蛋白檢測ELISA

1、編輯ppt蛋白質(zhì)檢測蛋白質(zhì)檢測-ELISA-ELISA原理原理類型類型試劑試劑準備準備對照對照標本標本結(jié)果結(jié)果1.ELISA的原理的原理2.ELISA的類型的類型3.試劑準備試劑準備：免疫吸附劑免疫吸附劑 結(jié)合物結(jié)合物 酶底物的準備酶底物的準備 4.對照設定對照設定5.標本的采取和保存標本的采取和保存6.結(jié)果判斷結(jié)果判斷 原理原理類型類型試劑試劑準備準備對照對照標本標本結(jié)果結(jié)果 酶聯(lián)免疫吸附酶聯(lián)免疫吸附ELISAELISA（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA IAIA）?；A(chǔ)?；A(chǔ): :抗原或抗體的固相化及抗原或抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的酶標記

2、，加入酶反應的底物后，底物被酶催化成為抗體的酶標記，加入酶反應的底物后，底物被酶催化成為有色產(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，由有色產(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，由此進行定性或定量分析。此進行定性或定量分析。1.ELISA的原理的原理原理原理類型類型試劑試劑準備準備對照對照標本標本結(jié)果結(jié)果酶聯(lián)免疫吸附劑測定基本原理是：酶聯(lián)免疫吸附劑測定基本原理是：使抗原或抗體結(jié)合到某種固使抗原或抗體結(jié)合到某種固相載體表面，并保持其免疫活性。相載體表面，并保持其免疫活性。使抗原或抗體與某種酶連接使抗原或抗體與某種酶連接成酶標抗原或抗體，這種酶標抗原或抗體既保留其免疫活性，又成酶標抗原或抗

3、體，這種酶標抗原或抗體既保留其免疫活性，又保留酶的活性。在測定時，把受檢標本（測定其中的抗體或抗原）保留酶的活性。在測定時，把受檢標本（測定其中的抗體或抗原）和酶標抗原或抗體按不同的步驟與固相載體表面的抗原或抗體起和酶標抗原或抗體按不同的步驟與固相載體表面的抗原或抗體起反應。用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復合物與其他反應。用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復合物與其他物質(zhì)分開，最后結(jié)合在固相載體上的酶量與標本中受檢物質(zhì)的量物質(zhì)分開，最后結(jié)合在固相載體上的酶量與標本中受檢物質(zhì)的量成一定的比例。加入酶反應的底物后，底物被酶催化變?yōu)橛猩a(chǎn)成一定的比例。加入酶反應的底物后，底物被酶催化變?yōu)?/p>

4、有色產(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，故可根據(jù)顏色反物，產(chǎn)物的量與標本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，故可根據(jù)顏色反應的深淺刊物定性或定量分析。應的深淺刊物定性或定量分析。 原理原理類型類型試劑試劑準備準備對照對照標本標本結(jié)果結(jié)果1.11.1抗原抗體反應抗原抗體反應 1.1.11.1.1可逆性可逆性 抗原與抗體結(jié)合形成抗原抗體復合物的過程是一種動態(tài)抗原與抗體結(jié)合形成抗原抗體復合物的過程是一種動態(tài)平衡，其反應式為：平衡，其反應式為：Ag+AbAgAbAg+AbAgAb 抗體的親和力（抗體的親和力（affinityaffinity），可以用平衡常數(shù)），可以用平衡常數(shù)K K表示：表示：K=AgAb

5、K=AgAbAgAb ,AgAbAgAb ,AgAb的解離程度與的解離程度與K K值有關(guān)。值有關(guān)。高高親和力抗體的抗原結(jié)合點與抗原的決定簇在空間構(gòu)型上非親和力抗體的抗原結(jié)合點與抗原的決定簇在空間構(gòu)型上非常適合，兩者結(jié)合牢固，不易解離。常適合，兩者結(jié)合牢固，不易解離。解離后的抗原或抗體解離后的抗原或抗體均能保持原有的結(jié)構(gòu)和活性。均能保持原有的結(jié)構(gòu)和活性。原理原理類型類型試劑試劑準備準備對照對照標本標本結(jié)果結(jié)果1.1.21.1.2特異性特異性 抗原抗體的結(jié)合發(fā)生在抗原的決定簇與抗體的結(jié)合位點抗原抗體的結(jié)合發(fā)生在抗原的決定簇與抗體的結(jié)合位點之間?；瘜W結(jié)構(gòu)和空間構(gòu)型互補關(guān)系，具有高度的特異性。之間?；?/p>

6、學結(jié)構(gòu)和空間構(gòu)型互補關(guān)系，具有高度的特異性。 測定某一特定的物質(zhì)，而不需先分離待檢物。測定某一特定的物質(zhì)，而不需先分離待檢物。原理原理類型類型試劑試劑準備準備對照對照標本標本結(jié)果結(jié)果1.1.31.1.3最適比例最適比例 原理原理類型類型試劑試劑準備準備對照對照標本標本結(jié)果結(jié)果1.1.41.1.4敏感性敏感性化學比色法的敏感度為化學比色法的敏感度為mg/mlmg/ml水平水平酶反應測定法的敏感度約為酶反應測定法的敏感度約為5-10g/ml5-10g/ml免疫測定中凝膠擴散法和濁度法的敏感度與酶反應法相仿免疫測定中凝膠擴散法和濁度法的敏感度與酶反應法相仿標記的免疫敏感度可提高數(shù)千倍，達標記的免疫敏

7、感度可提高數(shù)千倍，達ng/mlng/ml水平水平例如，例如，HBsAgHBsAg，其敏感度可達，其敏感度可達0.1ng/ml0.1ng/ml。原理原理類型類型試劑試劑準備準備對照對照標本標本結(jié)果結(jié)果1.41.4免疫測定在病蟲害檢測中的應用免疫測定在病蟲害檢測中的應用由于各種抗原成份（如病毒的外殼蛋白、細菌的細胞壁蛋由于各種抗原成份（如病毒的外殼蛋白、細菌的細胞壁蛋白組分和鞭毛等），包括小分子的半抗原（包括植物激素白組分和鞭毛等），包括小分子的半抗原（包括植物激素、化學農(nóng)藥等），均可用以制備特異性的抗血清或單克隆、化學農(nóng)藥等），均可用以制備特異性的抗血清或單克隆抗體，利用此抗體作為試劑就可檢測標

8、本中相應的抗原，抗體，利用此抗體作為試劑就可檢測標本中相應的抗原，因此免疫測定的應用范圍極廣。因此免疫測定的應用范圍極廣。原理原理類型類型試劑試劑準備準備對照對照標本標本結(jié)果結(jié)果2 2ELISAELISA的類型的類型 ELISA ELISA可用于測定抗原，也可用于測定抗體。在這種測定可用于測定抗原，也可用于測定抗體。在這種測定方法中有三個必要的試劑：方法中有三個必要的試劑：（1 1）固相的抗原或抗體，即）固相的抗原或抗體，即 免疫吸附劑免疫吸附劑 （immunosorbentimmunosorbent）；（2 2）酶標記的抗原或抗體，稱為）酶標記的抗原或抗體，稱為 結(jié)合物結(jié)合物 （conjug

9、ateconjugate）；（3 3）酶反應的底物。）酶反應的底物。 可設計出各種不同類型的檢測方法。可設計出各種不同類型的檢測方法。 原理原理類型類型試劑試劑準備準備對照對照標本標本結(jié)果結(jié)果2.2.12.2.1雙抗體夾心法測抗原雙抗體夾心法測抗原此法適用于檢驗各種蛋白質(zhì)等大分子抗原，只要獲得針對此法適用于檢驗各種蛋白質(zhì)等大分子抗原，只要獲得針對受檢抗原的特異性抗體，就可用于受檢抗原的特異性抗體，就可用于包被固相載體包被固相載體和制備和制備酶酶結(jié)合物結(jié)合物而建立此法。而建立此法。原理原理類型類型試劑試劑準備準備對照對照標本標本結(jié)果結(jié)果操作步驟如下： （1）將特異性抗體與固相載體連接，形成固相抗

10、體：洗滌除去未）將特異性抗體與固相載體連接，形成固相抗體：洗滌除去未結(jié)合的抗體及雜質(zhì)。結(jié)合的抗體及雜質(zhì)。 （2）加受檢標本：使之與固相抗體接觸反應一段時間，讓標本中）加受檢標本：使之與固相抗體接觸反應一段時間，讓標本中的抗原與固相載體上的抗體結(jié)合，形成固相抗原復合物。洗滌除去其他的抗原與固相載體上的抗體結(jié)合，形成固相抗原復合物。洗滌除去其他未結(jié)合的物質(zhì)。未結(jié)合的物質(zhì)。 （3）加酶標抗體：使固相免疫復合物上的抗原與酶標抗體結(jié)合。）加酶標抗體：使固相免疫復合物上的抗原與酶標抗體結(jié)合。徹底洗滌未結(jié)合的酶標抗體。此時固相載體上帶有的酶量與標本中受檢徹底洗滌未結(jié)合的酶標抗體。此時固相載體上帶有的酶量與標

11、本中受檢物質(zhì)的量正相關(guān)。物質(zhì)的量正相關(guān)。 （4）加底物：夾心式復合物中的酶催化底物成為有色產(chǎn)物。根據(jù)）加底物：夾心式復合物中的酶催化底物成為有色產(chǎn)物。根據(jù)顏色反應的程度進行該抗原的定性或定量。顏色反應的程度進行該抗原的定性或定量。 根據(jù)同樣原理，將大分子抗原分別制備固相抗原和酶標抗原結(jié)合物，根據(jù)同樣原理，將大分子抗原分別制備固相抗原和酶標抗原結(jié)合物，即可用雙抗原夾心法測定標本中的抗體。即可用雙抗原夾心法測定標本中的抗體。 原理原理類型類型試劑試劑準備準備對照對照標本標本結(jié)果結(jié)果2.2.2 2.2.2 間接法測抗體間接法測抗體 傳染病的診斷。間接法的優(yōu)點是只要變換包被抗原就可利用傳染病的診斷。間

12、接法的優(yōu)點是只要變換包被抗原就可利用同一酶標抗抗體同一酶標抗抗體建立檢測相應抗體的方法。建立檢測相應抗體的方法。原理原理類型類型試劑試劑準備準備對照對照標本標本結(jié)果結(jié)果操作步驟操作步驟 1）將特異性抗原與固相載體連接，形成固相抗原：洗滌）將特異性抗原與固相載體連接，形成固相抗原：洗滌除去未結(jié)合的抗原及雜質(zhì)。除去未結(jié)合的抗原及雜質(zhì)。 2）加稀釋的受檢血清：其中的特異抗體與抗原結(jié)合，形）加稀釋的受檢血清：其中的特異抗體與抗原結(jié)合，形成固相抗原抗體復合物。成固相抗原抗體復合物。3）加酶標抗抗體：與固相復合物中的抗體結(jié)合，從而使）加酶標抗抗體：與固相復合物中的抗體結(jié)合，從而使該抗體間接地標記上酶。洗滌

13、后，固相載體上的酶量就該抗體間接地標記上酶。洗滌后，固相載體上的酶量就代表特異性抗體的量。代表特異性抗體的量。4）加底物顯色：顏色深度代表標本中受檢抗體的量。）加底物顯色：顏色深度代表標本中受檢抗體的量。 原理原理類型類型試劑試劑準備準備對照對照標本標本結(jié)果結(jié)果2.2.3 2.2.3 競爭法測抗體或抗原競爭法測抗體或抗原當抗原材料中的干擾物質(zhì)不易除去，或不易得到足夠的純化當抗原材料中的干擾物質(zhì)不易除去，或不易得到足夠的純化抗原時，可用此法檢測特異性抗體?？乖瓡r，可用此法檢測特異性抗體。 原理原理類型類型試劑試劑準備準備對照對照標本標本結(jié)果結(jié)果2.2.3 2.2.3 競爭法測抗原競爭法測抗原 小

14、分子抗原或半抗原缺乏可作夾心法的兩個以上的小分子抗原或半抗原缺乏可作夾心法的兩個以上的位點位點，因此不能用雙抗體夾心法進行測定，可以采用競爭法模，因此不能用雙抗體夾心法進行測定，可以采用競爭法模式。其原理是標本中的抗原和一定量的酶標抗原競爭與固式。其原理是標本中的抗原和一定量的酶標抗原競爭與固相抗體結(jié)合。標本中抗原量含量愈多，結(jié)合在固相上的酶相抗體結(jié)合。標本中抗原量含量愈多，結(jié)合在固相上的酶標抗原愈少，最后的顯色也愈淺。小分子激素、藥物等標抗原愈少，最后的顯色也愈淺。小分子激素、藥物等ELISAELISA測定多用此法。測定多用此法。原理原理類型類型試劑試劑準備準備對照對照標本標本結(jié)果結(jié)果3.

15、ELISA3. ELISA的試劑的試劑(A(A、B B、C C三部分三部分) )ELISAELISA中有三個必要的試劑：免疫吸附劑、結(jié)合物和酶的中有三個必要的試劑：免疫吸附劑、結(jié)合物和酶的底物。底物。（1 1）已包被抗原或抗體的固相載體（免疫吸附劑）；）已包被抗原或抗體的固相載體（免疫吸附劑）；（2 2）酶標記的抗原或抗體（結(jié)合物）；）酶標記的抗原或抗體（結(jié)合物）；（3 3）酶的底物；）酶的底物；（4 4）陰性對照品和陽性對照品，參考標準品；）陰性對照品和陽性對照品，參考標準品；（5 5）結(jié)合物及標本的稀釋液；）結(jié)合物及標本的稀釋液；（6 6）洗滌液；）洗滌液；（7 7）酶反應終止液）酶反應終

16、止液原理原理類型類型試劑試劑準備準備對照對照標本標本結(jié)果結(jié)果ELISAELISA的試劑準備的試劑準備A A 固相載體固相載體 聚苯乙烯具有較強的吸附蛋白質(zhì)的性能，抗體或蛋聚苯乙烯具有較強的吸附蛋白質(zhì)的性能，抗體或蛋白質(zhì)抗原吸附其上后仍保留原來的免疫學活性。白質(zhì)抗原吸附其上后仍保留原來的免疫學活性。 聚氯乙烯。聚氯乙烯對蛋白質(zhì)的吸附性能比聚苯乙烯高，聚氯乙烯。聚氯乙烯對蛋白質(zhì)的吸附性能比聚苯乙烯高，但空白值也略高。但空白值也略高。 良好的良好的ELISAELISA板應該是板應該是吸附性能好吸附性能好，空白值低空白值低，孔底透明孔底透明度高度高，各板之間、同一板各孔之間、同一板各孔之間，各板之間、

17、同一板各孔之間、同一板各孔之間性能相性能相近近。原理原理類型類型試劑試劑準備準備對照對照標本標本結(jié)果結(jié)果3.1.2 3.1.2 包被的方式包被的方式 將抗原或抗體固定在過程稱為包被將抗原或抗體固定在過程稱為包被(coating)(coating)。 蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)與聚苯乙烯固相載體是通過物理吸附結(jié)合的，靠與聚苯乙烯固相載體是通過物理吸附結(jié)合的，靠的是蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)上的疏水基團與固相載體表面的疏水基的是蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)上的疏水基團與固相載體表面的疏水基團間的作用。這種物理吸附是非特異性的，受蛋白質(zhì)的分子團間的作用。這種物理吸附是非特異性的，受蛋白質(zhì)的分子量、等電點、濃度等的影響。大分子蛋白質(zhì)較小分子

18、蛋白質(zhì)量、等電點、濃度等的影響。大分子蛋白質(zhì)較小分子蛋白質(zhì)通常含有更多的通常含有更多的疏水基團疏水基團，故更易吸附到固相載體表面。，故更易吸附到固相載體表面。原理原理類型類型試劑試劑準備準備對照對照標本標本結(jié)果結(jié)果不易吸附不易吸附的非蛋白質(zhì)抗原可用間接包被的抗原經(jīng)固相抗體的親的非蛋白質(zhì)抗原可用間接包被的抗原經(jīng)固相抗體的親和層析作用，包被在固相上的抗原純度大大提高，因此含雜質(zhì)和層析作用，包被在固相上的抗原純度大大提高，因此含雜質(zhì)較多的抗原也可采用捕獲包被法。較多的抗原也可采用捕獲包被法。親和素生物素親和素生物素 即用親和素先包被載體，加入生物素化的即用親和素先包被載體，加入生物素化的DNADNA

19、，這種包被方法均勻、牢固，已擴大應用于各種抗原物質(zhì)的定，這種包被方法均勻、牢固，已擴大應用于各種抗原物質(zhì)的定量測定。量測定。脂類物質(zhì)脂類物質(zhì)無法與固相載體結(jié)合，可將其在有機溶劑（例如乙醇無法與固相載體結(jié)合，可將其在有機溶劑（例如乙醇）中溶解后加入）中溶解后加入ELISAELISA板孔中，開蓋置冰箱過夜或冷風吹干，板孔中，開蓋置冰箱過夜或冷風吹干，待酒精揮發(fā)后，讓脂質(zhì)自然干固在固相表面。待酒精揮發(fā)后，讓脂質(zhì)自然干固在固相表面。 優(yōu)點：試驗的特異性、敏感性均由此得以改善，重復性亦優(yōu)點：試驗的特異性、敏感性均由此得以改善，重復性亦佳?？乖昧可伲瑑H為直接包被的佳?？乖昧可?，僅為直接包被的1/101

20、/10乃至于乃至于/100/100。原理原理類型類型試劑試劑準備準備對照對照標本標本結(jié)果結(jié)果包被用抗原：包被用抗原：天然抗原、重組抗原和合成多肽抗原三大類。天然抗原、重組抗原和合成多肽抗原三大類。合成多肽抗原合成多肽抗原是抗原決定簇的氨基酸序列人工合成的多肽片段。是抗原決定簇的氨基酸序列人工合成的多肽片段。一般只含有一個抗原決定簇，純度高，特異性也高，但由于分子一般只含有一個抗原決定簇，純度高，特異性也高，但由于分子量太小，往往難于直接吸附于固相上。借助于偶聯(lián)物與固相載體量太小，往往難于直接吸附于固相上。借助于偶聯(lián)物與固相載體的吸附，間接地結(jié)合到固相載體表面。的吸附，間接地結(jié)合到固相載體表面。

21、原理原理類型類型試劑試劑準備準備對照對照標本標本結(jié)果結(jié)果3.1.4 3.1.4 包被用抗體包被用抗體IgGIgG對聚苯乙烯有強吸附力，其聯(lián)結(jié)發(fā)生在對聚苯乙烯有強吸附力，其聯(lián)結(jié)發(fā)生在FcFc段上，抗體結(jié)合段上，抗體結(jié)合點暴露于外。點暴露于外。取材于抗血清或含單克隆抗體的培養(yǎng)液取材于抗血清或含單克隆抗體的培養(yǎng)液. .須除去雜抗體后才能須除去雜抗體后才能用于用于ELISAELISA，以保證試驗的特異性。，以保證試驗的特異性。原理原理類型類型試劑試劑準備準備對照對照標本標本結(jié)果結(jié)果3.1.5 3.1.5 包被的條件包被的條件pH9.6pH9.6碳酸鹽緩沖液碳酸鹽緩沖液pH7.2pH7.2的磷酸鹽緩沖液

22、的磷酸鹽緩沖液pH7-8pH7-8的的Tris-HCLTris-HCL緩沖液。緩沖液。 加入包被液后，在加入包被液后，在4-84-8冰箱中放置過夜，冰箱中放置過夜，3737中保溫中保溫2 2小時。包被濃度隨載體和包被物的性質(zhì)可有很大的變化，每小時。包被濃度隨載體和包被物的性質(zhì)可有很大的變化，每批材料需通過實驗與酶結(jié)合物的濃度協(xié)調(diào)選定。一般蛋白質(zhì)批材料需通過實驗與酶結(jié)合物的濃度協(xié)調(diào)選定。一般蛋白質(zhì)的包被濃度為的包被濃度為10ng/ml-20ug/ml10ng/ml-20ug/ml。原理原理類型類型試劑試劑準備準備對照對照標本標本結(jié)果結(jié)果3.1.6 3.1.6 封閉封閉封閉封閉(blocking)

23、(blocking)是繼包被之后用高濃度的無關(guān)蛋白質(zhì)溶液是繼包被之后用高濃度的無關(guān)蛋白質(zhì)溶液再包被的過程。封閉就是讓大量不相關(guān)的蛋白質(zhì)充填這些再包被的過程。封閉就是讓大量不相關(guān)的蛋白質(zhì)充填這些空隙，從而排斥空隙，從而排斥ELISAELISA后的步驟中干擾物質(zhì)的再吸附。后的步驟中干擾物質(zhì)的再吸附。常用封閉劑：常用封閉劑：0.05%-0.5%0.05%-0.5%的的BSA; 10%BSA; 10%的小牛血清或的小牛血清或1%1%明膠明膠; ;脫脂奶粉脫脂奶粉, ,比較價廉，可以高濃度使用（比較價廉，可以高濃度使用（5%5%）。）。原理原理類型類型試劑試劑準備準備對照對照標本標本結(jié)果結(jié)果3.4 3.

24、4 洗滌液洗滌液在板式在板式ELISAELISA中，常用的稀釋液為含中，常用的稀釋液為含0.05%0.05%吐溫吐溫2020磷磷酸鹽緩沖液。酸鹽緩沖液。原理原理類型類型試劑試劑準備準備對照對照標本標本結(jié)果結(jié)果ELISA的試劑準備的試劑準備B 3.2 3.2 結(jié)合物結(jié)合物 即酶標記的抗體（或抗原）是即酶標記的抗體（或抗原）是ELISAELISA中關(guān)鍵的試劑中關(guān)鍵的試劑 1 1 酶的催化活性酶的催化活性 2 2抗體（或抗原）的免疫活性抗體（或抗原）的免疫活性 3 3不含或少含有游離的抗體（或抗原）不含或少含有游離的抗體（或抗原） 4 4結(jié)合物尚要有良好的穩(wěn)定性。結(jié)合物尚要有良好的穩(wěn)定性。原理原理類

25、型類型試劑試劑準備準備對照對照標本標本結(jié)果結(jié)果3.2.1 3.2.1 結(jié)合物用的抗原和抗體結(jié)合物用的抗原和抗體 制備結(jié)合物時所用純度較高的制備結(jié)合物時所用純度較高的IgGIgG，以免在與酶聯(lián)結(jié)時其，以免在與酶聯(lián)結(jié)時其他雜蛋白的干擾。最好用層析純化的抗體，這樣全部酶結(jié)他雜蛋白的干擾。最好用層析純化的抗體，這樣全部酶結(jié)合物均具有特異的免疫活性，可以在高稀釋度進行反應，合物均具有特異的免疫活性，可以在高稀釋度進行反應，實驗結(jié)果本底淺淡。在實驗結(jié)果本底淺淡。在ELISAELISA中用酶標抗原的模式不多，總中用酶標抗原的模式不多，總的要求是抗原必須是高純度的。的要求是抗原必須是高純度的。原理原理類型類型

26、試劑試劑準備準備對照對照標本標本結(jié)果結(jié)果3.2.23.2.2酶酶純度高，催化反應的轉(zhuǎn)化率高，專一性強，性質(zhì)穩(wěn)定，來源純度高，催化反應的轉(zhuǎn)化率高，專一性強，性質(zhì)穩(wěn)定，來源豐富，價格不貴，受檢標本中不存在相同的酶。豐富，價格不貴，受檢標本中不存在相同的酶。酶結(jié)合物保留活性部分和催化能力，底物易于制備和保存，酶結(jié)合物保留活性部分和催化能力，底物易于制備和保存，價格低廉，有色產(chǎn)物易于測定等。價格低廉，有色產(chǎn)物易于測定等。在在ELISAELISA中，中，HRPHRP（辣根過氧化物酶辣根過氧化物酶 ），），APAP（堿性磷酸酶堿性磷酸酶 ），葡萄糖氧化酶，葡萄糖氧化酶，-D-D-半乳糖苷酶和脲酶等。半乳糖

27、苷酶和脲酶等。原理原理類型類型試劑試劑準備準備對照對照標本標本結(jié)果結(jié)果3.2.3 3.2.3 結(jié)合物的制備結(jié)合物的制備酶標記抗體的制備方法主要有兩種，即戊二醛交聯(lián)法和過碘酸酶標記抗體的制備方法主要有兩種，即戊二醛交聯(lián)法和過碘酸鹽氧化法。鹽氧化法。（1）戊二醛交聯(lián)法：戊二醛是一種雙功能團試劑，可使酶與戊二醛交聯(lián)法：戊二醛是一種雙功能團試劑，可使酶與蛋白質(zhì)的氨基通過它而聯(lián)結(jié)。有效（結(jié)合率達蛋白質(zhì)的氨基通過它而聯(lián)結(jié)。有效（結(jié)合率達60%-70%60%-70%）和重）和重復性好。復性好。 交聯(lián)反應是隨機的，結(jié)合物的大小也不均一，酶與酶，交聯(lián)反應是隨機的，結(jié)合物的大小也不均一，酶與酶，抗體與抗體之間也有

28、可能交聯(lián)，影響效果?？贵w與抗體之間也有可能交聯(lián)，影響效果。（2 2）過碘酸氧化法：適用含糖量較高的酶。過碘酸鈉將）過碘酸氧化法：適用含糖量較高的酶。過碘酸鈉將HRPHRP分子表面的多糖氧化為醛基很活潑，可與蛋白質(zhì)上的氨基形分子表面的多糖氧化為醛基很活潑，可與蛋白質(zhì)上的氨基形成成chiffchiff氏堿而結(jié)合。簡便有效氏堿而結(jié)合。簡便有效. .原理原理類型類型試劑試劑準備準備對照對照標本標本結(jié)果結(jié)果3.2.43.2.4結(jié)合物的保存結(jié)合物的保存 酶和抗體均為生物活性物質(zhì)，易失活。高濃度較為穩(wěn)酶和抗體均為生物活性物質(zhì)，易失活。高濃度較為穩(wěn)定，凍干后可在普通冰箱中保存一年左右。結(jié)合物溶液中定，凍干后可

29、在普通冰箱中保存一年左右。結(jié)合物溶液中加入等體積的甘油，加入蛋白保護劑。另外再加入抗生素加入等體積的甘油，加入蛋白保護劑。另外再加入抗生素（例如慶大霉素）和防腐劑（例如慶大霉素）和防腐劑（HRPHRP結(jié)合物加硫柳泵，結(jié)合物加硫柳泵，APAP結(jié)結(jié)合物可加疊氮鈉）。合物可加疊氮鈉）。原理原理類型類型試劑試劑準備準備對照對照標本標本結(jié)果結(jié)果試劑準備試劑準備 C 酶的底物酶的底物原理原理類型類型試劑試劑準備準備對照對照標本標本結(jié)果結(jié)果3.3 3.3 酶的底物酶的底物3.3.1 3.3.1 HRPHRP的底物的底物OPDOPD氧化后的產(chǎn)物呈橙紅色，用酸終止酶反應后，在氧化后的產(chǎn)物呈橙紅色，用酸終止酶反應

30、后，在492nm492nm處處有最高吸收峰，靈敏度高，比色方便，是有最高吸收峰，靈敏度高，比色方便，是HRPHRP結(jié)合物最常用的結(jié)合物最常用的底物。底物。 DH2+ H2O2 D+ 2H2O 上式中，上式中， DH2為供氧體，為供氧體， H2O2為受氫體。為受氫體。DH2一般為無色化合物，經(jīng)酶作用后成為有色的產(chǎn)物。一般為無色化合物，經(jīng)酶作用后成為有色的產(chǎn)物。DH2如：鄰苯二胺如：鄰苯二胺(OPD)(OPD)、四甲基聯(lián)苯胺四甲基聯(lián)苯胺(TMB)(TMB)和和ABTS ABTS 。E原理原理類型類型試劑試劑準備準備對照對照標本標本結(jié)果結(jié)果TMBTMB經(jīng)經(jīng)HRPHRP作用后共產(chǎn)物顯藍色。作用后共產(chǎn)物

31、顯藍色。TMBTMB性質(zhì)較穩(wěn)定，可配成溶液性質(zhì)較穩(wěn)定，可配成溶液試劑，只需與試劑，只需與H H2 2O O2 2溶液混和即成應用液。酶反應終止后，溶液混和即成應用液。酶反應終止后，TMBTMB產(chǎn)物由藍色呈黃色，可在比色計中定量，最適吸收波長為產(chǎn)物由藍色呈黃色，可在比色計中定量，最適吸收波長為450nm450nm。ABTSABTS雖不如雖不如OPDOPD和和TMBTMB敏感，但空白值極低，也為一些試劑盒敏感，但空白值極低，也為一些試劑盒所采用。所采用。原理原理類型類型試劑試劑準備準備對照對照標本標本結(jié)果結(jié)果APAP的底物為磷酸酯酶，一般采用對的底物為磷酸酯酶，一般采用對硝基苯磷酸酯硝基苯磷酸酯作

32、為作為底物。產(chǎn)物為黃色的對硝基酚，在底物。產(chǎn)物為黃色的對硝基酚，在405nm405nm波長處有吸波長處有吸收峰。用收峰。用NaOHNaOH終止酶反應后，黃色可穩(wěn)定一時間。終止酶反應后，黃色可穩(wěn)定一時間。APAP也有發(fā)熒光底物（磷酸也有發(fā)熒光底物（磷酸4-4-甲基傘酮），可用于甲基傘酮），可用于ELISAELISA作熒光測定，敏感度較高于用顯色底物的比色法。作熒光測定，敏感度較高于用顯色底物的比色法。原理原理類型類型試劑試劑準備準備對照對照標本標本結(jié)果結(jié)果3.5 3.5 酶反應終止液酶反應終止液常用的常用的HRPHRP反應終止液為硫酸，其濃度按反應終止液為硫酸，其濃度按加量及比色液的最終體積而異

33、，在板式加量及比色液的最終體積而異，在板式ELISAELISA中一般采用中一般采用2mol/L2mol/L。原理原理類型類型試劑試劑準備準備對照對照標本標本結(jié)果結(jié)果4 4 對照設定對照設定 陽性對照品陽性對照品(positive control)(positive control)和陰性對照品和陰性對照品(negative (negative control)control)是檢驗試驗有效性的控制品，同時也作為判斷結(jié)果是檢驗試驗有效性的控制品，同時也作為判斷結(jié)果的對照。的對照。陽性對照品的基本組成應盡量與檢測標本的組成相一致，多以含陽性對照品的基本組成應盡量與檢測標本的組成相一致，多以含蛋白保

34、護劑的緩沖液為基質(zhì)。蛋白保護劑的緩沖液為基質(zhì)。加入的量應與試劑的敏感度相稱；加入的量應與試劑的敏感度相稱；在測定中得到的吸光值與受檢標本吸光值比較，可以估計標本物在測定中得到的吸光值與受檢標本吸光值比較，可以估計標本物質(zhì)的量。質(zhì)的量。原理原理類型類型試劑試劑準備準備對照對照標本標本結(jié)果結(jié)果參考標準品參考標準品 定量測定應含有制作標準曲線用的參考標準品，應包括覆定量測定應含有制作標準曲線用的參考標準品，應包括覆蓋可檢測范圍的蓋可檢測范圍的4-54-5個濃度，一般均配入含蛋白保護劑及防個濃度，一般均配入含蛋白保護劑及防腐劑的緩沖液中腐劑的緩沖液中. .原理原理類型類型試劑試劑準備準備對照對照標本標

35、本結(jié)果結(jié)果顯色顯色顯色是酶催化無色的底物生成有色產(chǎn)物的溫育反應。反應的顯色是酶催化無色的底物生成有色產(chǎn)物的溫育反應。反應的溫度和時間仍是影響顯色的因素。在一定時間內(nèi)，陰性孔可溫度和時間仍是影響顯色的因素。在一定時間內(nèi)，陰性孔可保持無色，而陽性孔則隨時間的延長而呈色加強。適當提高保持無色，而陽性孔則隨時間的延長而呈色加強。適當提高溫度有助于加速顯色進行。溫度有助于加速顯色進行。TMBTMB受光照的影響不大，可在室溫中置于操作臺上，邊反應觀受光照的影響不大，可在室溫中置于操作臺上，邊反應觀察結(jié)果。但為保證實驗結(jié)果的穩(wěn)定性，宜在規(guī)定的適當時間察結(jié)果。但為保證實驗結(jié)果的穩(wěn)定性，宜在規(guī)定的適當時間閱讀結(jié)

36、果。閱讀結(jié)果。TMBTMB經(jīng)經(jīng)HRPHRP作用后，約作用后，約4040分鐘顯色達頂峰，隨即逐分鐘顯色達頂峰，隨即逐漸減弱，至漸減弱，至2 2小時后即可完全消退至無色。小時后即可完全消退至無色。原理原理類型類型試劑試劑準備準備對照對照標本標本結(jié)果結(jié)果比色比色拭干板底附著的液體，然后將板正確放入酶標比色儀中。拭干板底附著的液體，然后將板正確放入酶標比色儀中。 以蒸餾水校零點，測讀底物孔（未經(jīng)任何反應僅加底物液以蒸餾水校零點，測讀底物孔（未經(jīng)任何反應僅加底物液的孔）和空白孔（以生理鹽水或稀釋液代替標本作全過程的的孔）和空白孔（以生理鹽水或稀釋液代替標本作全過程的孔），以記錄本次試驗的試劑狀況。其后可

37、用空白孔以蒸餾孔），以記錄本次試驗的試劑狀況。其后可用空白孔以蒸餾水校零點，以上各孔的吸光度需減去空白孔的吸光度，然后水校零點，以上各孔的吸光度需減去空白孔的吸光度，然后進行計算。進行計算。結(jié)果以光密度（結(jié)果以光密度（oplical densityoplical density，ODOD），現(xiàn)按規(guī)定用吸光），現(xiàn)按規(guī)定用吸光度（度（absorbenceabsorbence，A A），兩者含義相同。通常的表示方法是），兩者含義相同。通常的表示方法是，將吸收波長寫于，將吸收波長寫于A A字母的右下角，如字母的右下角，如OPDOPD的吸收波長為的吸收波長為492nm492nm，表示方法為，表示方法為A

38、A492492nmnm或或ODOD492492nmnm。原理原理類型類型試劑試劑準備準備對照對照標本標本結(jié)果結(jié)果酶標比色儀酶標比色儀酶標比色儀簡稱酶標儀，通常指測讀酶標比色儀簡稱酶標儀，通常指測讀ELISAELISA光度計。針對固光度計。針對固相載體形式的不同，各有特制的適用于板、珠和小試管的設相載體形式的不同，各有特制的適用于板、珠和小試管的設計。酶標儀的主要性能指標有：測讀速度、讀數(shù)的準確性、計。酶標儀的主要性能指標有：測讀速度、讀數(shù)的準確性、重復性、精確度和可測范圍、線性等等。優(yōu)良的酶標儀的讀重復性、精確度和可測范圍、線性等等。優(yōu)良的酶標儀的讀數(shù)一般可精確到數(shù)一般可精確到0.0010.0

39、01，準確性為，準確性為1%1%，重復性達，重復性達0.5%0.5%。操作時室溫宜在操作時室溫宜在15-3015-30，使用前先預熱儀器，使用前先預熱儀器15-3015-30分鐘，測分鐘，測讀結(jié)果更穩(wěn)定。測讀讀結(jié)果更穩(wěn)定。測讀A A值時，要選用產(chǎn)物的敏感吸收峰，如值時，要選用產(chǎn)物的敏感吸收峰，如OPDOPD用用492nm492nm波長。有的酶標儀可用雙波長式測讀。波長。有的酶標儀可用雙波長式測讀。各種酶標儀性能有所不同，使用中應詳細閱讀說明書。各種酶標儀性能有所不同，使用中應詳細閱讀說明書。原理原理類型類型試劑試劑準備準備對照對照標本標本結(jié)果結(jié)果5 5 結(jié)果判斷結(jié)果判斷 5.1 5.1 定性測定定性測定定性測定的結(jié)果判斷作出定性測定的結(jié)果判斷作出“有有”或或“無無”的回答，分別用的回答，分別用“陽性陽性”、“陰性陰性”表示。在這種半定量測定中，將標本作一表示。在這種半定量測定中，將標本作一系列稀釋后進行試驗，呈陽性反應的最高稀釋度即為滴度。系列稀釋后進行試驗，呈陽性反應的最高稀釋度即為滴度。根據(jù)滴度的高低，可以判斷標本反應性的強弱，這比觀察不根據(jù)滴度的高低，可以判斷標本反應性的強弱，這比觀察不稀釋標本呈色的深淺判斷為強陽性、弱陽性更具定量意義。稀釋標本呈色的深淺判斷為強陽性、弱陽性更具定量意義。在間接法和夾心法在間接法和夾心法ELSIAELSIA中