實(shí)驗(yàn)診斷學(xué)：乙肝兩對(duì)半檢查實(shí)驗(yàn)

1、臨床免疫學(xué)檢查臨床免疫學(xué)檢查（乙肝兩對(duì)半檢測(cè)）乙肝兩對(duì)半檢測(cè)） 【實(shí)驗(yàn)內(nèi)容實(shí)驗(yàn)內(nèi)容】ELISA法檢測(cè)乙型肝炎病毒標(biāo)志物：法檢測(cè)乙型肝炎病毒標(biāo)志物：1. 乙型肝炎病毒表面抗原（乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）2. 乙型肝炎病毒表面抗體（抗乙型肝炎病毒表面抗體（抗HBs、HBsAb）3. 乙型肝炎病毒乙型肝炎病毒e抗原（抗原（HBeAg）4. 乙型肝炎病毒乙型肝炎病毒e抗體（抗抗體（抗HBe、HBeAb）5. 乙型肝炎病毒核心抗體（抗乙型肝炎病毒核心抗體（抗HBc、HBcAb） 【實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)原理原理】l酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISAELISA） 一種固相酶免疫測(cè)定技術(shù)：先將抗體或抗

2、原包被一種固相酶免疫測(cè)定技術(shù)：先將抗體或抗原包被到某種固相載體表面，與待測(cè)樣品中的抗原或抗體發(fā)到某種固相載體表面，與待測(cè)樣品中的抗原或抗體發(fā)生反應(yīng)，再加入酶標(biāo)抗體或抗原與免疫復(fù)合物結(jié)合，生反應(yīng)，再加入酶標(biāo)抗體或抗原與免疫復(fù)合物結(jié)合，最后加入酶反應(yīng)底物，根據(jù)底物被酶催化產(chǎn)生的顏色最后加入酶反應(yīng)底物，根據(jù)底物被酶催化產(chǎn)生的顏色及其吸光度（及其吸光度（A A）值的大小進(jìn)行定性或定量分析）值的大小進(jìn)行定性或定量分析。ELISAELISA檢測(cè)類(lèi)型檢測(cè)類(lèi)型l雙抗體夾心法雙抗體夾心法l雙位點(diǎn)一步法雙位點(diǎn)一步法 HBsAg HBeAgl間接法間接法 HBsAbl競(jìng)爭(zhēng)法競(jìng)爭(zhēng)法 HBeAb、HBcAbl捕獲法捕獲

3、法雙抗體夾心法雙抗體夾心法 檢測(cè)示意圖檢測(cè)示意圖 孵育30min后，充分洗板雙位點(diǎn)一步法雙位點(diǎn)一步法 檢測(cè)示意圖檢測(cè)示意圖 抗原過(guò)多，可能出現(xiàn)抗原過(guò)多，可能出現(xiàn)后帶現(xiàn)象，假陰性后帶現(xiàn)象，假陰性間接法間接法 檢測(cè)示意圖檢測(cè)示意圖競(jìng)爭(zhēng)法競(jìng)爭(zhēng)法 檢測(cè)示意圖檢測(cè)示意圖 如何讀取結(jié)果？如何讀取結(jié)果？乙型肝炎病毒診斷試劑盒組成乙型肝炎病毒診斷試劑盒組成 微孔反應(yīng)板微孔反應(yīng)板 4 4孔孔酶結(jié)合物酶結(jié)合物 1 1瓶瓶陽(yáng)性對(duì)照陽(yáng)性對(duì)照 1 1瓶瓶 陰性對(duì)照陰性對(duì)照 1 1瓶瓶 顯色劑顯色劑A 1A 1瓶瓶 顯色劑顯色劑B 1B 1瓶瓶洗滌液洗滌液 1 1大瓶大瓶操作步驟操作步驟1.1.加樣：加樣： 標(biāo)本標(biāo)本50

4、ul50ul 空白對(duì)照空白對(duì)照 陰性對(duì)照陰性對(duì)照1 1滴滴 四個(gè)酶標(biāo)孔內(nèi)四個(gè)酶標(biāo)孔內(nèi) 陽(yáng)性對(duì)照陽(yáng)性對(duì)照1 1滴滴注：注：HBcAb-HBcAb-待測(cè)標(biāo)本用生理鹽水作待測(cè)標(biāo)本用生理鹽水作1 13030稀釋稀釋 （50ul50ul標(biāo)本標(biāo)本+1.5ml+1.5ml生理鹽水）生理鹽水）2.2.加酶結(jié)合物加酶結(jié)合物：除空白對(duì)照孔外，每孔加入酶結(jié)合物：除空白對(duì)照孔外，每孔加入酶結(jié)合物1 1滴，滴，充分混勻，置充分混勻，置3737孵育孵育3030分鐘。分鐘。操作步驟操作步驟3.3.洗板洗板：棄去孔內(nèi)液體，洗滌液注滿各孔，靜置：棄去孔內(nèi)液體，洗滌液注滿各孔，靜置5 5秒，甩干，重復(fù)秒，甩干，重復(fù)5 5次后拍干

5、。次后拍干。4.4.顯色顯色：每孔加顯色劑：每孔加顯色劑A A液、液、B B液各液各1 1滴，充分混滴，充分混勻，置勻，置3737孵育孵育1010分鐘。分鐘。5.5.結(jié)果觀察結(jié)果觀察：有無(wú)顯色反應(yīng)。：有無(wú)顯色反應(yīng)。結(jié)果判讀結(jié)果判讀l顯色反應(yīng)呈顯色反應(yīng)呈藍(lán)色藍(lán)色l肉眼判讀：肉眼判讀： HBsAg HBsAb HBeAgHBsAg HBsAb HBeAg藍(lán)色為陽(yáng)性藍(lán)色為陽(yáng)性，無(wú)色為陰性。無(wú)色為陰性。lHBeAbHBeAb和和 HBcAbHBcAb測(cè)定時(shí)，由于采用競(jìng)爭(zhēng)法，所測(cè)定時(shí)，由于采用競(jìng)爭(zhēng)法，所以判斷結(jié)果時(shí)剛好相反，無(wú)色為陽(yáng)性，以判斷結(jié)果時(shí)剛好相反，無(wú)色為陽(yáng)性，藍(lán)色為藍(lán)色為陰性陰性。結(jié)果報(bào)告結(jié)果

6、報(bào)告lHBsAgHBsAg: 陰性（陰性（陽(yáng)性陽(yáng)性）lHBsAbHBsAb: 陰性（陰性（陽(yáng)性陽(yáng)性）lHBeAgHBeAg: 陰性（陰性（陽(yáng)性陽(yáng)性）lHBeAbHBeAb: 陰性（陰性（陽(yáng)性陽(yáng)性）lHBcAbHBcAb: 陰性（陰性（陽(yáng)性陽(yáng)性）注意事項(xiàng)注意事項(xiàng)lHBcAbHBcAb測(cè)定：待測(cè)標(biāo)本稀釋后的檢測(cè)結(jié)果為臨測(cè)定：待測(cè)標(biāo)本稀釋后的檢測(cè)結(jié)果為臨床意義；不作稀釋的檢測(cè)結(jié)果為流行病學(xué)意義。床意義；不作稀釋的檢測(cè)結(jié)果為流行病學(xué)意義。l競(jìng)爭(zhēng)法判斷結(jié)果時(shí)要注意。競(jìng)爭(zhēng)法判斷結(jié)果時(shí)要注意。l冷藏環(huán)境中取出的試劑盒及標(biāo)本使用前應(yīng)置室冷藏環(huán)境中取出的試劑盒及標(biāo)本使用前應(yīng)置室溫平衡溫平衡3030分鐘后才可測(cè)定

7、。分鐘后才可測(cè)定。l使用前試劑應(yīng)搖勻，并棄去使用前試劑應(yīng)搖勻，并棄去1 1滴后垂直滴加。滴后垂直滴加。l結(jié)果判斷需在反應(yīng)終止后結(jié)果判斷需在反應(yīng)終止后1010分鐘內(nèi)完成。分鐘內(nèi)完成。我國(guó)HBV感染概況l一般人群一般人群HBsAg攜帶率高達(dá)攜帶率高達(dá)7.18%；現(xiàn)有慢性；現(xiàn)有慢性HBV感染者約感染者約9 300萬(wàn)人萬(wàn)人，占全世界的，占全世界的1/4；l其中慢性乙型病毒性肝炎患者超過(guò)其中慢性乙型病毒性肝炎患者超過(guò) 2 000萬(wàn)例，占全世界慢性乙萬(wàn)例，占全世界慢性乙肝患者的肝患者的1/3；l15歲以下兒童歲以下兒童HBsAg攜帶率下降顯著，攜帶率下降顯著，1-4歲組僅為歲組僅為0.96%；1 4歲組歲

8、組HBsAb陽(yáng)性率由陽(yáng)性率由1992年年15.75%升至升至72.25%; 抗抗HBcAb陽(yáng)陽(yáng)性率由性率由1992年年30.08%降至降至3.76%15乙型肝炎病毒病毒標(biāo)志物檢測(cè)乙型肝炎病毒病毒標(biāo)志物檢測(cè)乙型肝炎乙型肝炎表面抗原（表面抗原（HBsAgHBsAg）乙肝病毒前乙肝病毒前S1S1抗原抗原抗乙肝病毒前抗乙肝病毒前S1S1抗體抗體乙肝病毒前乙肝病毒前S2S2抗原抗原抗乙肝病毒前抗乙肝病毒前S2S2抗體抗體 乙型肝炎核心抗原（乙型肝炎核心抗原（HBcAgHBcAg） 乙肝乙肝核心抗體（抗核心抗體（抗-HBc-HBc）乙型肝炎乙型肝炎表面抗體（抗表面抗體（抗-HBs-HBs）乙型肝炎乙型肝炎

9、e e抗原（抗原（HBeAgHBeAg）乙型肝炎乙型肝炎e e抗體（抗抗體（抗-HBe -HBe ）乙型肝炎病毒乙型肝炎病毒DNADNAl1 1）最常用的檢測(cè)項(xiàng)目）最常用的檢測(cè)項(xiàng)目 兩對(duì)半兩對(duì)半 測(cè)定方法：測(cè)定方法：ELISAELISA、放射免疫法（、放射免疫法（RIARIA）、）、發(fā)光免疫法發(fā)光免疫法( (定量定量) ) 2 2）乙肝）乙肝DNADNA定量定量PCRPCR檢測(cè)檢測(cè) 病毒復(fù)制、診斷依據(jù)、傳染性、療效監(jiān)測(cè)等病毒復(fù)制、診斷依據(jù)、傳染性、療效監(jiān)測(cè)等乙型肝炎病毒病毒標(biāo)志物檢測(cè)乙型肝炎病毒病毒標(biāo)志物檢測(cè) 乙肝兩對(duì)半乙肝兩對(duì)半lHBsAgHBsAg（表面抗原）：（表面抗原）： 存在于存在于

10、DaneDane顆粒的表面的糖蛋白。顆粒的表面的糖蛋白。判斷判斷HBVHBV感染的指感染的指標(biāo)之一標(biāo)之一 ，陽(yáng)性見(jiàn)于急性乙肝的潛伏期，發(fā)病時(shí)達(dá)高峰，如果發(fā)病后陽(yáng)性見(jiàn)于急性乙肝的潛伏期，發(fā)病時(shí)達(dá)高峰，如果發(fā)病后3 3個(gè)月不個(gè)月不轉(zhuǎn)陰，則易發(fā)展成慢性乙型肝炎。轉(zhuǎn)陰，則易發(fā)展成慢性乙型肝炎。l抗抗-HBs-HBs（表面抗體）：（表面抗體）：是一種是一種保護(hù)性抗體保護(hù)性抗體，可阻止，可阻止HBVHBV穿過(guò)細(xì)胞膜進(jìn)入新的穿過(guò)細(xì)胞膜進(jìn)入新的肝細(xì)胞，提示機(jī)體對(duì)乙肝病毒有一定程度的免疫力。是機(jī)體感染或接種乙肝肝細(xì)胞，提示機(jī)體對(duì)乙肝病毒有一定程度的免疫力。是機(jī)體感染或接種乙肝疫苗的標(biāo)志。疫苗的標(biāo)志。lHBeAg

11、HBeAg（e e抗原）：抗原）：其陽(yáng)性是乙型肝炎的重要標(biāo)志，提示病毒其陽(yáng)性是乙型肝炎的重要標(biāo)志，提示病毒活動(dòng)性活動(dòng)性較強(qiáng)，較強(qiáng)，傳傳染性較大染性較大。持續(xù)陽(yáng)性，表明肝細(xì)胞損害較重。持續(xù)陽(yáng)性，表明肝細(xì)胞損害較重。l抗抗-HBe-HBe（e e抗體）：抗體）：抗抗-HBe-HBe的出現(xiàn)意味著大部分的出現(xiàn)意味著大部分HBVHBV被消除，復(fù)制減少，傳染被消除，復(fù)制減少，傳染性降低，但并非無(wú)感染。性降低，但并非無(wú)感染。l抗抗-HBc-HBc（核心抗體）：（核心抗體）：反映肝細(xì)胞受到反映肝細(xì)胞受到HBVHBV侵害的一種指標(biāo)，陽(yáng)性表示正在侵害的一種指標(biāo)，陽(yáng)性表示正在感染或既往感染。感染或既往感染。 lHBcAg(核心抗原核心抗原)： 是乙肝病