重組人干擾素γ對球后成纖維細胞CD40mRNA表達的影響

1、重組人干擾素對球后成纖維細胞CD40 mRNA表達的影響【關鍵詞】 成纖維細胞；,甲狀腺相關眼病；,干擾素,重組；,抗原,CD40；,細胞,培養(yǎng)的摘要: 目的 探討在重組人干擾素（rhIFN）作用下，正常人和甲狀腺相關眼?。═AO）患者球后成纖維細胞（RF）CD40 mRNA的表達情況。方法 用RTPCR法，對不同濃度rhIFN及400 U/mL rhIFN作用不同時間誘導體外培養(yǎng)的正常人和TAO患者RF CD40 mRNA進行半定量分析。結果 經100，200，400，1000 U/mL rhIFN作用48 h后，正常人和TAO患者RF CD40的光密度比值與各自對照組比較，差別有統(tǒng)計學意義

2、（P0.01）；兩者同一濃度比較差別無統(tǒng)計學意義（P0.05）。經400 U/mL rhIFN作用12，24，48，72 h后，正常人和TAO患者RF CD40的光密度比值與各自對照組比較差別有統(tǒng)計學意義（P0.05），兩者同一時間比較差別無統(tǒng)計學意義（P0.05）。結論 正常人和TAO患者RF均表達CD40 mRNA。rhIFN可上調正常人和TAO患者RF CD40 mRNA的水平，呈濃度和時間依賴。關鍵詞: 成纖維細胞； 甲狀腺相關眼??； 干擾素，重組； 抗原，CD40； 細胞，培養(yǎng)的ABSTRACT: Objective To quantify the mRNA expression o

3、f CD40 induced by recombinant human interferon gamma(rhIFN2 / 18) in cultured human retroocular fibroblast(RF) from normal subjects and thyriod associated ophthalmophy(TAO) patients. Methods Half quantifying the mRNA expression of CD40 induced by different concentration and time rhIFN in cultured hu

4、man RF from normal subjects and TAO patients. Results The absorbency values of 100, 200, 400, 1000 U/mL rhIFN in RF from normal subjects and TAO patients were increased significantly than negative control and 50 U/mL rhIFN group(P<0.01). Both not difference in same concentration. The absorben

5、cy values of 12,24,48,72 h of 400 U/mL rhIFN in RF from normal subjects and TAO patients， showed significantly different compared with negative control group(P<0.01)，and no difference in same time. Conclusions The cultured human RF from normal subjects and patients with TAO all express CD40 m

6、RNA. The rhIFN could upregulate CD40 gene mRNA expression with dosedependence and timedependent in both human RF.KEY WORDS: fibroblasts; Graves' disease; 甲狀腺相關眼病(thyroid associated ophthalmopathy，TAO)在病理組織學特征性表現為眼眶組織內大量親水性糖胺聚糖(glycosaminoglycan，GAG)聚集和免疫活性細胞浸潤1。免疫活性細胞產生的炎癥介質能上調球后成纖維細胞（retroocula

7、r fibroblast，RF）的目的基因，進而改變其生物合成活性，引起TAO的發(fā)生、發(fā)展，但免疫活性細胞浸潤眼眶、免疫活性細胞和RF相互作用最終激活RF的分子機制尚不明確。RF與球后浸潤的免疫活性細胞能否通過CD40/CD40L共刺激通路而相互作用，取決于RF是否表達CD40及球后局部微環(huán)境對CD40表達的影響；同時組織學證實TAO患者球后組織存在細胞因子(interferon gamma，IFN) 2。筆者探討體外培養(yǎng)的正常人和TAO患者RF是否有CD40 mRNA的表達，同時了解重組人干擾素（rhIFN）對它們表達的影響及兩者的差異，探索TAO發(fā)病的可能機制。1 材料與方法1.1 試劑和

8、儀器 RPMI 1640，DHanks液，胰蛋白酶，EDTA，青霉素，鏈霉素（均由中南大學分析測試中心、湘雅醫(yī)學院中心實驗室提供）。rhIFN（美國Peprotech EC LTD）。MTT（美國Sigma公司）。胎牛血清（武漢麗欣生物公司）。DMSO（美國Sigma公司）。Trizol提取液（美國Invitrogen公司）。DNA100標準物，RTPCR試劑盒，PCR引物，DEPC（北京鼎國生物技術發(fā)展中心）。瓊脂糖（北京鼎國生物技術發(fā)展中心）。 二氧化碳培養(yǎng)箱（BNA321D型，美國Toabai Espec公司）。低速離心機（北京醫(yī)用離心機廠）。-70 冰箱（美國Forma公司）。PCR儀

9、（美國Perkin Elmer公司）。核酸純度分析儀和低溫離心機（美國Beckman公司）。電泳儀（北京六一儀器廠）。圖像分析儀（美國Stratagene Eagle eye）。1.2 方法1.2.1 人RF的原代培養(yǎng) 4例TAO患者，均為男性，年齡分別為44，46，52，54歲。按TAO眼部病變分級（NOSPECS）：5級2例，6級2例?；颊咝醒劭魷p壓術時，取球后結締組織（患者知情同意）。正常對照取自眼球萎縮半年內無任何眶內、眼內炎癥及TAO表現，行眼球摘除義眼座植入術患者3例，男性1例（50歲），女性2例（43和45歲）；與TAO患者年齡比較差別無統(tǒng)計學意義（P0.05）。在手術過程中取球

10、后結締組織（患者知情同意）。 無菌條件下用含有加抗生素培養(yǎng)基的帶蓋無菌瓶收集標本，在超凈工作臺內進行操作，取標本放入平皿，用無菌眼科剪剪下所需組織，去除上面的脂肪組織及凝血塊，用無菌生理鹽水反復沖洗，直至無血跡為止；將組織轉到另一無菌平皿，并用DHanks液沖洗3次，剪成1 mm×1 mm×1 mm組織小塊，將組織小塊均勻分布鋪于培養(yǎng)瓶的底壁上，加入20%小牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基（青霉素10 g/mL、鏈霉素100 g/mL），使液面剛能蓋住組織塊而又不致使組織塊浮起。放置于37 、體積分數為0.05的CO2培養(yǎng)箱中孵育，>48 h 加培養(yǎng)基，以后每

11、隔23 d換培養(yǎng)基1次。原代培養(yǎng)經透射電鏡證實為RF。1.2.2 分組 （1）濃度效應：分成6組，為不含rhIFN的10% RPMI 1640陰性對照組及含rhIFN 50，100，200，400，1000 U/mL的5組。孵育48 h。（2）時間效應：分成5組，為不含rhIFN的10% RPMI 1640的陰性對照組，含400 U/mL rhIFN的10% RPMI 1640組，分別孵育12，24，48，72 h。1.2.3 一步法半定量RTPCR1.2.3.1 總RNA的提取 取26代正常人或TAO患者RF按上述分組培養(yǎng)后，用胰酶消化離心，PBS洗滌后再次離心去上清，收集細胞。在含有細胞的

12、Eppendorf管中加入0.5 mL Trizol試劑，振蕩混勻，室溫放置5 min。加氯仿0.2 mL，振蕩混勻，室溫放置10 min。4 、12000 r/min 離心15 min，小心吸取上層水相，移入另一Eppendorf管中。加入等體積的異丙醇，振蕩混勻，室溫放置10 min。4 、12000 r/min離心10 min，棄上清。冰預冷的75%乙醇漂洗沉淀；4 、12000 r/min離心5 min，棄上清。室溫干燥10 min，用適量的DEPC處理水溶解沉淀，1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，并測定D（260 nm）、D（280 nm），計算RNA含量和純度。1.2.3.2 RTPCR

13、 CD40引物 Forward Primer：5'CTT CTT CCG ACC GTG ACA TGC3' Reverse Primer：5'ATG GTT CGT CTG CCT CTG CAG3'擴增后DNA片段長330 bp。GAPDH引物Forward Primer：5' ACC ACA GTC CAT GCC ATC AC3'Reverse Primer：5' TCC ACC ACC CTG TTG CTG TA3'擴增后DNA片段長452 bp。 RTPCR反應體系及反應條件：總反應體系為25 L。模板1.0 L，C

14、D40上游引物1.0 L，CD40下游引物1.0 L，GAPDH上游引物1.5 L，GAPDH下游引物1.5 L， dNTP 2.5 L， MgCl2 5.0 L，RNA buffer 2.5 L， RNase Inhibiter 0.5 L， AMVRTase 0.5 L，Taq DNA Polymerase 0.5 L，DEPC水7.5 L。反應條件：50 30 min94 2 min；變性94 30 s退火58 30 s延伸72 60 s，30個循環(huán)；最后延伸72 5 min。1.3 瓊脂糖凝膠電泳 取擴增產物6 L與6×上樣緩沖液1 L混合，加樣。在含有0.005 mL-1溴

15、化乙錠（EB）的1.5%瓊脂糖凝膠中電泳，電泳緩沖液為0.5×TBE溶液，時間2030 min，電壓為5 V/cm。與標準分子量比較，鑒定擴增產物。1.4 圖像分析 PCR產物采用圖像分析儀進行半定量分析，計算單位為積分光密度。所應用GAPDH的積分光密度作為內對照，得出CD40 mRNA表達的相對比值。本研究以CD40基因表達的相對比值進行統(tǒng)計學分析。1.5 統(tǒng)計學處理 計量資料用x±s表示，運用SPSS 11.0 for windows統(tǒng)計軟件包進行方差分析，在此基礎上進行單因素組方差分析，兩兩比較用LSD法檢驗。P0.05為差別有統(tǒng)計學意義。2 結果2.1 RNA的提

16、取 可見清晰的28S、18S、5S 3條帶。各組細胞總RNA的D（260 nm）/D（280 nm）比值在1.82.0，說明提取的總RNA質量好，無明顯降解，也無明顯的DNA污染，可用于RTPCR等進一步的研究見圖1。2.2 RTPCR半定量分析2.2.1 CD40濃度效應 不同濃度rhIFN作用48 h對正常人和TAO患者的RF CD40的光密度比值的影響見表1和圖2。表1 不同濃度重組人干擾素作用48 h CD40的光密度比值的比較（略）3 討論 CD40是相對分子質量為4550 kD的型跨膜蛋白，屬于TNFR超家族成員，是B淋巴細胞重要的促有絲分裂受體。CD40最先發(fā)現于B淋巴細胞表面，

17、但不僅表達于造血系統(tǒng)起源的細胞，而且存在于許多非造血系統(tǒng)起源的細胞如內皮細胞、上皮細胞以及成纖維細胞等多種細胞表面35。本試驗中采用GAPDH作為內對照。因內對照GAPDH與CD40的引物在同一反應體系中共同擴增，因此，無論影響PCR擴增產率的哪個因素改變，對兩種產物的影響是一致的，兩者擴增產量的比率在擴增反應中會保持一致。表2400 U/mL重組人干擾素作用不同時間CD40的光密度比值的比較（略） 本研究表明，正常人和TAO患者RF均表達CD40 mRNA，這與Sempowski等的結果一致6。因此，可以推測RF可能通過CD40 mRNA的表達，與眼眶炎癥后局部浸潤的活化T淋巴細胞可能通過C

18、D40與CD40L共刺激通路相互作用。一方面，可能引起更多的免疫細胞的激活；另一方面可能導致RF活化，從而產生TAO的病理組織學改變及典型臨床表現。同時發(fā)現，正常人和TAO患者RF表達CD40 mRNA無明顯差異。這可能說明無論正常人或TAO患者RF均可通過CD40接收和轉導信號。與肺、齒齦、滑膜、皮膚、脾等解剖部位RF類似，IFN可上調RF CD40 mRNA的水平5。本研究結果還顯示，rhIFN誘導RF CD40 mRNA的表達呈時間和劑量依賴性，但正常人和TAO患者RF在同一時間或同一濃度無明顯差異。而作為免疫作用的效應細胞和靶細胞的RF具有維持組織器官的結構，參與免疫反應，分泌細胞外基

19、質蛋白的功能。因此，推測CD40對于維持眼眶正常組織功能具有重要意義；而在眼眶炎癥微環(huán)境中，IFN可能上調RF表達CD40，從而可能與眼眶組織內活化的免疫細胞通過CD40與CD40L的相互作用而激活，通過分泌細胞因子及大量的親水性GAG，引起TAO的發(fā)生與發(fā)展。故CD40/CD40L有可能代表著一個重要的RF活化通路，有可能是TAO分子致病的基礎，抑制或阻斷IFN上調RF表達CD40 mRNA可能成為治療TAO提供新的思路。由于受球后結締組織、特別是TAO患者的球后結締組織取材的限制。由于本研究觀察的例數較少，IFN和CD40在TAO發(fā)病的具體機制有待于進一步的研究。參考文獻：1Heufeld

20、er A E. Pathogenesis of ophthalmopathy in autoimmune thyroid diseaseJ. Rev Endocr Metab Disord, 2000,1(12):8795.2Ajjan R A,Weetman A P. New understanding of the role of cytokines in the pathogenesis of Graves' ophthalmopathyJ. J Endocrinol Invest, 2004,27(3):237245.3Wagner A H,Guldenzoph B,Lienenluke B,et al. CD154/CD40mediated expression of CD154 in end