胰島素受體底物2在宮內(nèi)發(fā)育遲緩大鼠胰腺組織中的表達(dá)

1、胰島素受體底物2在宮內(nèi)發(fā)育遲緩大鼠胰腺組織中的表達(dá)【摘要】 目的 觀察宮內(nèi)發(fā)育遲緩對(duì)胰島細(xì)胞上胰島素信號(hào)分子胰島素受體底物2的影響，探討胎兒宮內(nèi)發(fā)育遲緩個(gè)體發(fā)生胰島素抵抗的分子機(jī)制。方法 通過(guò)低蛋白飲食法建立宮內(nèi)發(fā)育遲緩大鼠的動(dòng)物模型，應(yīng)用免疫組織化學(xué)法研究胰島素受體底物2在正常飲食組大鼠及低蛋白飲食組大鼠在生后0，3，8周胰腺組織中的表達(dá)。結(jié)果 低蛋白飲食致宮內(nèi)發(fā)育遲緩大鼠在生后0，3，8周胰腺組織中胰島素受體底物2蛋白的表達(dá)水平均顯著低于正常飲食組大鼠胰腺組織中胰島素受體底物2的表達(dá)水平。結(jié)論 宮內(nèi)發(fā)育遲緩對(duì)胰島細(xì)胞上胰島素信號(hào)分子胰島素受體底物2的影響導(dǎo)致胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路障礙，這可能是

2、胎兒宮內(nèi)發(fā)育遲緩鼠成年后發(fā)生胰島素抵抗的原因之一。 【關(guān)鍵詞】 胎兒生長(zhǎng)遲緩； 胎兒/胚胎學(xué)； 受體，胰島素； 大鼠； 動(dòng)物，實(shí)驗(yàn) 【Abstract】 Objective To observe the expression of insulin receptor substrate2 （IRS2）on intrauterine growth retardation（IUGR），and to investigate molecular mechanisms for insulin resistance in IUGR rats.Methods An IUGR animal model was

3、established by protein malnutrition during pregnancy.Study the expression of IRS2 / 132 by immunohistochemistry at newborn，at 3 weeks and 8 weeks respectively on control group fed with common diet and IUGR lowprotein diet group.Results The level of protein of IRS2 at newborn，3 weeks and 8 weeks of I

4、UGR was significantly lower than that of control group respectively.Conclusion IUGR can induce the obstacle of signal transduction and effecter molecule by impacting on IRS2，which might be one of the molecular mechanisms of IUGR with insulin resistance at adult. 【Key words】 Fetal growth retardation；

5、 Fetus/Embryology； Receptors，insulin； Rats； Animals，laboratory 胎兒宮內(nèi)發(fā)育遲緩（Intrauterine growth retardation,IUGR）是一種常見(jiàn)的妊娠并發(fā)癥。國(guó)內(nèi)IUGR發(fā)生率為6.3916.3%。其病因復(fù)雜，母親孕期并發(fā)高血壓、糖尿病或營(yíng)養(yǎng)不良以及孕期吸煙和酗酒都可以導(dǎo)致IUGR，IUGR不僅近期可發(fā)生多種并發(fā)癥，遠(yuǎn)期亦可發(fā)生深遠(yuǎn)影響。近10年來(lái)的流行病學(xué)調(diào)查證明，出生時(shí)體格大小與成年后的疾病如冠心病、高血壓、2型糖尿病有密切關(guān)系。2型糖尿病和高血壓常常同時(shí)發(fā)病，并與脂代謝異常，肥胖和胰島素抵抗密切相關(guān)，其被

6、稱為代謝綜合征，其共同發(fā)病基礎(chǔ)為胰島素抵抗，又稱為胰島素抵抗綜合征。本研究擬通過(guò)孕期蛋白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)不良法建立IUGR動(dòng)物模型，研究IUGR個(gè)體生后0，3，8周胰腺組織中胰島素受體底物2（Insulin receptor substrate2，IRS2）蛋白表達(dá)的變化，探討IUGR個(gè)體發(fā)生胰島素抵抗的分子機(jī)制，為代謝綜合征的早期防治提供理論依據(jù)。 1 材料與方法 1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康Wistar大鼠15只，體質(zhì)量230280 g，雄性3只，雌性12只，雌性均為處女鼠，大鼠由中國(guó)醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供（動(dòng)物合格證號(hào)SYXK（遼）20030019），大鼠雌雄比例按41合籠，次晨89時(shí)涂片，以鏡下見(jiàn)精

7、子作為受孕第1天。孕鼠按受孕順序隨機(jī)分成低蛋白組和正常對(duì)照組，正常對(duì)照組孕鼠飼以標(biāo)準(zhǔn)飼料（熱卡為15.83 kJ/g，蛋白質(zhì)含量為23%）；低蛋白組孕鼠自妊娠第1天起飼以低蛋白飼料（熱卡為15.58 kJ/g，蛋白質(zhì)含量為8%），飼料均由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所配制。所有孕鼠均自然分娩，稱量12 h內(nèi)新生仔鼠體質(zhì)量精確到0.01 g。IUGR診斷標(biāo)準(zhǔn)：新生鼠出生體質(zhì)量低于正常對(duì)照組出生平均體質(zhì)量的2個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差。 1.2 標(biāo)本取材 隨機(jī)挑選8只不同窩別的IUGR新生仔鼠、3周齡鼠及8周齡鼠和相同數(shù)量的對(duì)照組新生仔鼠、3周齡鼠及8周齡鼠，處死后提取胰腺組織，置4%多聚甲醛中固定,備作石蠟切片。

8、1.3 主要試劑 IRS2一抗為羊抗鼠IgG，二抗為抗羊IgG，購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司。 1.4 方法 采用免疫組織化學(xué)染色法，將切片貼附于多聚賴氨酸處理過(guò)的載玻片上，進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，染色步驟如下：二甲苯脫蠟，3%過(guò)氧化氫封閉內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，枸櫞酸鹽煮沸，正常山羊血清封閉，一抗（工作濃度150）濕盒中4 過(guò)夜，二抗37 孵育30 min，辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素37 孵育30 min，聯(lián)苯二胺顯色，蘇木精復(fù)染，脫水，透明，封固。以磷酸鹽緩沖液代替一抗作陰性對(duì)照。陽(yáng)性判斷為細(xì)胞漿和細(xì)胞膜染為棕黃色。 1.5 圖像分析 采用Metan Lorph/EvolutionMp5.0/Bx5

9、1 Vs/Jp VIC/Olympus顯微圖像分析系統(tǒng)，對(duì)生后0，3，8周3個(gè)時(shí)期組織化學(xué)結(jié)果分析，每個(gè)時(shí)期選取8張切片，測(cè)其陽(yáng)性反應(yīng)部位平均密度值。 1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 12.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，測(cè)定結(jié)果用±s表示，P0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 2 結(jié)果 2.1 一般特性比較 低蛋白組IUGR發(fā)生率為54%（27/50），明顯高于正常對(duì)照組的4.1%（2/48），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.001）。與正常對(duì)照組體質(zhì)量（4.935±0.320）g相比，低蛋白組出生體質(zhì)量（3.923±0.220）g明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.01）。 2.

10、2 不同時(shí)期胰腺組織中IRS2蛋白表達(dá)情況 0周低蛋白組胰腺組織中IRS2蛋白表達(dá)結(jié)果見(jiàn)圖1。其陽(yáng)性反應(yīng)部位的平均密度值（0.806±0.064）明顯低于正常對(duì)照組（0.875±0.035），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），見(jiàn)圖2。3周低蛋白組胰腺組織中IRS2蛋白表達(dá)結(jié)果見(jiàn)圖3。其陽(yáng)性反應(yīng)部位的平均密度值（0.754±0.092）明顯低于正常對(duì)照組（0.855±0.063），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），見(jiàn)圖4。8周低蛋白組胰腺組織中IRS2蛋白表達(dá)結(jié)果見(jiàn)圖5。其陽(yáng)性反應(yīng)部位的平均密度值（0.480±0.08

11、2）明顯低于正常對(duì)照組（0.570±0.089），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），見(jiàn)圖6。 3 討論 1993年Barker等最先提出了有關(guān)胎兒生長(zhǎng)遲緩遠(yuǎn)期有害的影響。Godfrey等1通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)育早期的關(guān)鍵階段宮內(nèi)不良環(huán)境的刺激可以引起人體結(jié)構(gòu)和功能的持續(xù)改變，這一改變是一個(gè)漫長(zhǎng)的程序化的過(guò)程，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和人群研究表明宮內(nèi)環(huán)境的異常將對(duì)脂肪組織和胰腺細(xì)胞功能產(chǎn)生長(zhǎng)期的影響。 胰島細(xì)胞主要通過(guò)分泌胰島素起調(diào)節(jié)血糖、血脂作用，胎兒期營(yíng)養(yǎng)不良可影響胎兒胰島細(xì)胞形態(tài)發(fā)育及功能成熟，胎兒宮內(nèi)后期及新生兒期，胰島細(xì)胞分裂加快，數(shù)量增多，這一增殖過(guò)程受營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的調(diào)節(jié)。因此，早

12、期營(yíng)養(yǎng)不良尤其是胰島細(xì)胞發(fā)育的關(guān)鍵期，營(yíng)養(yǎng)不良可能會(huì)造成胰島細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的永久性損害。 現(xiàn)在已經(jīng)明確，要實(shí)現(xiàn)胰島素的正常生物學(xué)效應(yīng)需要具備以下條件2：（1）細(xì)胞分泌正常結(jié)構(gòu)和數(shù)量的胰島素，胰島素釋放的脈沖頻率及振幅正常；（2）所分泌的胰島素轉(zhuǎn)運(yùn)至胰島素靶細(xì)胞；（3）胰島素與靶細(xì)胞膜上的特異受體相結(jié)合；（4）胰島素與受體結(jié)合后胰島素信號(hào)向細(xì)胞內(nèi)傳導(dǎo)，激活一系列細(xì)胞內(nèi)下游的級(jí)聯(lián)過(guò)程和網(wǎng)絡(luò)途徑。 目前，胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的改變是研究的焦點(diǎn)，1995年，Harbeek等通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)方法證明了在胰島細(xì)胞上有胰島素受體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，其主要通路為PI3K信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑和鈣通道及其相關(guān)途徑3。在胰

13、島細(xì)胞上分布的主要是IRS1和IRS2，IRS1在整個(gè)胰島上廣泛分布，IRS2則主要分布在胰島的外周，二者有不同的生理作用。IRS1通過(guò)PI3K和鈣通道及其相關(guān)途徑控制胰島素的分泌；IRS2則至少可以通過(guò)PI3K和絲裂原活化蛋白激酶（Mitogen activator protein kinase，MAPK）兩條通路調(diào)控細(xì)胞的生長(zhǎng)、存活和有絲分裂3。PI3K是一種脂質(zhì)激酶，在介導(dǎo)胰島素的代謝效應(yīng)中起關(guān)鍵性作用。 外源性胰島素和（或）葡萄糖刺激生產(chǎn)的胰島素與胰島細(xì)胞膜上的胰島素受體結(jié)合后，激活受體的內(nèi)源性酪氨酸激酶活性，導(dǎo)致自身磷酸化和IRS的酪氨酸磷酸化?；罨腎RS遷移到細(xì)胞膜，磷酸酪氨酸結(jié)

14、合域?qū)⒘姿崂野彼徨^定在IRS酪氨酸激酶上。其后，酪氨酸磷酸化的IRS通過(guò)其SH2結(jié)構(gòu)域招募到PI3K的85 ku的調(diào)節(jié)亞單位（P85）。P85與磷酸肌醇3磷酸結(jié)合，將磷脂酰肌醇-磷酸轉(zhuǎn)化為磷磷酰肌醇二磷酸和磷脂酰肌醇三磷酸，這些產(chǎn)物是胰島素和其他生長(zhǎng)因子的第二信使，成為下游信號(hào)分子的錨定位點(diǎn)。其下游的信號(hào)分子為磷酸肌醇依賴的蛋白激酶1和（或）蛋白激酶C的某一亞型。磷酸肌醇依賴的蛋白激酶1接著激活蛋白激酶B（也稱為Akt）和某一非典型蛋白激酶C亞型?；罨牡鞍准っ窧通過(guò)絲/蘇氨酸磷酸化使糖原合成激酶3失活，同時(shí)激活另一個(gè)蛋白激酶哺乳動(dòng)物的雷帕霉素靶點(diǎn)，導(dǎo)致下游的70 kuS6激酶（p70S6K）

15、磷酸化而激活4。而哺乳動(dòng)物的雷帕霉素靶點(diǎn)激酶也可以作為“ATP感受器”激活p70S6K而不需要通過(guò)Ca2+/cAMP，從而控制蛋白的合成，加強(qiáng)基因的轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)細(xì)胞肥大，并產(chǎn)生其他生物效應(yīng)5。蛋白激酶B也可以直接使某些轉(zhuǎn)錄因子絲/蘇氨酸磷酸化，導(dǎo)致細(xì)胞有絲分裂。IRS1主要通過(guò)此途徑發(fā)揮作用。而IRS2可通過(guò)上述途徑控制機(jī)體蛋白的合成和細(xì)胞的肥大。 此外，其還可以激活Ras途徑。Ras可沿兩條通路被激活：（1）活化的胰島素受體激活I(lǐng)RS2蛋白，后者將信號(hào)傳至適配蛋白生長(zhǎng)因子受體結(jié)合蛋白2，它再與信號(hào)蛋白GDP/GTP交換因子相互作用，將失活的RasGDP轉(zhuǎn)變成活化的RasGTP，進(jìn)而激活Ras；

16、（2）胰島素受體不經(jīng)過(guò)IRS2蛋白，直接使信號(hào)蛋白Shc的酪氨酸磷酸化，Shc再與適配蛋白生長(zhǎng)因子受體結(jié)合蛋白2相結(jié)合，經(jīng)信號(hào)蛋白GDP/GTP交換因子激活Ras。激活的RasGTP募集Raf絲氨酸激酶，依次使MAPK激酶（MAPKK，也稱MEK）、MAPK（細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1和亞型）磷酸化。激活的MAPK繼而激活其他蛋白激酶，如p90核糖體亞單位（p90RSK），產(chǎn)生一系列生理效應(yīng)，如誘導(dǎo)基因轉(zhuǎn)錄、參與調(diào)控細(xì)胞凋亡等。 本研究發(fā)現(xiàn)，低蛋白飲食致宮內(nèi)發(fā)育遲緩大鼠在生后0，3，8周胰腺組織中IRS2蛋白的表達(dá)水平均顯著低于正常對(duì)照組大鼠胰腺組織中IRS2蛋白的表達(dá)水平，產(chǎn)生胰島素抵抗，從而促進(jìn)

17、了糖尿病的發(fā)生。 綜上所述,宮內(nèi)發(fā)育遲緩導(dǎo)致子代自生命早期胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路障礙，這種病理生理改變持久存在,構(gòu)成IUGR個(gè)體胰島素抵抗的分子基礎(chǔ)。(本文圖16見(jiàn)封三)【參考文獻(xiàn)】 1 Godfrey KM,Barker DJ.Fetal nutrition and adult diseaseJ.Am J Clin Nutr，2000，71(5 Suppl):1344S1352S.2 Kume S.The molecular basis and prospects in pancreatic developmentJ.Dev Growth Differ，2005，47(6):367374.3 Pende M,Kozma SC,Jaquet M,et al.Hypoinsulinaemia,glucose intolerance and diminished betacell size in S6K1deficient miceJ.Nature，2000，408(6815):994997.4 Ohsugi M,CrasMéneur C,Zhou Y,et al.Glucose and insulin trea