青藤堿對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者成纖維樣滑膜細(xì)胞增殖及基質(zhì)金屬蛋白酶3表達(dá)的影響

1、青藤堿對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者成纖維樣滑膜細(xì)胞增殖及基質(zhì)金屬蛋白酶-3表達(dá)的影響 作者：張娟李娟趙毅余克強【摘要】 ：目的 觀察青藤堿對體外培養(yǎng)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者成纖維樣滑膜細(xì)胞增殖以及基質(zhì)金屬蛋白酶-3(MMP-3)mRNA含量的影響。方法 培養(yǎng)人成纖維樣滑膜細(xì)胞,分為青藤堿高、中、低劑量組和空白對照組,經(jīng)青藤堿干預(yù)后,用四甲基偶氮唑藍(lán)法測定細(xì)胞增殖情況,用半定量RT-PCR方法檢測成纖維細(xì)胞中MMP-3 mRNA的表達(dá)。結(jié)果 經(jīng)青藤堿干預(yù)后的人成纖維樣滑膜細(xì)胞的增殖率受到顯著抑制(P<0.05),其中高劑量組的改變差異尤為顯著(P<0.01)。MMP-3的mRNA表達(dá)水

2、平較之空白對照組有顯著下降(P<0.05),且高劑量組的差異尤為顯著(P<0.01)。結(jié)論 青藤堿可以抑制類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者成纖維樣滑膜細(xì)胞的增殖并下調(diào)MMP-3的表達(dá),推斷這可能是青藤堿治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的一種機理。 【關(guān)鍵詞】 類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎青藤堿成纖維樣滑膜細(xì)胞基質(zhì)金屬蛋白酶-3Abstract：Objective To observe the effect of sinomenine on the proliferation of fibroblast-like synoviocytes (FLS) and expression level of MMP-3 se

3、creted by FLS in rheumatoid arthritis in vitro. Methods FLS were obtained by digesting synovial tissues with collagens and were divided into four groups：sinomenine high, middle, low concentration and control group. The proliferation of FLS was assessed by methyl- thiazolyl-tetrazolium (MTT) assay an

4、d the mRNA expression of MMP-3 was measured by semi-quantitative RT-PCR respectively after treated by sinomenine. Results The rate of FLS proliferation was significantly reduced in groups treated by sinomenine. Compared with control group, the mRNA expression of MMP-3 markly decreased in sinomenine

5、groups (P<0.05) and especially in sinomenine high group (P<0.01). Conclusion Sinomenine can effectively inhibit the proliferation of FLS and reduce the mRNA expression of MMP-3 of FLS in rheumatoid arthritis, that may be a mechanism in therapy of rheumatoid arthritis by sinomenine.2 /

6、16key words：rheumatoid arthritis；sinomenine；fibroblast-like synoviocytes；MMP-3類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis, RA)是一種常見的以關(guān)節(jié)組織慢性炎癥為主要表現(xiàn)的自身免疫性疾病。病變關(guān)節(jié)主要表現(xiàn)為炎性細(xì)胞浸潤、滑膜增生、血管翳形成以及由此引發(fā)的軟骨、骨和關(guān)節(jié)囊的損傷,最終可以導(dǎo)致關(guān)節(jié)的畸形和功能喪失。成纖維樣滑膜細(xì)胞(fibroblast-like synoviocytes, FLS)是一種可以在RA的發(fā)病中引起關(guān)節(jié)損害的主要效應(yīng)細(xì)胞。FLS分泌的基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metallopr

7、oteinase, MMPs)是一族鋅離子依賴性的內(nèi)源性蛋白水解酶,可以直接降解軟骨和骨質(zhì)從而對關(guān)節(jié)造成破壞。由于許多外來信息都必須首先激活MMP-3后才能活化其它MMPs,所以,FLS分泌的MMP-3在關(guān)節(jié)破壞過程中所起的作用非常重要1。研究表明,青藤堿(sinomenine,SIN)治療RA具有較明確的療效,具有抗炎、免疫抑制、鎮(zhèn)痛等藥理作用,且毒副作用較小,臨床上得到了廣泛的應(yīng)用2。但是,SIN對于RA患者FLS分泌的MMP-3作用尚不清楚。本實驗就SIN對RA患者FLS的增殖以及其MMP-3的mRNA表達(dá)進(jìn)行研究。1 材料與方法1.1 標(biāo)本取材 RA滑膜均取材于南方醫(yī)院脊柱骨科因RA行

8、全膝關(guān)節(jié)置換術(shù)或關(guān)節(jié)鏡滑膜切除術(shù)患者的關(guān)節(jié)滑膜組織,所有患者均符合1987年美國風(fēng)濕病學(xué)會修訂的RA分類標(biāo)準(zhǔn)3,患者對取材均知情同意。1.2 主要材料和儀器 超凈工作臺、普通離心機、CO2培養(yǎng)箱、熒光倒置顯微鏡、酶聯(lián)儀(BIO-RAD Model 550)、PCR儀(Perkin Elmer公司)。SIN干粉(含量98%,性狀為白色粉末)由湖南正清公司提供；高糖DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶均購自GIBICO公司；胎牛血清(FBS)、膠原蛋白酶、EDTA、四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)均購自Sigma公司；Trizol試劑、引物(上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司)；RT-PCR試劑盒寶生物工程(大連)有限公司

9、。1.3 人成纖維樣滑膜細(xì)胞的分離培養(yǎng)手術(shù)中獲得的滑膜組織,在無菌條件下用D-Hanks液洗滌34次,剔除脂肪組織后獲得白色滑膜組織,修剪收集的滑膜組織的滑膜層,充分剪碎,加入膠原酶消化,用含10% FBS的DMEM,直接分散貼附于培養(yǎng)瓶底部,置CO2培養(yǎng)箱(5% CO2、37 )培養(yǎng)。34 d更換培養(yǎng)基,去除未貼壁的組織塊,以后23 d更換1次培養(yǎng)基。利用光學(xué)顯微鏡對人FLS進(jìn)行鑒定,待長滿培養(yǎng)瓶底后,用0.25% 胰酶-0.02% EDTA混合消化液消化,傳代分瓶培養(yǎng),以第25代FLS進(jìn)行實驗。1.4 人成纖維樣滑膜細(xì)胞的藥物干預(yù)及分組 將SIN溶于DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基中,按照參考文獻(xiàn)4方法

10、設(shè)立高、中、低劑量組,配制成濃度分別為0.3、0.1、0.05 mmol/L的SIN溶液。在傳代后培養(yǎng)的第3天分別按照高、中、低濃度加入SIN溶液,對照組加入等量DMEM培養(yǎng)液,于培養(yǎng)第8天收獲。采用光鏡觀察鑒定滑膜細(xì)胞。1.5 MTT法檢測細(xì)胞增殖 取處于對數(shù)生長期的FLS,用含有0.25%胰蛋白酶-0.02% EDTA的消化液反復(fù)吹打,制成細(xì)胞懸液,用錐蟲藍(lán)拒染法檢測細(xì)胞活力>95%。將細(xì)胞懸液1 000 r/min、離心5 min后棄上清,各組細(xì)胞用含有血清的DMEM培養(yǎng)基分別稀釋至5×106/L。細(xì)胞懸液接種于24孔板,每孔加入800 L,12 h后換液,用按照

11、0.3、0.1、0.05 mmol/L配制好的含有高、中、低不同濃度SIN的DMEM培養(yǎng)液對各組細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng),空白對照組加入等量的DMEM培養(yǎng)基,37 、5% CO2進(jìn)行培養(yǎng)。按照文獻(xiàn)5方法,在第8天用MTT比色法測定各組的A值均值,記錄并計算不同濃度組和空白對照組對FLS的抑制率抑制率(%)1試驗組A值/對照組A值均值×100%。1.6 細(xì)胞總RNA提取 采用Trizol一步法提取人滑膜細(xì)胞的總RNA,經(jīng)紫外分光光度計測量260 nm和280 nm吸光度,二者比值在1.71.9之間。1.7 逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) 取2 g總RNA,42 30 min,99 5 min；進(jìn)行30個周期

12、的PCR逆轉(zhuǎn)錄后,進(jìn)行PCR擴增,以-肌動蛋白(- actin)作為內(nèi)對照。采用DNAman軟件設(shè)計引物,引物序列及擴增產(chǎn)物長度見表1。表1 MMP-3與-actin引物序列（略）按照寶生物工程(大連)有限公司RT-PCR試劑盒(AMV)說明進(jìn)行PCR擴增。擴增參數(shù)設(shè)置如下：94 2 min預(yù)變性1個循環(huán),每個周期為94 變性30 s,55 退火30 s,72 延伸2 min。取PCR產(chǎn)物置于2% 瓊脂糖凝膠中電泳,溴化乙錠染色,電泳條帶經(jīng)Hema凝膠圖像分析系統(tǒng)作條帶密度掃描,結(jié)果以MMP-3與-actin密度比值作為MMP-3表達(dá)參數(shù),對MMP-3 PCR產(chǎn)物相對定量。1.8 統(tǒng)計學(xué)方法

13、采用SPSS10.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,結(jié)果以x±s表示,各組數(shù)據(jù)經(jīng)過正態(tài)檢驗和方差齊性檢驗后,進(jìn)行單因素方差分析,P<0.05為差異有顯著性意義。2 結(jié)果2.1 人成纖維樣滑膜細(xì)胞的培養(yǎng)鑒定 膠原酶消化法培養(yǎng)的人FLS在培養(yǎng)1周后在倒置顯微鏡下可見組織塊周圍呈放射狀生長,10 d見細(xì)胞開始脫離組織塊呈梭形生長且連成網(wǎng)狀,2周左右細(xì)胞成片生長,3周細(xì)胞長滿瓶底,且細(xì)胞排列整齊,呈現(xiàn)明顯的方向性；傳代后的細(xì)胞在12 h內(nèi)完全貼壁,初期呈網(wǎng)狀分布生長,以后隨細(xì)胞數(shù)量的增長逐漸紊亂無明顯的方向性,細(xì)胞形態(tài)以梭形為主,交織成網(wǎng),網(wǎng)間散布有較多多邊形細(xì)胞。在光鏡下可觀察到：細(xì)胞

14、呈卵圓形、梭形或柱形,有短突起, 核呈卵圓形位于細(xì)胞中央,有時可見多核巨噬細(xì)胞樣細(xì)胞,生長良好,純度高,細(xì)胞形態(tài)無改變。2.2 青藤堿對人成纖維樣滑膜細(xì)胞體外增殖的影響 實驗結(jié)果顯示,較之于空白對照組,不同濃度試驗組的細(xì)胞增殖均受到明顯抑制(P<0.05),其中高濃度劑量組的細(xì)胞增殖受到的抑制最為明顯(P<0.01)。見表2。表2 各組對FLS增殖抑制率的影響(略) 注：與空白對照組比較,*P<0.05,*P<0.01；與SIN低劑量組比較,P<0.05(下同)2.3 RT-PCR檢測的結(jié)果 MMP-3的mRNA經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄聚合

15、酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴增后的擴增產(chǎn)物大小與預(yù)期一致。Hema凝膠圖像分析系統(tǒng)作條帶密度掃描顯示,MMP-3與-actin產(chǎn)物的OD比值,SIN高劑量組與空白對照組之間存在顯著差異(P<0.01),低劑量組與空白對照組之間差異有顯著性(P<0.05),表明SIN對人滑膜細(xì)胞MMP-3的表達(dá)具有抑制作用。其檢測結(jié)果見圖1、表3。表3 RA患者FLS中MMP-3 mRNA的表達(dá)(略)3 討論 RA以持續(xù)存在的滑膜炎為特點,其慢性滑膜增生主要表現(xiàn)為滑膜襯里層細(xì)胞增生、炎性細(xì)胞浸潤以及滑膜下層血管生成,進(jìn)而導(dǎo)致關(guān)節(jié)組織包括肌腱、關(guān)節(jié)囊、軟骨和骨進(jìn)行性和不可逆性破壞以及功能障礙。FLS是

16、關(guān)節(jié)滑膜細(xì)胞中的一種主要細(xì)胞,可以根據(jù)環(huán)境的變化發(fā)生演變,存在異常的增殖與分泌。研究證實,在體外分離和培養(yǎng)的情況下,滑膜各層的FLS和血管翳細(xì)胞幾乎沒有區(qū)別3。FLS不但參與滑膜組織對關(guān)節(jié)軟骨及關(guān)節(jié)周圍骨組織的破壞,而且還分泌多種細(xì)胞因子,如腫瘤壞死因子、白細(xì)胞介素-1等,相互作用,構(gòu)成細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò),持續(xù)刺激滑膜細(xì)胞,使得關(guān)節(jié)軟骨過度增殖,刺激炎癥反應(yīng),間接導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨的破壞1。這些都提示FLS是一種可以引起關(guān)節(jié)損害的主要效應(yīng)細(xì)胞。RA的關(guān)節(jié)組織破壞主要是結(jié)締組織的細(xì)胞間質(zhì)降解以及溶解的結(jié)果。而結(jié)締組織細(xì)胞間質(zhì)以及軟骨的降解和溶解長期以來被認(rèn)為與細(xì)胞因子刺激下軟骨和滑膜細(xì)胞產(chǎn)生的MMPs有關(guān)6

17、。MMPs是一組在結(jié)構(gòu)上具有極大同源性、能降解細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的內(nèi)肽酶的總稱。MMPs對RA的關(guān)節(jié)破壞作用可以概括為兩個途徑,一是直接降解軟骨和骨質(zhì),二是在血管生成方面具有重要作用,這是RA的顯著特征7。在RA的早期,增生的滑膜組織在向關(guān)節(jié)軟骨面生長的同時侵蝕關(guān)節(jié)軟骨,形成血管翳,血管翳中含有大量的成纖維細(xì)胞,可以釋放膠原蛋白酶、MMP-3等8；同時,FLS在一些細(xì)胞因子的刺激下也可以分泌MMP-3,進(jìn)而激活膠原蛋白酶,通過滑液作用于無血管翳附著的軟骨進(jìn)而引起骨組織的破壞。這種分泌的MMP-3也是一種對基質(zhì)起廣泛作用的蛋白酶,被認(rèn)為是導(dǎo)致軟骨降解的最重要的蛋白酶,它對RA關(guān)節(jié)的破壞作用主要在于軟

18、骨和骨質(zhì)8。有研究證實,滑膜細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、軟骨細(xì)胞都可以分泌MMP-3,其活化可以導(dǎo)致軟骨連接蛋白、纖維連接素以及多種膠原酶等蛋白酶的降解,被認(rèn)為是降解關(guān)節(jié)軟骨最為關(guān)鍵的蛋白酶7。所以,MMP-3在RA中的研究近年來也得到了越來越多學(xué)者的重視。 研究發(fā)現(xiàn),RA患者血清中的MMP-3水平顯著高于正常對照組,而且其水平的升高與RA的活動性有關(guān)9。同時還發(fā)現(xiàn),RA患者關(guān)節(jié)滑液中MMP-3含量明顯增高而且其滑膜中的MMP-3蛋白和基因均處于過度表達(dá)狀態(tài)10。所以,抑制FLS增殖已成為治療RA的重要手段之一。在對RA患者關(guān)節(jié)滑膜液中的糖蛋白降解產(chǎn)物進(jìn)行進(jìn)一步的分析中發(fā)現(xiàn),其核心蛋白成分都是在對MMP

19、-3易感的位點處被裂解11。這些也都提示,MMP-3在RA關(guān)節(jié)的破壞中起著極為重要的作用。 我們研究發(fā)現(xiàn),RA患者滑膜組織是大量增生的,SIN可以顯著抑制FLS的增殖,同時,SIN還可以顯著抑制MMP-3的mRNA表達(dá),且實驗初步表明,高劑量組較之低、中劑量組的抑制效果更加明顯(P<0.01)。提示SIN可以通過抑制RA患者FLS的增殖以及降低其MMP-3的mRNA表達(dá)而抑制關(guān)節(jié)滑膜組織的降解,減輕RA患者關(guān)節(jié)的破壞作用?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】 1 Takayanagi H, Iizuka H, Juli T, et al. Involvement of receptor activato

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