體與固 相抗原相抗原結(jié)合，構(gòu)成固相抗原抗體復(fù)合物，孵育洗滌。結(jié)合，構(gòu)成固相抗原抗體復(fù)合物，孵育洗滌。3 3加酶標(biāo)抗體：與固相復(fù)合物中的抗體結(jié)合，從而使加酶標(biāo)抗體：與固相復(fù)合物中的抗體結(jié)合，從而使該抗體間接地標(biāo)志上酶，孵育洗滌。該抗體間接地標(biāo)志上酶，孵育洗滌。 4 4加底物顯色：顏色深度代表標(biāo)本中受檢抗體的量。加底物顯色：顏色深度代表標(biāo)本中受檢抗體的量。 .間接法

6、的特點(diǎn) 本法主要用于對病原體抗體的檢測而進(jìn)展傳染本法主要用于對病原體抗體的檢測而進(jìn)展傳染病的診斷。病的診斷。 間接法的優(yōu)點(diǎn)是只需變換包被抗原就可利用同間接法的優(yōu)點(diǎn)是只需變換包被抗原就可利用同一酶標(biāo)抗體檢測相應(yīng)抗體。一酶標(biāo)抗體檢測相應(yīng)抗體。 間接法勝利的關(guān)鍵在于抗原的純度。特別應(yīng)留間接法勝利的關(guān)鍵在于抗原的純度。特別應(yīng)留意除去能與普通安康人血清發(fā)生反響的雜質(zhì)。意除去能與普通安康人血清發(fā)生反響的雜質(zhì)。假設(shè)抗原中含有無關(guān)蛋白，也會因竟?fàn)幬蕉僭O(shè)抗原中含有無關(guān)蛋白，也會因竟?fàn)幬蕉绊懓恍ЧＳ绊懓恍Ч?競爭法測抗原.操作步驟如下： 1將特異抗體與固相載體銜接，構(gòu)成固相抗體。洗滌。 2待測管中

7、加受檢標(biāo)本和一定量酶標(biāo)抗原的混合溶液，使之與固相抗體反響，孵育洗滌。 3加底物顯色：參考管中由于結(jié)合的酶標(biāo)抗原最多，故顏色最深。待測管顏色越淡，表示標(biāo)本中抗原含量越多。參考管顏色深度與待測管顏色深度之差，代表受檢標(biāo)本抗原的量。.如受檢標(biāo)本中無抗原，那么酶標(biāo)抗原能順利地與固相抗體結(jié)合。如受檢標(biāo)本中含有抗原，那么與酶標(biāo)抗原以同樣的時機(jī)與固相抗體結(jié)合，競爭性地占去了酶標(biāo)抗原與固相載體結(jié)合的時機(jī)，使酶標(biāo)抗原與固相載體的結(jié)合量減少。參考管中只加酶標(biāo)抗原，孵育后，酶標(biāo)抗原與固相抗體的結(jié)合最充分。 .競爭法測抗體 當(dāng)抗原資料中的干擾物質(zhì)不易除去，或不易得到足夠的純化抗原時，可用此法檢測特異性抗體。 標(biāo)本中的

8、抗體和一定量的酶標(biāo)抗體競爭與固相抗原結(jié)合。標(biāo)本中抗體量越多，結(jié)合在固相上的酶標(biāo)抗體愈少，因此陽性反響呈色淺于陰性反響。 .捕獲包被法測抗體 樣品中針對某些抗原的特異性IgM常和特異性IgG同時存在，后者會干擾IgM抗體的測定。因此測定IgM抗本多用捕獲法。 先將一切樣品IgM包括特異性IgM和非特異性IgM固定在固相上，在去除IgG后再測定特異性IgM。.操作步驟如下： 1將抗IgM抗體銜接在固相載體上，構(gòu)成固相抗IgM，洗滌。 2參與稀釋的待測標(biāo)本：孵育后樣品中的IgM抗體被固相抗體捕獲，洗滌。 3參與特異性抗原試劑：其僅與固相上的特異性IgM結(jié)合，洗滌。 4參與針對抗原的酶標(biāo)抗體：使之與結(jié)

9、合在固相上的抗原反響結(jié)合，洗滌。 5加底物顯色：如有顏色顯示，那么表示標(biāo)本中存在特異性IgM抗體，是為陽性反響。 .親和素-生物素-ELISA法 親和素是一種糖蛋白，可由蛋清中提取。每個分子由4個亞基組成，可以和4個生物素分子親密結(jié)合。 生物素biotin又稱維生素H，存在于蛋黃中?？膳c蛋白質(zhì)、糖類和酶等多種類型的大小分子構(gòu)成生物素化的產(chǎn)物。 親和素與生物素的結(jié)合，雖不屬免疫反響，但特異性強(qiáng)，親和力大，構(gòu)成一種極為穩(wěn)定的復(fù)合體。 把親和素和生物素與ELISA偶聯(lián)起來，就可大大提高ELISA的敏感度。 .適用于適用于優(yōu)點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)留意留意雙抗體夾心法測抗原是檢測抗原最常用的方法，適用于檢驗(yàn)各種蛋白質(zhì)等

10、大分子抗原特異性高不能檢測小分子抗原及半抗原雙抗原夾心法測抗體乙肝標(biāo)志物中抗HBs的檢測常采用本法受檢標(biāo)本不需稀釋，可直接用于測定，因此其敏感度相對高于間接法關(guān)鍵在于酶標(biāo)抗原的制備，應(yīng)根據(jù)抗原構(gòu)造的不同，尋覓適宜的標(biāo)志方法。間接法測抗體是檢測抗體最常用的方法,本法主要用于對病原體抗體的檢測而進(jìn)展傳染病的診斷 只需變換包被抗原就可利用同一酶標(biāo)抗抗體建立檢測相應(yīng)抗體 1.關(guān)鍵抗原的純度關(guān)鍵抗原的純度2.另一種干擾要素為正常血清另一種干擾要素為正常血清中所含的高濃度的非特異性抗中所含的高濃度的非特異性抗體體 競爭法測抗原小分子抗原如激素和藥物等ELISA測定多用此法?？?，只需一次保溫洗滌過程需求較多的酶標(biāo)志抗原.方法方法適用于適用于競爭法測抗體當(dāng)抗原資料中的干擾物