DNA電泳常見(jiàn)問(wèn)題分析

1、DNA 電泳常見(jiàn)問(wèn)題凝膠電泳操作注意事項(xiàng)1、瓊脂糖：不同廠家、不同批號(hào)的瓊脂糖，其雜質(zhì)含量不同，影響DNA的遷移及熒光背景的強(qiáng)度，應(yīng)有選擇地使用。2、?凝膠的制備：凝膠中所加緩沖液應(yīng)與電泳槽中的相一致，溶化的凝膠應(yīng)及時(shí)倒入板中， 避免倒入前凝固結(jié)塊。倒入板中的凝膠應(yīng)避免出現(xiàn)氣泡，以免影響電泳結(jié)果。3、?電泳緩沖液：為保持電泳所需的離子強(qiáng)度和 pH， 應(yīng)經(jīng)常更新電泳緩沖液 。4、?樣品加入量：一般情況下， 0.5cm 寬的梳子可加 0.5 g的 DNA量, 加樣量的多少依據(jù) 加樣孔的大小及 DNA中片段的數(shù)量和大小而定 . 當(dāng)加樣孔大時(shí) , 樣品上樣量應(yīng)相應(yīng)加大 , 否 則會(huì)造成條帶淺甚至辨認(rèn)不

2、清 ; 反之則應(yīng)適當(dāng)減少加樣量， 但是上樣量過(guò)多會(huì)造成加樣孔超 載，從而導(dǎo)致拖尾或彌散，對(duì)于較大的 DNA此現(xiàn)象更明顯。5、?DNA樣品中鹽濃度會(huì)影響 DNA的遷移率，平行對(duì)照樣品應(yīng)使用同樣的緩沖條件以消除 這種影響。6、?DNA遷移率取決于瓊脂糖凝膠的濃度，遷移分子的形狀及大小。采用不同濃度的凝膠 有可能分辯范圍廣泛的 DNA分子，制備瓊脂糖凝膠可根據(jù) DNA分子的范圍來(lái)決定凝膠的濃 度。小片段 DNA的檢測(cè)應(yīng)采用聚丙烯酰胺凝膠電泳，以提高分辨率。7. 選擇的實(shí)驗(yàn)材料要新鮮，處理時(shí)間不易過(guò)長(zhǎng)。8. 在加入細(xì)胞裂解緩沖液前，細(xì)胞必須均勻分散，以減少DNA團(tuán)塊形成 。9. 提取的 DNA不易溶解

3、：不純，含雜質(zhì)較多；加溶解液太少使?jié)舛冗^(guò)大。沉淀物太干燥， 也將使溶解變得很困難。10. 電泳檢測(cè)時(shí) DNA成涂布狀：操作不慎；污染核酸酶等 。11. 分光光度分析 DNA的A280/A260小于 1.8 ；不純，含有蛋白質(zhì)等雜質(zhì)。在這種情況下， 應(yīng)加入 SDS至終濃度為 0.5%，并重復(fù)步驟 28。12. 酚/ 氯仿/ 異戊醇抽提后，其上清液太黏不易吸取：含高濃度的DNA，可加大抽提前緩沖液的量或減少所取組織的量DNA電泳常見(jiàn)問(wèn)題分析之一1? 請(qǐng)問(wèn)配制聚丙烯酰胺凝膠電泳膠時(shí)，促凝的是 TEMED還是過(guò)硫酸銨？膠聚時(shí)間很長(zhǎng) 如何解決？過(guò)硫酸銨提供驅(qū)動(dòng)丙烯酰胺和雙丙烯酰胺聚合所需的自由基，而TE

4、MED通過(guò)催化過(guò)硫酸銨形成自由基而加速它倆的聚合。膠聚合時(shí)間長(zhǎng)可能是 TEMED失效了，過(guò)硫酸銨固體時(shí)間過(guò) 久也會(huì)失效的。一個(gè)讓 PAGE膠很快聚合的方法：不要先配 AP（過(guò)硫酸銨）溶液，因?yàn)?AP很容易變質(zhì)。在保證 TEMED和 AP質(zhì)量的情況下， 每次配膠時(shí)， 直接稱(chēng)一定量的 AP粉劑溶入液體狀態(tài)的 PAGE中，這樣可以保證 AP的催化能 力，而且可以多加一點(diǎn)。配 25ml 的 PAGE膠，加 0.03 克 AP 粉劑，最后加入 25ulTEMED， 20 分鐘左右就可以凝固（當(dāng)然這個(gè)時(shí)候拔梳子，會(huì)有少量未凝固的PAGE在孔里形成絲狀干擾，使加的樣品看起來(lái)不太漂亮，但一般不影響跑膠效果和條

5、帶的形狀和位置）。 ?2? DNA 電泳的 MARKER怎么是扭曲的？1、配制膠時(shí)的緩沖液需要和電泳緩沖液不是同時(shí)配制的 .最好是同時(shí)配制 . 電泳時(shí)緩沖液 高過(guò)液面 12mm即可。2、電泳時(shí)電壓過(guò)高 , 可以在電泳前 15分鐘用較低電壓 （3V/cm）, 等條帶出孔后比較漂亮了 . 然后再調(diào)電壓。3、上樣時(shí)盡量慢慢加樣 , 等樣品自然沉降后再加電壓。3? 跑出的 DNA帶模糊？1、DNA降解：避免核酸酶污染。2、電泳緩沖液陳舊 : 電泳緩沖液多次使用后，離子強(qiáng)度降低， pH值上升，緩沖能力減弱， 從而影響電泳效果。建議經(jīng)常更換電泳緩沖液。3、所用電泳條件不合適 :電泳時(shí)電壓不應(yīng)超過(guò) 20V/

6、cm，溫度 30；巨大 DNA鏈電泳， 溫度應(yīng) 15；核查所用電泳緩沖液是否有足夠的緩沖能力。4、DNA上樣量過(guò)多：減少凝膠中 DNA上樣量。5、DNA樣含鹽過(guò)高：電泳前通過(guò)乙醇沉淀去除過(guò)多的鹽。6、有蛋白污染：電泳前酚抽提去除蛋白。7、DNA變性：電泳前勿加熱，用 20mM NaCl緩沖液稀釋 DNA。4? 有不規(guī)則 DNA帶遷移 ?1、對(duì)于 /Hind III 片段 cos 位點(diǎn)復(fù)性：電泳前于 65加熱 DNA 5分鐘，然后在冰 上冷卻 5 分鐘。2、電泳條件不合適：電泳電壓不超過(guò) 20V/cm；溫度 30 ；經(jīng)常更換電泳緩沖液。3、DNA變性：以 20mM NaCl Buffer 稀釋

7、DNA，電泳前勿加熱。5? 跑出的 DNA條帶帶弱或無(wú) DNA帶？1、DNA 的上樣量不夠：增加 DNA的上樣量；聚丙烯酰胺凝膠電泳比瓊脂糖電泳靈敏 度稍高，上樣量可適當(dāng)降低。2、DNA降解：避免 DNA的核酸酶污染。3、DNA走出凝膠：縮短電泳時(shí)間，降低電壓，增強(qiáng)凝膠濃度。4、對(duì)于 EB染色的 DNA，所用光源不合適 ?應(yīng)用短波長(zhǎng)（ 254nm）的紫外光源。6? 跑出的 DNA帶缺失不完整是怎么回事 ?1、如果是小 DNA帶走出凝膠，可以縮短電泳時(shí)間或降低電壓或增強(qiáng)凝膠濃度。2、分子大小相近的 DNA帶不易分辨 ?增加電泳時(shí)間，核準(zhǔn)正確的凝膠濃度。3、DNA 變性：電泳前請(qǐng)勿高溫加熱 DNA

8、鏈，以 20mM NaCl Buffer 稀釋 DNA。DNA鏈巨大，常規(guī)凝膠電泳不合適 ?在脈沖凝膠電泳上分析7? 做 PCR電泳后跑電泳， 目的基因是 489BP的，結(jié)果每次切膠回收后再跑電泳就變成500 多了，快到 600了？為什么？有時(shí)只靠電泳結(jié)果判斷是不準(zhǔn)確的，同樣的片段每次跑的遠(yuǎn)近會(huì)有不同。有經(jīng)驗(yàn)顯示 目的片段是 1300多，結(jié)果就跑到 1000的marker 下面去了，后來(lái)證實(shí)片段沒(méi)有問(wèn)題。也有 做的一個(gè)片段也是這樣，是 490BP.理論上兩個(gè)條帶一樣，可是 PCR結(jié)果顯示就是大小不一 致。然后回收以后的檢測(cè)結(jié)果又全部都一樣了，后來(lái)又拿去做了下一個(gè)測(cè)序，才知道根本 沒(méi)有問(wèn)題。8：

9、為什么 marker 條帶非常模糊，無(wú)法辨別具體條帶？ ?A ：出現(xiàn)上述情況，可能有以下幾個(gè)原因：1. marker 條帶出現(xiàn)了降解。請(qǐng)確保在使用過(guò)程中避免核酸酶污染； 2. 電泳緩沖液陳 舊。電泳緩沖液多次使用后，離子濃度降低， pH值上升，緩沖能力減弱，從而影響電泳效 果，建議經(jīng)常更換電泳緩沖液； 3. 電泳條件不合適。電泳時(shí)電壓應(yīng)不超過(guò) 20V/cm，溫度 應(yīng)低于 30；4. marker 上樣量過(guò)多。 請(qǐng)根據(jù)說(shuō)明書(shū)選用合適上樣量； 5. 凝膠質(zhì)量不好。 建議使用質(zhì)量較好的瓊脂糖；此外，凝膠凝固不均勻也會(huì)導(dǎo)致條帶模糊。9：為什么 marker 條帶出現(xiàn)不規(guī)則的條帶（如啞鈴狀等）？A ：出

10、現(xiàn)上述情況，多與以下幾個(gè)原因有關(guān)： 1. 電泳緩沖液陳舊。老化的電泳緩沖液 離子濃度降低， pH值上升， 緩沖能力減弱， 從而影響電泳效果， 建議經(jīng)常更換電泳緩沖液； 2. 電泳條件不合適。電泳時(shí)電壓應(yīng)不超過(guò) 20V/cm，電壓太高可能也會(huì)導(dǎo)致 marker 條帶出 現(xiàn)不規(guī)則現(xiàn)象 。此外， 凝膠質(zhì)量差以及凝膠冷卻時(shí)凝固不均勻 也會(huì)導(dǎo)致該現(xiàn)象出現(xiàn)。10 為什么 marker 條帶非常弱或者根本沒(méi)有條帶？A ：出現(xiàn)上述情況可能是： 1. marker 上樣量較低，可適當(dāng)增加上樣量； 2. 凝膠質(zhì)量 較差或凝膠凝固不均勻也會(huì)導(dǎo)致電泳條帶弱或根本沒(méi)有條帶； 3. 電泳時(shí)間過(guò)長(zhǎng)導(dǎo)致 marker 條帶跑

11、出凝膠，可縮短電泳時(shí)間，降低電壓，增加凝膠濃度。11：為什么 marker 缺帶？A ：對(duì)于含有較小片段的 marker ，如果出現(xiàn)缺帶現(xiàn)象，可能是因?yàn)椋?. 小條帶跑出凝膠或分子量大小非常相近的條帶不易辨認(rèn)所致，可適當(dāng)縮短電泳時(shí) 間，降低電壓，同時(shí)增加凝膠濃度； 2. 凝膠中 EB含量過(guò)低，導(dǎo)致大片段結(jié)合 EB量太少或 沒(méi)有，在紫外光下亮度太低，可適當(dāng)增加 EB用量。問(wèn)題原因解決辦法DNA帶 模糊?DNA降解避免核酸酶污染電泳緩沖液陳舊電泳緩沖液多次使用后，離子強(qiáng)度降低， pH 值上 升，緩沖能力減弱， 從而影響電泳效果。 建議經(jīng)常更換 電泳緩沖液所用電泳條件不合適電泳時(shí)電壓不應(yīng)超過(guò) 20V

12、/cm，溫度 30；巨大 DNA鏈電泳，溫度應(yīng) 15；核查所用電泳緩沖液是否有足夠的 緩沖能力DNA上樣量過(guò)多減少凝膠中 DNA上樣量DNA樣含鹽過(guò)高電泳前通過(guò)乙醇沉淀去除過(guò)多的鹽有蛋白污染電泳前酚抽提去除蛋白DNA變性電泳前勿加熱，用 20mM NaCl緩沖液稀釋 DNA不規(guī)則DNA帶遷移對(duì) 于 /Hind III 片段 cos 位點(diǎn)復(fù) 性電泳前于 65加熱 DNA5 分鐘，然后在冰上冷卻 5 分鐘電泳條件不合適電泳電壓不超過(guò) 20V/cm；溫度 30；經(jīng)常更換 電泳緩沖液DNA變性以 20mM NaCl Buffer 稀釋 DNA，電泳前勿加熱帶弱或 無(wú) DNA帶DNA的上樣量不夠增加 D

13、NA的上樣量；聚丙烯酰胺凝膠電泳比瓊脂糖 電泳靈敏度稍高，上樣量可適當(dāng)降低DNA降解避免 DNA的核酸酶污染DNA走出凝膠縮短電泳時(shí)間，降低電壓，增強(qiáng)凝膠濃度對(duì)于 EB 染色的DNA，所用光源不合適應(yīng)用短波長(zhǎng)（ 254nm）的紫外光源DNA帶 缺失小DNA帶走出凝膠縮短電泳時(shí)間，降低電壓，增強(qiáng)凝膠濃度分子大小相近的 DNA帶不易分辨增加電泳時(shí)間，核準(zhǔn)正確的凝膠濃度DNA 變性電泳前請(qǐng)勿高溫加熱 DNA鏈，以 20mMN aCl Buffer 稀釋 DNADNA鏈巨大常規(guī)凝膠電泳不合適 ? 在脈沖凝膠電泳上分析問(wèn)題可能原因解決方法DNAMarker 降 解核酸酶污染每次吸取時(shí)更換滅菌槍頭， 勿將

14、電泳緩沖液帶入管中；用后密閉 4°C保存保存不當(dāng)4°C 或- 20°C保存，避免多次反復(fù)凍融；不可加 熱DNA瓊脂糖質(zhì)量差使用質(zhì)量可靠的瓊脂糖制膠Marker 無(wú) 法正確分離電泳緩沖液多次使用后失效更換緩沖液條帶黯淡核酸濃度過(guò)低增加上樣量核酸降解使用不含核酸酶的試劑和耗材制備樣品DNA條帶被示蹤染料掩蓋提高上樣量；避免使用與目的片段遷移率相同的示 蹤染料條帶模 糊或彌散電泳緩沖液多次使用后失效更換緩沖液核酸部分降解使用不含核酸酶的試劑和耗材制備樣品核酸樣品純度 差，含有 DNA結(jié)合蛋 白或高濃度的鹽份酚/仿抽提或乙醇沉淀去除蛋白、鹽份等雜質(zhì)電壓過(guò)低，電泳時(shí)間過(guò)長(zhǎng)根

15、據(jù)凝膠大小和電泳緩沖液類(lèi)型， 使用適當(dāng)?shù)碾妷?進(jìn)行電泳染色時(shí)間過(guò)長(zhǎng) 或拍照前放置過(guò)久， DNA條帶彌散電泳結(jié)束后及時(shí)觀察、拍照條帶缺失DNA條帶分子量過(guò)大使用脈沖凝膠電泳分子量接近的DNA條帶沒(méi)有分開(kāi)選擇適當(dāng)?shù)哪z濃度進(jìn)行電泳電泳緩沖液使用不當(dāng)SD和 TBE緩沖液適于分析較小分子量的 DNA片段， 大片段分子不能完全分離； TAE緩沖液不適于分離很小的 DNA片段電泳時(shí)間過(guò)長(zhǎng) 或電壓過(guò)高， DNA走 出凝膠縮短電泳時(shí)間，調(diào)整電壓電極插反， DNA 走出凝膠正確連接電極方向條帶大 小不正確核酸降解或形成聚合物加熱處理或重新制備樣品 DNA 酶切 Marker 的 cos 位點(diǎn) 復(fù)性電泳前 65°C加熱 5分鐘，冰上冷卻 5 分鐘以后再 上樣相同分子量的 DNA片段由于結(jié)構(gòu)或 序列的差異而有不 同的遷移率判斷 DNA分子是否有特殊結(jié)構(gòu)，如缺口、超螺旋、 二聚體等；富含 AT 堿基的 DNA遷移率比同分子量富含 GC堿基的 DNA片段慢梳子變形，點(diǎn)樣 孔不在同一水平線 上使用完好的梳子制膠帶型異常不同樣本的上樣條件不同選用相同的上樣緩沖液，上樣量盡可能接近上樣量過(guò)大或