老齡大鼠對(duì)外周不同化學(xué)組織損傷的痛行為反應(yīng)特點(diǎn)

1、老齡大鼠對(duì)外周不同化學(xué)組織損傷的痛行為反應(yīng)特點(diǎn) 作者：葛偉陳軍李源陳會(huì)生 【關(guān)鍵詞】 熱痛敏 關(guān)鍵詞: 老齡大鼠;持續(xù)性自發(fā)痛;機(jī)械性痛敏;熱痛敏;蜜蜂毒試驗(yàn);甲醛試驗(yàn) 摘 要:目的 觀察老齡大鼠對(duì)一側(cè)足底sc蜜蜂毒液（BV）或甲醛（F）誘致外周化學(xué)組織損傷的痛行為特點(diǎn). 方法 應(yīng)用持續(xù)自發(fā)縮足反射（PSFR）、熱刺激縮足反射潛伏期（PWTL）和機(jī)械刺激縮足反射閾值（PWMT）痛反應(yīng)定量檢測方法，對(duì)老齡大鼠持續(xù)性自發(fā)痛和痛敏特點(diǎn)進(jìn)行時(shí)程觀察. 結(jié)果 老齡鼠的基礎(chǔ)PWTL和PWMT均較青年成齡鼠高;老齡大鼠一側(cè)足底sc BV或F后也可引起PSFR，但與青年成齡動(dòng)物相比BV誘致的PSFR數(shù)顯著增多

2、，但達(dá)到高峰的時(shí)間延遲30min，且反應(yīng)時(shí)程大致相同.F誘致的PS-FR在反應(yīng)形式和時(shí)程上都與青年成齡動(dòng)物無顯著差別，但是第二相PSFR數(shù)顯著減少;老齡大鼠一側(cè)足底sc F不引起損傷部位PWTL縮短和PWMT降低，相反PWTL和PWMT顯著增高以至對(duì)很強(qiáng)刺激無反應(yīng);但是，老齡大鼠一側(cè)足底皮下注入BV卻可引起損傷部位PWTL和PWMT顯著縮短或降低，初步時(shí)程觀察發(fā)現(xiàn)BV誘致的熱和機(jī)械性痛敏可持續(xù)數(shù)日以上，且后者的時(shí)程遠(yuǎn)長于前者. 結(jié)論 老齡大鼠熱和機(jī)械痛閾均較青年成齡大鼠高;外周組織損傷時(shí)，老齡大鼠持續(xù)性自發(fā)痛行為反應(yīng)根據(jù)不同模型具有不同反應(yīng)形式，但是總體表現(xiàn)為反應(yīng)緩慢，強(qiáng)度弱;sc BV誘致外

3、周組織損傷時(shí)，老齡大鼠有顯著的原發(fā)性熱和機(jī)械性痛敏，但是sc甲醛后卻不引起原發(fā)性痛敏，反而出現(xiàn)熱和機(jī)械刺激反應(yīng)缺失，提示兩種痛模型在老齡也具有不同的發(fā)生機(jī)制. Keywords:elderly rat;persistent spontaneous pain;mechan-ical hyperalgesia;heat hyperalgesia;bee venom test;formalin test Abstract:AIM To observe pain-related response character-istics of elderly rats to peripheral chemic

4、al tissue injury in-duced by subcutaneous intraplantar injection with bee venom solution（BV）or formalin（F）.METHODS By using quan-titative measurements for persistent spontaneous paw flinch-ing reflex（PSFR），paw withdrawal thermal latency（PWTL）and paw withdrawal mechanical threshold（PWMT），time course

5、and response characteristics of the persistent spontaneous pain and hyperalgesia of elderly and adult young rats were compared.RESULTS The elderly rats showed a significant increase in both PWTL and PWMT compared with the adult young rats.The elderly rats re-ceiving s.c.BV or F could also express PS

6、FR，however，the total number of the BV-induced PSFR was significantly in-creased and the peak response was delayed about30min after injection when compared with adult young rats.The response pattern and time course of the F-induced PSFR in elderly rats were similar to those of adult young rats，howeve

7、r，the num-ber of PSFR in F phase2response was significantly decreased in elderly rats.Intraplantar F injection in elderly rats was not able to induce decrease in PWTL and PWMT，reversely，it resulted in an increase in PWTL and PWMT or loss of sen-sory response to high intensity stimuli.Intraplantar BV

8、 injection in elderly rats，however，was able to induce de-crease in both PWTL and PWMT in the injured region lasting for several days and the duration for PWMT was significant longer than that for PWTL.CONCLUSION The heat and mechanical pain threshold in elderly rats are higher than those of adult yo

9、ung rats;The persistent spontaneous pain-related behavioral response in elderly rats is likely to be different in different pain models of tissue injury and the acute pain response is generally slower and weaker than that in adult young rats;The elderly rats show dramatic pri-mary heat and mechanica

10、l hyperalgesia following peripheral tissue injury by s.c.BV injection，however，the same treat-ment with F fails to produce either heat or mechanical hype-ralgesia，but causes a loss of heat and mechanical response，suggesting a difference in underlying mechanisms of the two pain models. 0 引言 近幾年的研究顯示人體

11、實(shí)驗(yàn)性痛、臨床急性和慢性病理痛都隨年齡的變化而異，因此要求疼痛的治療也應(yīng)該具有相應(yīng)的對(duì)策1 .但是，因?yàn)楫?dāng)前對(duì)疼痛年齡變化的特點(diǎn)和發(fā)生機(jī)制了解甚少，治療上仍無相應(yīng)對(duì)策.實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)隨著年齡增長，人的痛閾增高、痛耐受性降低以及對(duì)傷害性閾上刺激的辨別能力下降1，2 .當(dāng)前對(duì)這些疼痛年齡變化特點(diǎn)的神經(jīng)生物學(xué)機(jī)制尚無任何實(shí)驗(yàn)證據(jù)，原因是缺乏系統(tǒng)而深入的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和模型.本研究的目的是應(yīng)用兩種比較成熟的動(dòng)物病理痛模型 蜜蜂毒試驗(yàn)3-8 和甲醛試驗(yàn)9，10 對(duì)老齡和青年成齡大鼠基礎(chǔ)熱和機(jī)械刺激痛反射閾值、外周不同化學(xué)組織損傷誘致的持續(xù)性自發(fā)痛、原發(fā)性熱和機(jī)械性痛敏的行為特點(diǎn)進(jìn)行比較分析，以此為進(jìn)一步研究這些行為

12、特點(diǎn)的神經(jīng)生物學(xué)基礎(chǔ)提供實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ? 1 材料和方法 1.1 材料 健康自然飼養(yǎng)老齡（大于20mo齡）雄性SD大鼠20只（西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心），體質(zhì)量500600g;健康青年成齡雄性SD大鼠20只（第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心），體質(zhì)量180220g.實(shí)驗(yàn)過程中每只動(dòng)物單獨(dú)飼于塑料盒中，室溫2226，為了保持動(dòng)物晝夜生物節(jié)律，實(shí)驗(yàn)室每日8:0020:00開燈，20:008:00熄燈，行為學(xué)實(shí)驗(yàn)均在9:0018:30之間進(jìn)行.實(shí)驗(yàn)前5d每日將大鼠置于實(shí)驗(yàn)觀察箱中30min，使之適應(yīng).本實(shí)驗(yàn)是嚴(yán)格按照IASP關(guān)于應(yīng)用清醒動(dòng)物進(jìn)行疼痛實(shí)驗(yàn)研究綱要的要求來實(shí)施和完成的11 .將老齡大鼠隨機(jī)分為2

13、組:實(shí)驗(yàn)組1:左足底sc蜜峰毒液（bee venom，BV）組（n=10）;實(shí)驗(yàn)組2:左足底sc甲醛（Formalin，F(xiàn)）組（n=10）.將成年大鼠也隨機(jī)分為2組作為對(duì)照:對(duì)照組1:左足底sc BV組（n=10）;對(duì)照組2:左足底sc F組（n=10）. 所用BV溶液是將粗制凍干蜜蜂毒素（美國Sig-ma公司）溶于9g L-1 生理鹽水制成，采用質(zhì)量濃度 為4g L -1 ，體積為50L3-8 .F溶液是用9g L-1 生理鹽水溶解化學(xué)純多聚甲醛配制9.25g L-1 溶液，配制成濃度25mL L-1 的溶液，體積50L.測痛的實(shí)驗(yàn)器材為RTY-3型自動(dòng)熱刺激儀（西安峰嵐儀器廠）及von-F

14、rey纖毛機(jī)械刺激器（刺激強(qiáng)度由大到小依次為:150，120，90，60，45，39.5，37，36，30，26.5，19，12，9.5，8.0，5.8，3.7，1.7，1.0，0.6和0.3g）. 1.2 方法 1.2.1 BV與F致痛模型的建立 根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室以往的報(bào)道3，5，6 ，實(shí)驗(yàn)者輕輕地固定大鼠，用26G×5/8皮針連接1mL注射器，盡快地將50L的BV或F注入其左后肢足底中心皮下，注入后立即定量觀察動(dòng)物自發(fā)性痛反射行為（5min自發(fā)縮足反射次數(shù)）.致痛劑注射前或2h后用輻射熱刺激儀或von-Frey機(jī)械刺激器測試注射側(cè)足底熱刺激縮足反射潛伏期（paw withdrawal

15、 thermal latency，PWTL）和機(jī)械刺激縮足反射閾值（paw withdrawal mechanical thre-shold，PWMT）.BV或F注射完畢后，分別對(duì)持續(xù)自發(fā)痛縮足反射、PWTL和PWMT的變化程度與時(shí)程（給藥后2，4，8，24，48，72及96h）進(jìn)行定量評(píng)價(jià). 1.2.2 PWTL評(píng)價(jià)法3-5 將大鼠置于一底部為2mm厚玻璃板的20cm×20cm×25cm的透明有機(jī)玻璃箱中，并放置于高于實(shí)驗(yàn)臺(tái)30cm的架子上以便觀察，待測大鼠于箱中適應(yīng)30min以上，使之從不安到逐漸安靜下來.應(yīng)用RTY-3型輻射熱刺激儀，內(nèi)裝100W鹵素投射燈，調(diào)節(jié)電壓至

16、10V，調(diào)節(jié)燈源與玻璃板之間的距離，使落在足底的照射光圈直徑為5mm，記錄從照射開始至出現(xiàn)縮足逃避反射時(shí)間（s），此即為PWTL;重復(fù)測量35次，同一部位間隔10min，不同部位間隔5min，取PWTL平均值.如果大于40s大鼠仍無反應(yīng)則停止照射，以免導(dǎo)致足底組織熱損傷. 1.2.3 PWMT評(píng)價(jià)法3-5 以不同粗細(xì)和長度的尼龍絲制成17個(gè)刺激強(qiáng)度不同（0.345g）的von-Frey機(jī)械刺激器.將一20cm×20cm×25cm的透明有機(jī)玻璃箱放置于頂部為鐵絲網(wǎng)高30cm的架子上，實(shí)驗(yàn)者手持von-Frey纖維穿過鐵絲網(wǎng)格分別刺激大鼠兩側(cè)足底中心部位，刺激由小到大，每個(gè)強(qiáng)度

17、反復(fù)刺激10次（次-次間隔35s），將出現(xiàn)縮足反射5次左右的強(qiáng)度定為PWMT. 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理:實(shí)驗(yàn)結(jié)果以x ±s表示，應(yīng)用方差分析（ANOVA Fishers PLSD）做統(tǒng)計(jì)學(xué)處理. 2 結(jié)果 2.1 基礎(chǔ)PWTL和PWMT 老齡鼠的基礎(chǔ)PWTL和PWMT分別為（17.91±2.29）s和（67.29±10.74）g，而青年成齡鼠的基礎(chǔ)PWTL和PWMT分別為（11.95±1.03）s和（30.82±7.13）g，兩組經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)比較具有顯著差別（每組n=20，P<0.01）. 2.2 持續(xù)自發(fā)痛反應(yīng) 用BV和F兩種持續(xù)自發(fā)痛模型進(jìn)行

18、檢測，結(jié)果顯示老齡鼠持續(xù)自發(fā)痛反應(yīng)與成齡鼠有一定區(qū)別.與青年成齡鼠相比，sc BV后老齡鼠注射側(cè)每5min自發(fā)縮足反射平均次數(shù)顯著增加（43.75±6.26vs31.94±3.04，每組n=10，P<0.01），持續(xù)時(shí)程約12h，但不同的是反射次數(shù)在BV注射即刻較青齡鼠少，爾后逐漸增多，且達(dá)到峰值時(shí)間延遲了30min.老齡鼠與青年成齡鼠在F第1相持續(xù)自發(fā)痛反應(yīng)期（010min）無顯著差別，但是在第2相反應(yīng)期（1150min）前組顯著少于后組（37.36±6.73vs58.38±6.85，每組n=10，P<0.01）.老齡鼠在F

19、反應(yīng)模型中時(shí)程和形式無變化. 2.3 BV誘致原發(fā)性熱痛敏與機(jī)械痛敏 與成齡鼠相似，老齡鼠足底sc BV后也可導(dǎo)致注射側(cè)后足底PWTL和PWMT顯著降低，與基礎(chǔ)值相比下降了50%60%.時(shí)程觀察發(fā)現(xiàn)PWTL降低可持續(xù)824h，但和PWMT降低持續(xù)7296h以上. 2.4 F誘致熱刺激和機(jī)械刺激反應(yīng) 老齡鼠足底sc F后，注射處PWTL和PWMT均升高，甚至反應(yīng)消失. 3 討論 本研究首次對(duì)老齡和青年成齡大鼠對(duì)外周不同化學(xué)組織損傷誘致的持續(xù)性自發(fā)痛、原發(fā)性熱和機(jī)械性痛敏的行為特點(diǎn)進(jìn)行了比較分析，發(fā)現(xiàn):與青年成齡大鼠相似3-6，9，10 ，老齡大鼠對(duì)外周sc BV或F所誘致的化學(xué)組織損傷具有不同的

20、持續(xù)自發(fā)痛行為反應(yīng)形式，BV和F均可誘致持續(xù)自發(fā)縮足反射行為，但是前者的反應(yīng)形式為單相性，而后者的反應(yīng)形式為雙相性，提示兩個(gè)持續(xù)痛反應(yīng)模型的反應(yīng)形式無顯著年齡差別;但是，老齡大鼠持續(xù)自發(fā)痛行為反應(yīng)的高峰時(shí)間和強(qiáng)度（自發(fā)縮足頻數(shù)）與青年成齡大鼠存在顯著年齡差別，而且具有模型間的差異.如與青年成齡大鼠相比，老齡大鼠一側(cè)足底sc BV后誘致的自發(fā)縮足反射次數(shù)達(dá)到高峰的時(shí)間顯著延遲30min左右，反應(yīng)次數(shù)隨時(shí)程逐漸顯著增多.但是，F(xiàn)誘致的自發(fā)縮足反射第一相和第二相均無顯著時(shí)間延遲，第一相反射頻數(shù)也無年齡差異;但第二相自發(fā)縮足反射數(shù)減少，具有顯著年齡差異.這個(gè)結(jié)果提示外周不同化學(xué)組織損傷所誘致的持續(xù)自發(fā)

21、痛反射行為具有年齡差異，而且在老齡動(dòng)物兩種痛模型所表現(xiàn)出 來的最強(qiáng)痛反應(yīng)發(fā)生時(shí)間和強(qiáng)度都不相同，建議研究痛的年齡變化必須同時(shí)用多種痛模型比較研究才可能得出可靠的實(shí)驗(yàn)結(jié)果和結(jié)論;與青年成齡大鼠相似3，5，6 ，老齡大鼠對(duì)外周不同化學(xué)組織損傷所誘致的刺激誘發(fā)痛敏感性改變不同，如老齡大鼠一側(cè)足底sc F不引起損傷部位PWTL縮短和PWMT降低，相反PWTL和PWMT顯著增高以至對(duì)很強(qiáng)刺激無反應(yīng)，提示F導(dǎo)致了外周組織感受器的滅活或損傷;但是老齡大鼠一側(cè)足底sc BV卻可引起損傷部位PWTL和PWMT顯著縮短或降低，且時(shí)程可持續(xù)數(shù)日以上，提示BV可誘發(fā)原發(fā)性熱和機(jī)械痛敏或觸誘發(fā)痛（Allodynia）;

22、與青年成齡大鼠不同，老齡大鼠原發(fā)性熱痛敏和機(jī)械痛敏的時(shí)程不同，后者遠(yuǎn)長于前者，提示原發(fā)性機(jī)械痛敏和觸誘發(fā)痛具有年齡差異且老齡動(dòng)物更易慢性化;老齡大鼠基礎(chǔ)熱和機(jī)械痛閾均較青年成齡大鼠高，這個(gè)結(jié)果與人的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相似1 ;從年齡變化的結(jié)果基本一致性來看，BV和F兩種痛模型在老齡和青年成齡大鼠的表現(xiàn)均不同，強(qiáng)烈提示痛模型間存在差異性和發(fā)生機(jī)制的多樣性，這與我們以往發(fā)現(xiàn)的結(jié)果完全一致8 . 關(guān)于年齡因素對(duì)痛反應(yīng)和痛感受的影響，已有一些人和動(dòng)物的實(shí)驗(yàn)報(bào)道.年齡增長對(duì)軀體感覺皮質(zhì)誘發(fā)電位傳導(dǎo)速度有顯著影響12 ，老齡人對(duì)皮膚辣椒素刺激誘發(fā)自發(fā)痛出現(xiàn)的報(bào)告時(shí)間也較青年成人延遲12s左右13 ，老齡鼠熱板試驗(yàn)潛

23、伏期顯著延長14 ，此外動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果還顯示外周神經(jīng)纖維可隨年齡增長脫髓鞘，同時(shí)髓鞘蛋白基因下調(diào)15 ，這些結(jié)果似乎可以解釋為什么大鼠年齡增長伴隨基礎(chǔ)熱和機(jī)械痛閾增高以及對(duì)外周組織損傷誘發(fā)的自發(fā)痛感知的潛伏期延長的原因. 年齡因素對(duì)自發(fā)痛反應(yīng)和痛敏的影響已在F試驗(yàn)2 、辣椒素模型13 和坐骨神經(jīng)結(jié)扎損傷模型16 的研究中得到報(bào)道.已報(bào)道的F試驗(yàn)顯示，F(xiàn)的自發(fā)痛反應(yīng)（用4級(jí)負(fù)重法評(píng)價(jià)）在青年成齡（3mo）和老齡大鼠（24mo）弱，而在中年成齡大鼠（18mo）最強(qiáng)2 ，反應(yīng)形式和時(shí)程大致相同.這與本研究使用的自發(fā)縮足次數(shù)評(píng)價(jià)方法的結(jié)果基本相似.但是我們應(yīng)用的BV模型的結(jié)果卻與F試驗(yàn)結(jié)果不同，所以大鼠

24、不同年齡變化對(duì)BV誘致自發(fā)痛反應(yīng)的影響還需進(jìn)一步分時(shí)間段觀察.辣椒素模型人的研究結(jié)果顯示老齡和青年被試者的自發(fā)痛感覺強(qiáng)度、皮膚紅暈和熱痛敏的面積均無顯著差別，但是老齡被試者機(jī)械痛敏區(qū)的面積顯著增大、機(jī)械痛閾顯著下降、機(jī)械痛敏時(shí)程顯著延長，但是熱痛敏無年齡差別13 .坐骨神經(jīng)結(jié)扎損傷模型老齡痛也主要表現(xiàn)為觸刺激誘發(fā)痛增強(qiáng)16 .這些結(jié)果與本研究BV誘致的原發(fā)性熱和機(jī)械性痛敏的特點(diǎn)極其相似.但是辣椒素誘致的熱痛敏在1h后消失，機(jī)械性痛敏在3h后消失，而本實(shí)驗(yàn)BV誘致的熱痛敏可持續(xù)824h，機(jī)械性痛敏的時(shí)程可持續(xù)數(shù)日，所以提示BV模型在研究老齡外周組織損傷炎癥痛敏的發(fā)生和慢性化機(jī)制中更有價(jià)值.老齡大

25、鼠和人機(jī)械痛敏范圍大、時(shí)程較長的發(fā)生機(jī)制不清，但是很可能與外周感受器和脊髓中樞敏化雙重機(jī)制有關(guān)8 .實(shí)驗(yàn)證據(jù)顯示口周sc F可使老齡大鼠延髓三叉神經(jīng)脊束核淺層c-Fos蛋白表達(dá)顯著增多，而且前后神經(jīng)軸的長度增加17 .神經(jīng)化學(xué)和免疫組織化學(xué)染色的結(jié)果顯示脊髓內(nèi)源下行痛抑制系統(tǒng)的5-HT和去甲腎上腺素能纖維顯著減少 17，18 .這提示老齡痛敏時(shí)程延長可能與下行痛抑制系統(tǒng)的減弱有一定關(guān)系.但是根據(jù)青年成齡動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究的結(jié)果，我們推測更重要的是外周組織損傷時(shí)脊髓初級(jí)傳入沖動(dòng)的不斷傳入可使脊髓背角傷害性神經(jīng)元如廣動(dòng)力域（WDR）神經(jīng)元興奮性增高、敏感性增強(qiáng)，這一過程首先由初級(jí)傳入終末釋放谷氨酸和神經(jīng)

26、肽如P物質(zhì)，導(dǎo)致NMDA/AMPA/NK受體和VDCC通道激活，胞內(nèi)Ca2+ 增高，進(jìn)而胞內(nèi)蛋白激酶（PKC，PKA，PKG）、環(huán)氧合酶2-PGE2等信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)激活，進(jìn)一步使WDR神經(jīng)元對(duì)機(jī)械刺激敏感性增強(qiáng)，反應(yīng)時(shí)程延長（中樞敏化機(jī)制）8，19 .近來的實(shí)驗(yàn)還證明下行痛易化系統(tǒng)的活性增強(qiáng)和脊髓內(nèi)部抑制神經(jīng)遞質(zhì)和受體活性的減弱也可能參與痛敏持續(xù)慢性化的過程19 . 致 謝 本實(shí)驗(yàn)在第四軍醫(yī)大學(xué)基礎(chǔ)部解剖學(xué)教研室暨梁钅求琚腦研究中心完成，得到該室和疼痛研究組全體同事的大力協(xié)助和支持. 參考文獻(xiàn): 1Gagliese L，Katz J，Melzack R.Pain in the elderly A

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