免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)二ELISA(雙抗夾心法)1

1、整理ppt實(shí)驗(yàn)二、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)實(shí)驗(yàn)內(nèi)容：實(shí)驗(yàn)內(nèi)容：間接法測乙型肝炎病毒表面抗體（測乙型肝炎病毒表面抗體（HBsAb）Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA整理ppt酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISAELISA）是將抗原、抗體的特異性反應(yīng)與酶對底）是將抗原、抗體的特異性反應(yīng)與酶對底物的高效催化作用相結(jié)合的一種敏感性很高的實(shí)驗(yàn)技術(shù)，可用于檢測體物的高效催化作用相結(jié)合的一種敏感性很高的實(shí)驗(yàn)技術(shù)，可用于檢測體液中微量的特異性抗體或抗原。首先，抗原、抗體的特異性反應(yīng)在一種液中微量的特異性抗體或抗原。首先，抗原、抗體的特異性反應(yīng)在一種固相載體表面聚苯

2、乙烯微量反應(yīng)板孔中進(jìn)行，通過洗滌去除多余的游固相載體表面聚苯乙烯微量反應(yīng)板孔中進(jìn)行，通過洗滌去除多余的游離反應(yīng)物；然后加入酶標(biāo)記的抗體或酶標(biāo)記的抗抗體，從而形成抗體離反應(yīng)物；然后加入酶標(biāo)記的抗體或酶標(biāo)記的抗抗體，從而形成抗體抗原酶標(biāo)抗體復(fù)合物（雙抗體夾心法）或抗原抗體抗抗體復(fù)合物抗原酶標(biāo)抗體復(fù)合物（雙抗體夾心法）或抗原抗體抗抗體復(fù)合物（間接法）；此時(shí)加入酶底物和顯色劑，在酶催化底物后，液體呈現(xiàn)顯（間接法）；此時(shí)加入酶底物和顯色劑，在酶催化底物后，液體呈現(xiàn)顯色反應(yīng)。液體顯色的強(qiáng)弱與復(fù)合物中待測抗原或抗體的量呈正比，借此色反應(yīng)。液體顯色的強(qiáng)弱與復(fù)合物中待測抗原或抗體的量呈正比，借此可檢測待測抗原或

3、抗體的有無及含量?？蓹z測待測抗原或抗體的有無及含量。該技術(shù)的特點(diǎn)是敏感性高，特異性強(qiáng)，操作簡易，結(jié)果容易觀察。該技術(shù)的特點(diǎn)是敏感性高，特異性強(qiáng)，操作簡易，結(jié)果容易觀察。實(shí)驗(yàn)原理：實(shí)驗(yàn)原理：整理ppt 免疫酶技術(shù)是利用酶標(biāo)記抗體或抗原，以檢測免疫酶技術(shù)是利用酶標(biāo)記抗體或抗原，以檢測相應(yīng)抗原或抗體的一種免疫學(xué)標(biāo)記技術(shù)。其原相應(yīng)抗原或抗體的一種免疫學(xué)標(biāo)記技術(shù)。其原理是酶與抗體或抗原結(jié)合后既不改變抗體或抗理是酶與抗體或抗原結(jié)合后既不改變抗體或抗原的特異性及免疫反應(yīng)性，也不影響酶的催化原的特異性及免疫反應(yīng)性，也不影響酶的催化效能。當(dāng)存在相應(yīng)酶底物時(shí)，酶能催化產(chǎn)生有效能。當(dāng)存在相應(yīng)酶底物時(shí)，酶能催化產(chǎn)生有

4、顏色的產(chǎn)物，顏色的有無及深淺能反映相應(yīng)的顏色的產(chǎn)物，顏色的有無及深淺能反映相應(yīng)的抗原或抗體是否存在及其量的多少。抗原或抗體是否存在及其量的多少。實(shí)驗(yàn)原理：實(shí)驗(yàn)原理：整理pptELISA的測定方法包括：的測定方法包括：雙抗體夾心法：檢測抗原最常用的方法雙抗體夾心法：檢測抗原最常用的方法間接法：檢測抗體最常用的方法間接法：檢測抗體最常用的方法競爭法：既可檢測抗原，亦可檢測抗體競爭法：既可檢測抗原，亦可檢測抗體生物素親和素系統(tǒng)生物素親和素系統(tǒng)ELISA法：是在法：是在ELISA中引入生物素或親中引入生物素或親和素放大系統(tǒng)，檢測極微量的抗原或抗體的方法。和素放大系統(tǒng)，檢測極微量的抗原或抗體的方法。整理

5、ppt直接法直接法間接法間接法整理ppt整理pptBAS-ELISA 底物底物1.已知已知Ab包被固相包被固相2.加待檢標(biāo)本加待檢標(biāo)本3.加生物素標(biāo)記的特異性抗體加生物素標(biāo)記的特異性抗體4.加酶標(biāo)記的親和素加酶標(biāo)記的親和素5.加底物顯色加底物顯色親和素親和素酶酶生物素生物素待檢標(biāo)本待檢標(biāo)本biotin-avidin-system，生物素，生物素-親和素系統(tǒng)親和素系統(tǒng)此法敏感性更高。用于抗原抗體以及此法敏感性更高。用于抗原抗體以及DNA、RNA的檢測。的檢測。整理ppt材料和試劑：材料和試劑：1. HBsAg、包被液。、包被液。2.待檢人血清。待檢人血清。3.酶標(biāo)記的抗酶標(biāo)記的抗HBsAb抗體。

6、抗體。4.HBsAb陽性對照血清、陽性對照血清、HBsAb陰性對照血清陰性對照血清5.洗滌液：洗滌液：PH7.40.01mol/L PBS-吐溫吐溫20。6.底物溶液：底物溶液：OPD-H2O2或或TMD-H2O2。7.終止液：終止液：2mol/L H2SO4。8. 酶標(biāo)反應(yīng)板、移液器、恒溫箱、酶標(biāo)儀酶標(biāo)反應(yīng)板、移液器、恒溫箱、酶標(biāo)儀 酶標(biāo)板酶標(biāo)板移液器移液器酶標(biāo)儀酶標(biāo)儀整理ppt操作步驟：包被包被：將：將HBsAg用包被液作適當(dāng)稀釋（用包被液作適當(dāng)稀釋（1：100），在），在96孔反應(yīng)板中每孔加孔反應(yīng)板中每孔加100l，置，置372h后再移置后再移置4過過夜。夜。洗滌：將洗滌：將96孔反應(yīng)板

7、傾去包被液，用洗滌液孔反應(yīng)板傾去包被液，用洗滌液PBS-吐溫吐溫20加滿各孔，置加滿各孔，置3min,傾去，如此反復(fù)傾去，如此反復(fù)3次。（前兩步次。（前兩步已完成已完成） 整理ppt1.1.已知抗原包被酶標(biāo)板已知抗原包被酶標(biāo)板2.12.1棄去板內(nèi)包被抗原棄去板內(nèi)包被抗原2.22.2拍干拍干2.32.3加滿洗滌液（重復(fù)三次）加滿洗滌液（重復(fù)三次）整理ppt3.3.加樣加樣（1）陽性對照陽性對照：第：第1、2孔加孔加HBsAb陽性對照血清陽性對照血清50l；（2）陰性對照陰性對照：第：第3、4孔加孔加HBsAb陰性對照血清陰性對照血清50l；（3）空白對照空白對照：第：第5孔加生理鹽孔加生理鹽水水

8、100l；（4）余下各孔加）余下各孔加待檢血清待檢血清50l。整理ppt加加酶標(biāo)記的抗酶標(biāo)記的抗HBsAb抗體抗體：除空白對照外除空白對照外各孔各孔50l，充分，充分混勻。將即時(shí)帖覆蓋于反應(yīng)板上，混勻。將即時(shí)帖覆蓋于反應(yīng)板上，37孵育孵育30min。棄去反應(yīng)孔內(nèi)液體，拍干，用洗滌液注滿各孔、靜置棄去反應(yīng)孔內(nèi)液體，拍干，用洗滌液注滿各孔、靜置30秒、秒、再拍干，重復(fù)洗滌再拍干，重復(fù)洗滌5 次。次。(操作同操作同2)顯色顯色：各孔（包括空白對照）加底物：各孔（包括空白對照）加底物A液液50l（1滴），底滴），底物物B液液50l（1滴），置滴），置37避光溫育避光溫育15min。終止反應(yīng)終止反應(yīng)：各

9、孔加終止液：各孔加終止液50l （2mol/L H2SO4 ）。）。比色比色：將反應(yīng)板以酶標(biāo)儀：將反應(yīng)板以酶標(biāo)儀450nm處用空白孔調(diào)零，測各孔處用空白孔調(diào)零，測各孔OD值。值。 整理ppt6.顯色顯色各孔（包括空白對照）加底物各孔（包括空白對照）加底物A液液50l（1滴），底物滴），底物B液液50l（1滴），置滴），置37避光溫避光溫育育15min7.終止反應(yīng)終止反應(yīng)各孔加終止液各孔加終止液50l （2mol/L H2SO4 ）整理pptOPD（鄰苯二胺）經(jīng)酶（鄰苯二胺）經(jīng)酶作用后的顯色反應(yīng)作用后的顯色反應(yīng)終止前終止后終止前終止后TMB四甲基聯(lián)苯胺經(jīng)酶作四甲基聯(lián)苯胺經(jīng)酶作用后的顯色反應(yīng)用后的

10、顯色反應(yīng)終止前終止后終止前終止后整理ppt結(jié)果判斷：u計(jì)算：計(jì)算：判斷值陰性對照平均判斷值陰性對照平均OD值值2.1u結(jié)果判斷：待測樣品孔結(jié)果判斷：待測樣品孔OD值值大于或等于判斷值為陽性大于或等于判斷值為陽性；小于判斷值為陰性小于判斷值為陰性。注：陰性對照注：陰性對照OD值小于值小于0.05按按0.05計(jì)算，計(jì)算，大于大于0.05按實(shí)際按實(shí)際OD值計(jì)算判斷值。值計(jì)算判斷值。 整理ppt注意事項(xiàng)：試劑及待測標(biāo)本使用前應(yīng)平衡至室溫，并將試劑混勻，試劑及待測標(biāo)本使用前應(yīng)平衡至室溫，并將試劑混勻，棄去棄去12滴垂直滴加；滴垂直滴加；嚴(yán)格按照操作程序依次加樣，以保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確性；嚴(yán)格按照操作程序依次

11、加樣，以保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確性；應(yīng)盡量避免孔中有氣泡，以免所測得應(yīng)盡量避免孔中有氣泡，以免所測得OD值不準(zhǔn)確。值不準(zhǔn)確。 整理ppt思考題：1.免疫標(biāo)記技術(shù)有哪些？各有何特點(diǎn)？。2.ELISA操作過程中應(yīng)注意哪些問題？整理ppt整理ppt2009級醫(yī)療?？茝?fù)習(xí)題一、名詞解釋一、名詞解釋2.52.5* *8,8,共共2020分分 免疫、抗原、抗原決定基免疫、抗原、抗原決定基( (表位表位) )、異嗜性抗原、白細(xì)、異嗜性抗原、白細(xì)胞分化抗原、胞分化抗原、TD-AgTD-Ag、 TI-AgTI-Ag、抗體抗體、免疫球蛋白免疫球蛋白、單（多）單（多）克隆抗體克隆抗體、補(bǔ)體補(bǔ)體、經(jīng)典途徑、旁路途徑、經(jīng)典途徑

12、、旁路途徑、細(xì)胞因子細(xì)胞因子、ILIL、IFNIFN、CSFCSF、TNFTNF、MHCMHC、MHCMHC限制性、限制性、TCRTCR、BCRBCR、模式識別受體模式識別受體（PRRPRR）、抗原提呈細(xì)胞）、抗原提呈細(xì)胞（ APCAPC）、適應(yīng)性免疫應(yīng)答、免疫耐）、適應(yīng)性免疫應(yīng)答、免疫耐受、免疫調(diào)節(jié)、受、免疫調(diào)節(jié)、超敏反應(yīng)、人工主動免疫、人工被動免疫、超敏反應(yīng)、人工主動免疫、人工被動免疫、計(jì)劃免疫計(jì)劃免疫注：紅色標(biāo)記為要求掌握英文整理ppt二、填空題（二、填空題（0.50.540=2040=20分）分）三、單項(xiàng)選擇題（三、單項(xiàng)選擇題（1 130=3030=30分）分）整理ppt免疫的三大功能

13、及其生理和病理表現(xiàn)。免疫的三大功能及其生理和病理表現(xiàn)。影響抗原免疫原性的因素。影響抗原免疫原性的因素。醫(yī)學(xué)上有哪些重要的抗原。醫(yī)學(xué)上有哪些重要的抗原。簡述簡述IgIg的基本結(jié)構(gòu)。的基本結(jié)構(gòu)。免疫球蛋白有哪些主要的生物學(xué)功能？免疫球蛋白有哪些主要的生物學(xué)功能？簡述補(bǔ)體的組成。簡述補(bǔ)體的組成。補(bǔ)體活化三條途徑的比較。補(bǔ)體活化三條途徑的比較。補(bǔ)體有哪些主要生物學(xué)功能？補(bǔ)體有哪些主要生物學(xué)功能？細(xì)胞因子有哪些共同的特性？細(xì)胞因子有哪些共同的特性？細(xì)胞因子的主要生物學(xué)作用。細(xì)胞因子的主要生物學(xué)作用。簡答簡答52=10整理ppt簡述簡述MHCMHC分子的結(jié)構(gòu)及其分布。分子的結(jié)構(gòu)及其分布。HLAHLA的主要生物學(xué)功能。的主要生物學(xué)功能。T T細(xì)胞表面有哪些與其功能相關(guān)的重要分子。細(xì)胞表面有哪些與其功能相關(guān)的重要分子。B B細(xì)胞表面有哪些與其功能相關(guān)的重要分子。細(xì)胞表面有哪些與其功能相關(guān)的重要分子。巨噬細(xì)胞的主要生物學(xué)功能。巨噬細(xì)胞的主要生物學(xué)功能。簡述免疫應(yīng)答的基本過程。簡述免疫應(yīng)答的基本過程?？乖奶岢释緩剑▋蓷l）?？乖奶岢释緩剑▋蓷l）。固有免疫的組成及其與適應(yīng)性免疫的關(guān)系。固有免疫的組成及其與適應(yīng)性免疫的關(guān)系。兩種人工免疫的主要區(qū)別。預(yù)防接種的注意事項(xiàng)。兩種人工免疫的