食品中有毒微生物的測定

1、 第十二章食品中有害成分測定食品中有害成分測定第二節(jié)diyijie食品中有毒微生物的測定目錄12 食品中沙門氏菌的快速篩檢方法345 李斯特菌快速檢測方法微生物數(shù)量的快速檢測大腸桿菌O157:H7快速檢測方法金黃色葡萄球菌的快速檢測方法 微生物數(shù)量的快速檢測1.旋轉(zhuǎn)平皿計數(shù)方法2.疏水性柵格濾膜法或等格法3.皿膜系統(tǒng)4.酶底物技術(shù)5.直接外熒光濾過技術(shù)6.“即用膠”系統(tǒng)活細胞計數(shù)的改進方法1.阻抗法2.ATP生物發(fā)光技術(shù)用于估計微生物數(shù)量的新方法旋轉(zhuǎn)平皿技術(shù)方法旋轉(zhuǎn)平皿技術(shù)方法標題旋轉(zhuǎn)平皿計數(shù)方法即是把液態(tài)樣品螺旋式并不斷稀釋地接種到一個旋轉(zhuǎn)的平皿中。這一系統(tǒng)在美國已被廣泛采用，如AOAC方法

2、977.27食品和化妝品中的細菌旋轉(zhuǎn)平板法旋轉(zhuǎn)平皿計數(shù)法測定原理原理:自食品或化妝品樣品制備的菌懸液被螺旋平板注入器連續(xù)不斷地注入分布到旋轉(zhuǎn)著的瓊脂平板的表面，在瓊脂表面形成阿基米德螺旋形軌跡。當用于分液的空心針從平板中心移向邊緣時，菌液體積減少，注入的體積和瓊脂半徑間存在著指數(shù)關(guān)系。培養(yǎng)時菌落沿注液線生長。用一計數(shù)的方格來校準與瓊脂表面不同區(qū)域有關(guān)的樣品量，計數(shù)每個區(qū)域的已知菌落數(shù)，再計算細菌濃度。“”疏水性柵格濾膜法或等格法常規(guī)微生物項目：菌落總數(shù)、大腸菌群、糞大腸菌群、大腸埃希菌及霉菌、酵母計數(shù)，也有用于彎曲桿菌計數(shù)的報道。LIM等研制了臺盼藍的培養(yǎng)基使等格法能直接用于酵母菌計數(shù)。皿膜系

3、統(tǒng)皿膜系統(tǒng)可用于輪廓總數(shù)、大腸菌群、大腸埃希菌、霉菌、酵母和金黃色葡萄球菌計數(shù)。測定原理Happy every day5.12在一雙層膜系統(tǒng)內(nèi)含有干燥的營養(yǎng)物質(zhì)和冷水可溶的膠體物質(zhì)，以每系統(tǒng)1ML的加樣量講樣品直接加到基礎(chǔ)膜中間，蓋上含有膠凝劑和2,3,5-氯化三苯四氮唑的覆蓋膜，培養(yǎng)后細菌在雙層膜之間生長并顯色即可直接計數(shù)。測定原理測定原理底物酶技術(shù)直接外熒光過濾技術(shù)是測定許多食品如奶、肉、禽和禽制品、魚和魚制品、水果和蔬菜、啤酒和葡萄酒、輻射食品等食品及水中的微生物的一種快速方法。直接外熒光過濾技術(shù)原理:利用紫外光顯微鏡來快速測定活菌數(shù)。首先用一特殊濾膜過濾樣品，經(jīng)吖啶橙染色后，用紫外光顯

4、微觀察活細胞呈橙色熒光、死細胞呈綠色熒光?！凹从媚z”系統(tǒng)是根據(jù)選擇的培養(yǎng)基不同可分別用于菌落總數(shù)、大腸菌群、大腸埃希菌計數(shù)和霉菌、酵母計數(shù)，以及彎曲桿菌的計數(shù)?！凹从媚z”系統(tǒng)原理:此系統(tǒng)盛有無菌液體（或脫水干燥）培養(yǎng)基的試管，在此專用培養(yǎng)基內(nèi)含有與多種細菌酶類所對應(yīng)的底物，撿樣被細菌污染時，只要具有一種酶的活性即能與底物作用生成4-甲基傘形酮，培養(yǎng)一定時間后，在波長365的紫外光下發(fā)出藍色熒光。把樣品傾入該試管中，混勻后再將混合物倒入一個裝有膠質(zhì)的特殊培養(yǎng)皿中。混合物與膠質(zhì)接觸后便形成與瓊脂相似的復(fù)合物，經(jīng)培養(yǎng)后根據(jù)顏色指示或在紫外光下產(chǎn)生熒光計數(shù)。用于估計微生物數(shù)量的方法123這些方法主要是

5、將物理化學領(lǐng)域中的新知識新技術(shù)應(yīng)用于微生物檢測中。通過測量微生物在生長和代謝活動中發(fā)生的變化來估測微生物數(shù)量。, ,Bactometer系統(tǒng)1 1Malthus微生物發(fā)光技術(shù)2 2阻抗法Bactometer系統(tǒng)是利用阻抗變化來測定，當培養(yǎng)基因微生物的代謝活動而發(fā)生化學改變時，阻抗也發(fā)生變化。在微生物生長過程中，大分子營養(yǎng)物質(zhì)經(jīng)代謝轉(zhuǎn)變?yōu)檩^小但更為活躍的分子。在某些測定實例中，當細菌產(chǎn)生的離子濃度達到比培養(yǎng)基初始離子濃度稍低時，電導改變即可檢出。ATP生物發(fā)光技術(shù)是利用產(chǎn)生于生物體內(nèi)的化學發(fā)光現(xiàn)象而建立起來的一種檢測方法。目前發(fā)現(xiàn)的熒光素酶有細菌熒光酶和螢火蟲熒光素酶兩大類，前者是從海洋放光細菌

6、中提取，后這是從螢火蟲中提取。其方法是先將螢火蟲螢光素酶基因克隆在大腸桿菌中表達，然后將轉(zhuǎn)化體置37的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，到對數(shù)期收集菌體，用滲透壓法，凍融法提取細菌胞質(zhì)組分，經(jīng)均質(zhì)，離心，用凝膠排阻，離心交換色譜提取純酶。食品中沙門菌的快速篩檢方法沙門菌 寄居在人類動物腸道內(nèi)生化反應(yīng)和抗原構(gòu)造相似的革蘭陰性桿菌。它是人類食物中毒的主要病原之一。 沙門菌廣泛分布于自然界，而且種類多，所以，沙門菌日益引起人們的高度重視，食品中的沙門菌的檢驗也顯得非常重要。食品中沙門菌的快速篩檢方法免疫學方法分子生物學方法沙門菌顯色培養(yǎng)基法自動化傳導法免疫學方法1單克隆酶免疫色度分析篩選方法2多克隆酶免疫分析篩選方

7、法3熒光酶免疫分析篩選方法4金標免疫分析方法分子生物學方法DNA探針檢測法 DNA探針技術(shù)是最新發(fā)展起來的一向特異，靈敏，快速的檢測方法。特別適用于直接檢驗出致病性微生物，而不受非致病性微生物的影響。 聚合酶鏈式反應(yīng)【PCR】技術(shù) 該技術(shù)是由美國cetus公司和美國加利福尼亞大學于1985年聯(lián)合創(chuàng)建的，自PCR方法創(chuàng)建以來其已廣泛地應(yīng)用于致病性微生物的診斷中。自動化傳導法 自動化傳導法是根據(jù)電阻抗測量的原理，關(guān)鍵是選用適宜的培養(yǎng)基，以保證任何電導或電阻抗的變化都是由目標微生物的生長所致，通過儀器檢測電導或電阻抗的改變來確定是否存在被檢微生物。 根據(jù)選用的專一性培養(yǎng)基不同，電導或電阻抗法還可用于

8、大腸桿菌，李斯特菌，彎曲桿菌等菌的初篩檢驗。也許對于大家而言，大腸桿菌已然并不陌生，但是你對于大腸桿菌O157：H7了解多少？它到底對于我們生活有何影響？接下來就讓我們走進今天的學習大腸桿菌大腸桿菌O157：H7的特性介紹及檢測它的意義的特性介紹及檢測它的意義腸出血性大腸桿菌（EHEC）是能引起人的出血性腹瀉和腸炎的一群大腸埃希氏菌。以O(shè)157:H7血清型為代表菌株。EHEC O157:H7屬于腸桿菌科埃希氏菌屬。革蘭氏染色陰性，無芽胞，有鞭毛。危害：本菌與輕度腹瀉、溶血性尿毒綜合癥、出血性腸炎等多種人類病狀密切相關(guān)。根據(jù)大腸桿菌O157：H7的某些生化特征設(shè)計些選擇性培養(yǎng)基，在這些培養(yǎng)基上大

9、腸桿菌O157：H7與其他大腸桿菌或雜菌區(qū)分開。另一類根據(jù)菌落顏色來識別大腸桿菌O157：H7有法國梅里埃公司的“O157ID”，在這種培養(yǎng)基上大腸桿菌O157：H7顯藍色，其他大腸桿菌顯紫色。1.免疫磁珠分離法：利用磁場作用將磁珠從增菌液中沉淀，用磷酸鹽緩沖液反復(fù)沖洗，讓成分分離2.金標免疫分析法：免疫分析法利用抗原抗體特異性結(jié)合反應(yīng)檢測各種物質(zhì)（藥物、激素、蛋白質(zhì)、微生物等）的分析方法。3.酶聯(lián)免疫吸附法：酶聯(lián)免疫吸附劑測定法，簡稱酶聯(lián)免疫法，或者ELISA法。它的中心就是讓抗體與酶復(fù)合物結(jié)合，然后通過顯色來檢測。4.乳膠凝集實驗：以乳膠顆粒作為載體的一種間接凝集試驗。即吸附可溶性抗原于其

10、表面，特異性抗體與之結(jié)合后，可產(chǎn)生凝集反應(yīng)。1.DNA探針：DNA探針是以病原微生物DNA或RNA的特異性片段為模板，人工合成的帶有放射性或生物素標記的單鏈DNA片段，可用來快速檢測病原體。2.聚合酶鏈反應(yīng)：聚合酶鏈反應(yīng)或多聚酶鏈反應(yīng)（Polymerase Chain Reaction，PCR），又稱無細胞克隆技術(shù)(“free bacteria”cloning technique)，是一種對特定的DNA片段在體外進行快速擴增的新方法金黃色葡萄球菌檢驗概況l葡萄球菌屬微球菌科，本菌有19個菌種，從人體上可檢出12個種。l葡萄球菌屬主要與皮膚腺體和溫血動物的粘膜相關(guān)系，有些種是人及動物的條件致病菌

11、。l金黃色葡萄球菌對人類有致病性，通常被稱為病原性球菌。金黃色葡萄球菌可引起化膿性炎癥，又稱為化膿性球菌。金黃色葡萄球菌的生物學特性形態(tài)與染色：l 金黃色葡萄球菌的典型形態(tài)呈球形，直徑0.41.2m，大小不一，平均直徑約為0.8m。l 革蘭氏染色陽性，呈葡萄串狀排列。無鞭毛、無芽胞。在陳舊培養(yǎng)物中，衰老的菌體常轉(zhuǎn)為革蘭氏陰性。培養(yǎng)特性：l 易培養(yǎng)，對營養(yǎng)要求不高，在普通培養(yǎng)基中生長良好。l 需氧或兼性厭氧。l 最適生長溫度37，最適生長pH 7.4。耐鹽性強，在含1015%的氯化鈉培養(yǎng)基中仍能生長，可用于篩選菌種。l 在普通營養(yǎng)瓊脂平板上培養(yǎng)1824，可形成圓形、表面光滑、不透明的菌落?？僧a(chǎn)生

12、金黃色色素，色素為脂溶性，不溶于水，故色素只局限于菌落內(nèi)，不滲至培養(yǎng)中。l 在血平板上可形成明顯透明的溶血環(huán)。為型溶血。l 可產(chǎn)生卵磷脂，在卵黃高鹽培養(yǎng)基上形成周圍有白色沉淀環(huán)的菌落。l 大多數(shù)菌株分解葡萄糖、麥芽糖、蔗糖，產(chǎn)酸不產(chǎn)氣。甲基紅試驗、 VP試驗多為陽性，不產(chǎn)生靛基質(zhì)。觸酶陽性。金黃色葡萄球菌的酶l 金黃色葡萄球菌可產(chǎn)生血漿凝固酶和耐熱DNA酶。這兩種酶均與金黃色葡萄球菌的致病性有關(guān)。l 血漿凝固酶：與金黃色葡萄球菌的致病力密切相關(guān)。一般認為，血漿凝固陽性的金黃色葡萄球菌菌株有致病力。否則為無力的菌株。血漿凝固酶對熱穩(wěn)定，能抵抗6030min甚至10030min后，仍能保存大部分活

13、性。l 耐熱DNA酶作為除血漿凝固酶外鑒定金黃色葡萄球菌致病力的指標之一。該酶的最適pH為9.0。血漿凝固酶試驗 l 試驗原理：致病性的金黃色葡萄球菌產(chǎn)生的血漿凝固酶，使血漿中纖維蛋白原轉(zhuǎn)變?yōu)槔w蛋白，附著于細菌表面 ，產(chǎn)生凝固。l 金黃色葡萄球菌可產(chǎn)生兩種凝固酶：一種是與細胞壁結(jié)合的凝固酶，為結(jié)合凝固酶；另一種是菌細胞釋放于培養(yǎng)基中，為游離凝固酶。二者的抗原性不同。血漿凝固酶試驗 l 挑取BairdParker平板或血平板上可疑菌落1個或以上，分別接種到5mL BHI和營養(yǎng)瓊脂小斜面，361培養(yǎng)18 h24 h。 l 取新鮮配置兔血漿0.5mL，放入小試管中，再加入可疑菌落的BHI培養(yǎng)物0.2

14、mL0.3mL，振蕩搖勻，置361溫箱或水浴箱內(nèi)，每半小時觀察一次，觀察6h，如呈現(xiàn)凝固（即將試管傾斜或倒置時，呈現(xiàn)凝塊）或凝固體積大于原體積的一半，判定為陽性結(jié)果。 l 同時以血漿凝固酶試驗陽性和陰性葡萄球菌菌株的肉湯培養(yǎng)物作為對照。 l 結(jié)果如可疑，挑取營養(yǎng)瓊脂小斜面的菌落到5mL BHI，361培養(yǎng)18h48h，重復(fù)實驗。 結(jié)果報告l如血漿凝固酶試驗陽性，可判定為金黃色葡萄球菌 。l報告在25g（mL）樣品中檢出或未檢出金黃色葡萄球菌。2015李斯特菌快速檢測方法2015李斯特菌李斯特菌(學名:Listeria monocytogenes)，又名單核球增多性李斯特菌、李氏菌，是一種兼性厭氧細菌，為李斯特菌癥的病原體。李斯特菌是革蘭氏陽性菌，屬厚壁菌門，取名自約瑟夫李斯特。它主要以食物為傳染媒介，是最致命的食源性病原體之一。 2015 李斯特菌在環(huán)境中無處不在，在絕大多數(shù)食品中都能找到李斯特菌。肉類、蛋類、禽類、海產(chǎn)品、乳制品、蔬菜等都已被證實是李斯特菌的感染源。李斯特菌中毒嚴重的可引起血液和腦組織感染，很多國家都已經(jīng)采取措施來控制食品